使用亲和性树脂合成adc的方法
【专利说明】使用亲和性树脂合成ADC的方法
[0001] 本发明涉及合成生物分子-药物-缀合物的固相方法。尤其，本发明涉及合成抗体-药物-缀合物(ADC)的固相方法。本发明也涉及产生固定的、化学改性的生物分子例如抗体 的中间方法。
[0002] 除了上述方法，本发明涉及本发明方法的捕获树脂、生物分子-药物-缀合物、中间 体产物和组合物的各种用途。
[0003] 发明背景
[0004] 免疫毒素和抗体药物缀合物(ADC)是使靶-特异性结合结构域与可被归类为细胞 毒素的足够强有力的毒性的药物分子结合的蛋白质药物。抗体是用于该目的的产生下述靶 向系统的理想生物分子，所述靶向系统结合了高特异性与高抗原亲和性，允许将细胞毒素 药物运输至期望的施用位点。这些药物构建体是针对发现在肿瘤学中尤其流行的疾病的潜 在治疗剂。
[0005] 抗体药物缀合物(ADC)的主要标准是毒素'弹头'（药物)在极低水平(picoM)下具 有活性。此外，无论周期中的点，而针对肿瘤细胞具有效力是有利的。就该目的而言，已经发 现DNA活性试剂利于作为毒素候选物，因为DNA损伤，除非可修复的，将驱动细胞凋亡，而无 论周期中的点。
[0006] 原则上，ADC的适当毒素可以是定义为L01ATC分子的任何部分（'解剖学治疗学化 学分类系统(Anatomical Therapeutic Chemical Classification System) '，其中L01 是 定义抗肿瘤和免疫调节试剂的亚组，其由WHO药物统计方法合作中心定义。可选地，可归类 为用于ADC的适当有效负载的其他部分可简单地定义为当内化时对细胞有毒性的任何部 分。落在后者目录中的大多数部分缺少足够的有效效力。因此，工业趋势是鉴定和开发'超 效力'材料。
[0007] 对于免疫毒素和ADC研究的基本原理、设计和效力的专家综述可见：J. Adair等， Expert 0pin.Biol.Ther.，2012，12(9):P1191-206，G.Casi等，Journal of Controlled Release，2012，161，2，P422-428和F?Dosio等，Toxins，2011，3，P848-883 〇
[0008] 许多溶液相方法可用于制造生物分子-药物-缀合物，例如抗体-药物-缀合物 (ADC)。但是，溶液相方法它们本身就产生大量的废物而言是浪费的，并且就合成期间生物 分子-药物-缀合物的聚集而言是有问题的。
[0009] 用于制造生物分子-药物-缀合物的溶液相方法中的第一步骤大体上涉及生物分 子的化学改性或活化。例如，在生物分子是抗体的情况下，可通过使抗体还原或部分还原， 将抗体'化学改性'或'活化'。部分还原抗体的适当方法见"Bioconjugate Techniques"， 96/97页，Greg T .Hermanson，Academic Press;第2版，2008，ISBN-13:978-0123705013。还 原方法中一般采用还原剂，比如TCEP。
[0010] 在抗体的化学改性或活化，例如还原之后，下一步骤是去除任何过多的活化/化学 改性试剂，例如过多的还原剂。该步骤非常耗费时间，因为其有时必须使样品在分开的分离 柱中运行多次。如果生物分子的稳定性有问题，从降解方面而言这也可能是有问题的。如果 方法涉及用大量过量的还原剂充分还原ThiomAb，化学改性/活化的生物分子的纯化的问题 是尤其有问题的。
[0011] 在上面的纯化步骤之后，然后化学改性的/活化的例如还原的抗体与药物部分缀 合。该步骤的主要问题是生物分子-药物-缀合物高可能性的聚集。当在该过程中采用非常 疏水的药物时，这尤其有问题。聚集是主要问题，因为其可导致不稳定的生物分子-药物-缀 合物。在最佳情形下，被生物分子-药物-缀合物聚集物污染的生物分子-药物-缀合物必须 被进一步纯化，以去除聚集物，其即耗费时间又非常浪费。在纯化期间将失去大部分的药 物，因为其形成聚集的生物分子-药物-缀合物的一部分。在最差的情形下，整批生物分子-药物-缀合物被生物分子-药物-缀合物聚集物污染至整体是不稳定的并且必须被处理的这 样高的程度。
[0012] 几乎三十年，肿瘤学家已经致力于利用靶-特异性单克隆抗体将细胞毒素药物递 送至肿瘤位点，只要单克隆抗体存在。直到现在，三类毒素占据了该领域。即，刺孢霉素 (0已1；[。116&111；[。；[118)、美登素(1]1&5^&118；[116 8)和阿里他汀（&111'18丨&1：；[118)。这些细胞毒素药物 类型本质上都通常是疏水的。当缀合至抗体时，它们的存在明显增加了抗体的总体疏水性， 并且在一些情况下，某种程度上，在缀合物之间的疏水相互作用导致缀合物聚集。基于用于 麦罗塔(Mylotarg)和CMC-544二者的方法都包含色谱法聚集体去除步骤的认识，该问题的 显著性顺序是刺孢霉素〉美登素〉阿里他汀。约50%的美登素方法包含聚集体去除步骤和非 常少的阿里他汀方法包含聚集体去除步骤。
[0013] 最近，基于多米卡新（duocarmycins) (www. syntarga. com)和吡略并苯二氮杂 (pyrollebenzodiazepene) (PBD)二聚体(www. spirogen ? com)的毒素已经缀合至抗体并且 进行临床前评估。这些新类型的毒素甚至比它们的前驱物细胞毒素药物类型更疏水并且当 缀合至抗体时，更容易聚集。
[0014] 重大的努力已经聚焦在通过并入亲水性连接体调节药物的疏水性（Zhao等， J. Med. Chem.，2011，54，10，3606-3623)。在聚集体形成不能被控制的情况下，开发人员已经 依靠熟知的技术，用于从蛋白质型治疗剂中去除聚集体。这些包括一系列不同的色谱分离， 包括离子交换、疏水相互作用、羟基磷灰石和本领域技术人员熟知的其他分离。采用这样的 色谱纯化技术具有实现足够产物质量的结果，但是以工艺产率为代价。当与抗体和抗体型 治疗剂在制造的背景下一起使用时，通过不明确的伴随副反应或不想要的物理化学相互作 用，材料的物理损失具有非常严重的经济影响。
[0015] 因此，制造生物分子-药物-缀合物的常规的溶液相方法具有许多困难，并且期望 提供用于制造生物分子-药物-缀合物的改进方法。
[0016 ]本发明解决了常规的溶液相方法的一个或多个上述问题。
【发明内容】
[0017] 合成生物分子-药物-缀合物的方法:
[0018] 根据本发明，提供了合成生物分子-药物-缀合物的方法，该方法包括：
[0019] (i)使生物分子在适于固定生物分子的情况下接触捕获树脂并且因而提供固定的 生物分子;其中生物分子是抗体、改性的抗体或抗体片段;和其中捕获树脂包括选自下述的 生物分子捕获部分：（1)非肽型的，包括氨基酸型的，蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物， (2)肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，（3)核苷酸结合位点捕获部分和(4)糖蛋白 捕获部分；
[0020] (ii)任选地使固定的生物分子接触化学改性试剂或活化试剂，以提供化学改性的 或活化的固定的生物分子；
[0021] (iii)使固定的生物分子或化学改性的或活化的固定生物分子接触药物组分，以 形成固定的生物分子-药物-缀合物；
[0022] (iv)从捕获树脂释放生物分子-药物-缀合物。
[0023] 本发明上述方法的关键特征是在该方法中采用的捕获树脂能够以连续和可再生 方式固定生物分子。生物分子连续固定至捕获树脂应使得通过上述方法产生的所得生物分 子-药物-缀合物减少变化。例如，可减少在药物组分连接至固定的生物分子的点的变化，因 此产生药物组分和固定的生物分子之间更一致的连接点。这样的区域特异性的改善从改善 所得生物分子-药物-缀合物产物的一致性而言应是期望的。
[0024] 与采用母蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L作为生物分子捕获部分相对，采用非肽型的 蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物或肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物（即上述方 法第一步骤中的（1)或（2))作为生物分子捕获部分，可使得相对改善生物分子的固定的一 致性，原因是相对于常规的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L型系统增加了模拟物的区域特异 性。在其中生物分子固定至蛋白质的区域特异性低的情况下，采用母蛋白质A、蛋白质G或蛋 白质L作为生物分子捕获部分将固有地使得生物分子可变地固定至捕获树脂。例如，母蛋白 质A、蛋白质G或蛋白质L可经可使总体相互作用复杂的蛋白质上的其他位点展示非特异性 结合。如上面阐释，如在本发明中设想的，生物分子与捕获树脂的连续性固定可接着使得减 少通过上述方法产生的所得生物分子-药物-缀合物的变化。这将是有利的。本发明的树脂 系统的另一优势在于下述事实：相比常规的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L型系统的情况，更 宽范围的药物可原则上缀合至树脂。例如，在疏水性分子的情况下，可出现在母蛋白质A、蛋 白质G或蛋白质L型系统中的其他非特异性结合可扰乱或防止这样的药物的有效缀合。
[0025] 类似的益处存在于采用核苷酸结合位点捕获部分或糖蛋白捕获部分（即上述方法 的第一步骤中的(3)或(4))作为生物分子捕获部分。
[0026]在一种实施方式中，捕获树脂是非蛋白质捕获树脂。在一种实施方式中，捕获树脂 的生物分子捕获部分的分子量为约l〇〇〇Da或更小，任选地约500Da或更小、约300Da或更小 或约200Da或更小。在一种实施方式中，捕获树脂是非蛋白质捕获树脂和捕获树脂的生物分 子捕获部分的分子量为约l〇〇〇Da或更小。
[0027] 与采用母蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L作为生物分子捕获部分相对，采用非肽型的 蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物或肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L作为生物分子捕 获部分的另一益处是模拟物生物分子捕获部分与宽范围的常用抗体缀合化学物质相容并 且可扩大至工业水平。这与蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L型生物分子捕获部分相反。
[0028] 例如，通常期望将赖酰胺侧链官能团靶向在固定的抗体上。在目前临床开发的28 种抗体药物缀合物中，几乎一半（下表中灰色阴影的那些)采用赖氨酸引导的缀合化学。蛋 白质A、G或L的表面上固定配体的蛋白质本性使得无意中将赖酰胺侧链官能团革巴向在蛋白 质捕获树脂上。蛋白质A(swiss-prot P02976)具有59个赖氨酸残基，蛋白质G(swiss-prot P919909)具有59个赖氨酸残基和蛋白质L(swiss-prot Q51918)具有132个赖氨酸残基。
[0032]除了如上所述的配体和抗体赖酰胺残基之间的竞争，蛋白质A、G和L型捕获树脂也 存在其他问题。这些包括蛋白质的沥滤和沥滤的加合物的免疫原性。这意味着这些亲和性 载体不能用于制造过程的目的（用于纯化或缀合）。由采用蛋白质A，G和L型捕获树脂的这样 的过程提供的任何缀合物材料不符合目前抗体纯化和产物质量的规范指南。
[0033] 合成化学改性的活化、固定的生物分子的方法:
[0034] 根据本发明，提供了合成化学改性的或活化的固定的生物分子的方法，该方法包 括：
[0035] (i)使生物分子在适于固定生物分子的情况下与捕获树脂接触，并且因而提供固 定的生物分子;其中生物分子是抗体、改性的抗体或抗体片段;和其中捕获树脂包括选自下 述的生物分子捕获部分：（1)非肽型的，包括氨基酸型的，蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟 物，（2)肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，（3)核苷酸结合位点捕获部分和(4)糖蛋 白捕获部分;和
[0036] 使固定的生物分子与化学改性试剂或活化试剂接触，以提供化学改性的或活化的 固定的生物分子。
[0037] 蛋白质和更具体的抗体的缀合通常用于研究、诊断和治疗。Biocon jugate Techniques，第二版(Greg T Hermanson)提供了有关形成标记的或缀合分子的化学、试剂 系统和实际应用的非常详细的信息。也详细描述了许多反应，其有关数百种商业上可得的 试剂和这些试剂用于改性或交联肽和蛋白质、糖和多糖、核酸和寡核苷酸、脂质和合成聚合 物的用途。下面提供了应用于抗体的关键缀合化学物质的简述。
[0038] 在还原天然链间二硫键之后缀合至游离硫巯基是抗体缀合的常用方法和商业ADC ADCetris?:采用的化学反应。方法包括使抗体接触还原剂，比如T CEP、D T T、巯基乙胺 (merceptoethylamine)或本领域熟知的其他适当的还原剂;然后，与药物、配体、式D-X的标 记物缀合，其中D是药物、配体或标记物和X是活性基团，其选自马来酰亚胺、卤代烷、吡啶基 二硫化物和本领域已知的其他硫巯基活性化学物质。
[0039]硫巯基缀合抗体的替代方法是改造在抗体中特定位点的活性半胱氨酸残基，以使 得药物以限定的化学计量被缀合，而不破坏链间二硫键。改造的半胱氨酸通常作为半胱氨 酸或谷胱甘肽的混合二硫化物存在。通过完全还原随后渗滤(虹8；^11^31：；[011)而去除加合 物。这破坏了链间二硫化物，其必须通过用空气、CUS04或脱氢抗坏血酸氧化来改造。
[0040]用于缀合的另一常见位点是赖氨酸残基的侧链上存在的氨基基团。最简单的方法 包括使抗体接触药物、配体、式D-Y的标记物或连接体。D具有如上的相同定义并且Y是活性 基团，其选自异氰酸酯、NHS酯、磺酰氯、环氧化物和本领域技术人员已知的其他试剂。
[0041 ]也通常采用间接缀合至赖氨酸。首先用杂双官能连接体活化赖氨酸侧链的氨基基 团，然后这与包含良好活性化学性质的药物缀合。这样的偶联体的例子包括用2-亚氨基硫 烷改性赖氨酸，以产生新的硫巯基，随后与任何上述的硫巯基活性药物-连接体(D-X)缀合。 另一偶联体是用SMCC改性赖氨酸，以产生结合马来酰亚胺的赖氨酸，随后与包含游离硫巯 基的药物缀合。对于用于间接赖氨酸缀合的有潜力的偶联体的完整综述见Hermanson和 Perbio交联剂目录。
[0042]数个小组已经开发了以化学上与蛋白质中20种成蛋白性氨基酸侧链正交的侧链 并入非天然氨基酸的方法。
[0043] Redwood Bioscience(www.redwoodbioscience.com)已经开发了他们称为酸标记 (Aldehyde Tagging)的技术。在该技术中，他们采用称为甲酰甘氨酸酶(FGE)的天然酶，其 通常将高度保守的13氨基酸序列中的Cys残基转化成