，以保持工艺流的离子强度。可 将离子和非离子洗涤剂比如Tween(聚山梨醇酯)添加至缓冲液，以有利提高差可溶性生物 分子在缓冲液媒介中的溶解度并且使聚集最小化。
[0104] 包括捕获树脂和活化试剂的混合物:
[0105] 根据本发明提供了包括下述的混合物：
[0106] (i)捕获树脂，其包括选自下述的抗体、改性的抗体或抗体片段捕获部分：（1)非肽 型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，（2)肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物， (3)核苷酸结合位点捕获部分和(4)糖蛋白捕获部分;和
[0107] (i i)化学改性试剂或活化试剂。
[0108] 在一种实施方式中，捕获树脂包括在其表面上的固定的抗体、改性的抗体或抗体 片段。
[0109] 捕获树脂在合成生物分子-药物-缀合物中的用途:
[0110] 根据本发明提供了包括选自下述的抗体、改性的抗体或抗体片段捕获部分的捕获 树脂在合成生物分子-药物-缀合物中的用途：（1)非肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质Mi 拟物，（2)肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，（3)核苷酸结合位点捕获部分和(4)糖 蛋白捕获部分。
[0川]捕获树脂:
[0112]许多年，研究人员已经尝试开发对许多全长抗体、片段或融合体具有亲和性的配 体作为对传统蛋白质A、G或L亲和性纯化载体的替换。成功的配体发现/开发的主要标准已 经是：
[0113] 1.对抗体尚选择性，以提供尚的初始纯化
[0114] 2.有用的动态结合能力
[0115] 3.与保持抗体完整性相容的洗脱条件
[0116] 4.多个洗脱/净化循环期间载体的稳定性
[0117] 5.相对于蛋白质A、G或L载体降低成本
[0118] 在使用用于固相抗体缀合的这些配体的背景下，上面的标准1不是关键的，因为缀 合过程开始于纯化的抗体。但是，配体必需完全符合剩下的4个标准。另外，配体必需理想地 具有与为缀合提供适当的亲和性结合强度的抗体相互作用的限定的位点。该性质是必要 的，从而抗体可结合载体并且随着时间的推移不在缓冲液补充期间不经意地被洗脱。另外， 期望限定的相互作用的位点，以推出与周围的溶液相一致的结合抗体复合物的构象呈现， 作用是提供用于一致的和可再生的缀合化学性质的方式。抗体是良好表征的生物分子，其 具有许多良好限定的为亲和性纯化开发的结合结构域。
[0119]第一限定的区域(一个或多个)是蛋白质A和蛋白质G结合袋(binding pocket)，其 用于使用蛋白质A/G和蛋白质A/G载体的模拟物的亲和色谱法。蛋白质A与Fc区域中的 CH2CH3链间结构域经与下述氨基酸残基的许多非共价相互作用而进行相互作用:Thr 250、 Leu251、Met 252、Ile 253、His 310、Gln 311、Leu 314、Asn 315、Lys 338、Glu 345、Ala 431、Leu 432、His 433、Asn 434和His 435。蛋白质A模拟物载体已经合理地设计为与该结 构域经一个或多个上面限定的氨基酸相互作用。这些模拟物载体为IgG结合和缀合提供适 当的亲和性配体。蛋白质A模拟物载体可在亚类中限定为并入非肽型、肽型或氨基酸型配 体。类似地，蛋白质G与Fc区域中的CH2CH3链间结构域经与下述氨基酸残基的许多非共价相 互作用而进行相互作用：Ile 253、Ser 254、Gln 311、Glu 380、Glu 382、His 433、Asn 434 和His 435。蛋白质G模拟物载体已经合理设计为经一个或多个上述氨基酸与该结构域相互 作用。这些模拟物载体再次为IgG结合和缀合提供适当的亲和性配体。蛋白质G模拟物载体 可在亚类中限定为并入非肽型、肽型或氨基酸型配体。在一种实施方式中，捕获树脂能够结 合生物分子上的蛋白质A或蛋白质G结合袋。
[0120] 第二限定区域是蛋白质L亲和性基质靶向的抗体轻链。蛋白质L特异性结合kI、II 和IV轻链，但是不结合Kill也不结合Y轻链。已经描绘了蛋白质L与抗体之间的相互作用， 并且注意到氢键和盐桥对于结合是重要的。蛋白质L结构域的总共11种亲水性氨基酸残 基--即 Ala、Asp、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Phe、Thr、Tyr--对于这些结合的形成是重 要的。使用与上面公开的11种氨基酸结构上类似的化合物，通过产生三嗪支架组合文库已 经开发了蛋白质L模拟物亲和性载体(WO 2004/035199A)。在W02004/035199A的公开中，蛋 白质L模拟物定义为具有蛋白质L对抗体或片段50 %亲和性并且对轻链特异性的配体，如通 过Fab片段的结合所证实的。本文公开的或本领域技术人员已知的任何适当的支架可代替 三嗪支架，只要保持对轻链的亲和性和特异性特征。这样的树脂用于固定抗体和包含kI、II 和IV轻链的片段。蛋白质L模拟物的一种商用实施方式是Fabsorbent? F1P HF(ProMetic Biosciences)。该亲和性载体符合蛋白质L模拟物的标准，但是也结合包含y轻链的抗体和 片段。所以，该亲和性载体普遍应用于抗体亲和性结合和缀合。在一种实施方式中，捕获树 脂能够结合抗体轻链，如通过蛋白质L亲和性基质所靶向。
[0121] 第三限定的区域是跨宽范围的种类的所有抗体同种型的Fab臂中保守的核苷酸结 构域。结合位点包括4个氨基酸残基，第一个是Tyr或Phe和剩余的三个是Tyr、Tyr和Trp。尽 管结合袋位置和氨基酸侧链定向在晶体结构叠加中是保守的，但是不同抗体之间的总体骨 架序列变化和编码方案存在稍微不同。这在下面通过比较商业抗体赫赛汀(Herceptin)和 利妥昔单抗(Rituximab)的保守的核苷酸结合位点来表明。已经合理设计为经一个或多个 上述氨基酸与该结构域相互作用的核苷酸模拟物(非肽、肽、核苷酸类似物和氨基酸)是用 于IgG结合和缀合的合适的亲和性配体。
[0123] 在一种实施方式中，捕获树脂能够结合抗体的Fab臂中保守的核苷酸结构域。
[0124] 第四限定的区域是完整抗体的Fc区域的CH2结构域中Asn 297上存在的聚糖结构。 用作亲和性配体的m-氨基苯基硼酸结合糖残基，比如甘露糖、半乳糖或葡萄糖上的顺二醇 基团，使得与糖蛋白分子的糖类部分一起存在。可逆的五元环复合物供应自该相互作用。下 面显示典型的抗体聚糖结构，以强调抗体聚糖中甘露糖和半乳糖的存在(改编自Arnold等， Advances in Experimental Medicine and 13;[01087,2005,564,27-43)。在一种实施方式 中，捕获树脂能够结合完整抗体的Fc区域的CH2结构域中Asn 297上存在的聚糖结构。
[0126] 图2
[0127] 聚糖结构和异构体。a)聚糖的一般命名法b) IgG的主要聚糖结构。
[0128] G =半乳糖单元，F =海藻糖单元。Arnold等之后的改性。
[0129] 配体可连接至亲和色谱法领域熟知的许多固体载体基质。这些包括例如合成聚合 物，比如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或聚苯乙烯，尤其是交联的合成聚合物;无机载体，比如二氧 化硅型载体和尤其是多糖载体比如淀粉、纤维素和琼脂糖。
[0130] 下面描述适于抗体结合的具体配体载体：
[0131 ] '非肽'蛋白质A、G和L模拟物亲和性载体
[0132]结合合成化学文库筛选的蛋白质A、G或L相互作用的分子模拟已经能够半合理设 计这些蛋白质的小分子模拟物(Li等，Nature Biotechnology，1998,16,190-195)。这样的 树脂的例子包括商业上可得的载体mAbsorbent A1P和FAbsorbent F1P HF(ProMetic Biosciences)〇
[0133] mAbsorbent A1P和FAbsorbent F1P HF载体在三嗪支架上使用多组分Ugi反应形 j^(www.prometicbioscience.com)〇
[0134] US20010045384公开了在亚氨基二醋酸酯（IDA)型支架上组装的蛋白质A模拟物配 体-复合物。IDA支架用三唑基(triazyl)配体衍生化，以提供多价三唑基配体-复合物。
[0135] W09808603描述了使用亲和性树脂将免疫球蛋白从细胞培养上清液、血清、血浆或 初乳的分离。这些亲和性树脂由合成的单或双环-芳族或杂芳族配体组成，以利于免疫球蛋 白纯化。
[0136]有希望作为抗体亲和性树脂的另一配体是磺胺甲啼啶（sulfamethazine)。与磺胺 甲啼啶偶联的葡聚糖微粒特异性结合抗体(Yi等，Prep.Biocheml Biotechnol .，2012，42， 6,598-610)〇
[0137]在上述选择主要候选配体时，基于缺少抗体特异性排除了许多配体。本文公开的 是特异性不如对固相抗体缀合树脂的结合效率、能力和稳定性重要并且同样不忽视这些。 [0138] '肽'蛋白质A、G或L模拟物亲和性载体
[0139] 已经公开了许多蛋白质A模拟肽。Menegatti鉴定了具有序列HWRGWV的六肽，其结 合抗体Fc区域（Menegatti等，Journal of Separation Science，2012,35,22,3139_3148)。 Fassina等通过合成和筛选由具有四齿状(tetradendate)赖氨酸核心的随机化的合成分子 组成的合成多聚体肽文库已经鉴定了蛋白质A模拟肽TG191318(Fassina等， J.Mol.Recognit.，1996,9,564)。￡卩1997826公开了包括父1-厶邙-!1^-了71的肽儿1111(1等公开 了适于抗体亲和色谱法的两个肽配体（Lund等，J Chromatogr.A，2012，1225，158-167)。 0八八6和0!^46包含1-精氨酸、1-甘氨酸和合成芳族酸2,6-二叔丁基-4-羟苄基丙烯酸酯 (DBHBA)
[0140] 氨基酸蛋白质A、G或L模拟物亲和性载体
[0141] 除了上述复合大分子配体，简单的氨基酸已经提出作为以相同方式结合抗体的蛋 白质A模拟物(Naik等，J.Chromatogr.A，2011，1218,1756-1766)。这样的例子是AbSep，包含 色氨酸的聚甲基丙烯酸酯树脂，其具有对抗体的Fc区域中蛋白质结合位点的高亲和性。包 含氨基酸酪氨酸、组氨酸和苯丙氨酸的树脂也适于抗体固定和缀合（Bueno等， J.Chromatogr.B，Biomed.Appl?，1995;667,1,57-67)〇
[0142] 核苷酸结合位点亲和性载体
[0143] 开发抗体纯化配体的另一策略已经利用较不熟知的抗体Fab可变区中保守的核苷 酸结合位点（NBS)(Alves等，Anal.Chem.，2012,84,7721-7728)。核苷酸类似物吲哚丁酸已 经偶联至ToyoPearl AF-650-氨基M树脂，以制备符合上面标准1-5的载体。W0/2012/099949 中描述了许多用于抗体亲和色谱法的其他核苷酸类似物。
[0144] 碳水化合物结合树脂
[0145]固定在各种载体上的配体m-氨基苯基硼酸已经用于纯化糖蛋白。该配体结合包括 抗体的糖蛋白分子的糖类部分中存在的糖残基，比如甘露糖、半乳糖或葡萄糖上的顺式二 醇基团，形成可逆的五元环复合物。该复合物可通过降低pH，或通过使用包含Tris或山梨糖 醇的洗脱缓冲液解离。
[0146] 捕获树脂的配体能够通过配体和生物分子例如蛋白质、抗体、改性的抗体或抗体 片段之间的特异性、可逆的和非共价结合相互作用而与生物分子相互作用。非共价相互作 用可归类为离子的、范德华的、氢键的或疏水的。这些相互作用以3维方式起作用，以有助于 靶生物分子对捕获树脂的配体的灵活性和构象。当靠近配体时，生物分子可推出（infer) - 种、数种或所有的这些相互作用，以提供配体-生物分子复合物。配体和生物分子之间的距 离以及配体的极性和电负性决定这些相互作用的强度。此外，这些相互作用的强度可定义 为亲和力。配体和生物分子之间的高亲和力构成了增强稳定性的配体-生物分子复合物 (US2009/0240033)。
[0147] 在一种实施方式中，捕获树脂包括非肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物。 捕获树脂能够结合抗体、改性的抗体或抗体片段。
[0148]非肽型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物已经用于染料配体色谱法，其是使用 固定至固体载体比如琼脂糖，以纯化蛋白质的共价结合织物染料的亲和色谱法的模型。这 些染料与蛋白质对其具有亲和力的天然底物/蛋白质配体类似。纯化和分离的该模型通常 称为伪亲和色谱法(pseudo-affinity chromatography)。染料配体亲和色谱法是非特异性 的但是该技术有利于各种蛋白质的宽结合范围。纯化技术的进步采用改性的染料，以用作 蛋白质正常底物/配体的竞争抑制剂（P.Dean等，J. Chromatography，1979,165，3,301_ 319)。通常采用基于三嗪基的配体，比如汽巴蓝3GA(Cibacron Blue 3GA)、普施安红H-3B (Procion Red H-3B)、普施安蓝MX 3G(Procion Blue MX 3G)、普施安黄H-A(Procion Yellow H-A)等，并且解决了关于原始商业染料比如蓝色葡聚糖的纯度、渗漏和毒性的担忧 (Lowe等，Trends biotechnology，1992,10，442_448)。三嗪基配体已经成功用于白蛋白、氧 化还原酶、脱羧酶、糖解酶、核酸酶、水解酶(hydro loases )、裂解酶、合酶和转移酶的纯化 (N.Labrou，Methods Mol .Biol. 2002,147，129-139)。生物模拟物染料配体亲和色谱法的局 限是不同生物分子的亲和性强度显著不同并且在许多情况下，为一种蛋白质提供强亲和性 强度的配体可能不适用于另一蛋白质。因此，通常必须进行大量的和行之有效的筛选过程， 以鉴定对感兴趣的生物分子具有期望的亲和性的适当的合成配体。
[0149]因此，为了有助于结构化阐释实现亲和性结合生物分子的适当配体，已经将多价 支架基序并入配体结构，以提供构建体，该构建体可以向其引入配体的文库并且结合配体 的刚性空间分离从载体筛选。
[0150]在一种实施方式中，捕获树脂的配体的结构如根据W098/08603的公开内容叙述的 结构。W098/08603的捕获树脂包括合成的单或双环-芳族或杂芳族配体，以利