未结合的赫赛汀，和最后将树脂再悬浮在0.5ml PBS/EDTA中。
[0308]通过将三（2 -羧乙基）膦盐酸盐（tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)添加至2mM的终浓度并且然后在环境温度下孵育18小时使结合的赫赛汀 (Her)还原。用PBS/EDTA清洗树脂，以去除未反应的TCEP并且然后再悬浮在475yl PBS/EDTA 中。
[0309] 添加vcMMAE(vcE)、N-乙基马来酰亚胺(NEM)和二甲基乙酰胺(DMA)，以实现ImM马 来酰亚胺（总vcE和NEM)和5 % v/v DMA的终浓度。vcE与NEM的比例是改变的，100:0、75: 25、 50:50、25:75和0:100。通过在环境中孵育树脂悬液60分钟将还原的抗体缀合。用1^/^丁八/ 5%v/v DMA和0.1M甘氨酸pH 5.0顺序清洗树脂。
[031 0]用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱缀合物。将洗脱的缀合物收集至2 % v/v的1M三(羟甲基） 氨基乙烷(TRIS)，以使它们中和。
[0311] 然后通过尺寸排阻色谱法和反相色谱法(Polymer Labs，PLRP)色谱分析中和的缀 合物，以测定百分数聚集和平均药物负载。
[0312]结果总结在下面表1中：
[0314]甚至最高药物负载的缀合物的聚集体含量对于在抗原结合和细胞型试验中的进 一步评估都是可接受的。用PBS/ETDA/5%v/v DMA并且然后0.1M甘氨酸pH5.0进行顺序清洗 确保最终缀合物不含未反应的药物连接体、NEM和溶剂并且不损害生物测定数据的解释。利 用Fabsorbant? F1P HF树脂，该方法用于筛选鼠单克隆平板作为用于随后抗体药物缀合开 发的克隆选择的一部分，用于直接从包含完整抗体和Fab片段抗体二者的组织培养上清液 产生ADC。
[0315] 实施例2-分批模式的固相部分TCEP还原
[0316] 该实施例显示固定的抗体可通过部分还原链间二硫键随后与vcMMAE缀合而缀合 至限定的药物负载，并且相对于在溶液中制备的相同缀合物提高了产物质量。
[0317] 通过轻轻混合树脂淤浆和抗体溶液30分钟，将赫赛汀（0.5ml的2mg/ml PBS，pH 7.4)结合至10(^1(固定的树脂体积汗85中平衡的？&1^〇外 &1^*?1?册树脂。通过用?85清 洗树脂去除未结合的赫赛汀，2mM EDTA和树脂最终再悬浮在0.5ml PBS/EDTA中。
[0318] 通过添加三(2-羧乙基)膦盐酸盐至1比4摩尔TCEP每摩尔赫赛汀的比例并且然后 将悬液在环境温度下孵育2小时还原未结合的赫赛汀。
[0319] 添加vcMMAE和二甲基乙酰胺(DMA)，以实现2.5至10摩尔的￥〇1?^每摩尔赫赛汀和 5%v/v的DMA并且使得缀合在环境中进行30分钟。添加N-乙酰基半胱氨酸(NAC)，以淬火未 反应的vcMMAE并且使得反应20分钟，然后用PBS/EDTA/5%v/v DMA和0.1M甘氨酸pH5.0顺序 清洗树脂。
[0320]用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱缀合物。将洗脱的缀合物收集至2 % v/v的1M三(羟甲基） 氨基乙烷(TRIS)，以使它们中和。
[0321] 产生和分析具有vcMMAE和匹配的DAR的赫赛汀相当系列的溶液相缀合物，以提供 固相和溶液相缀合物质量的比较。
[0322] 然后通过疏水作用色谱法（图1)和尺寸排阻色谱法（图2)分析洗脱的缀合物，以测 定百分数聚集体和平均药物负载。
[0323] 结果总结在下面表2中：
[0325]数据显示，在固体载体上，TCEP与抗体比例和最终药物负载之间的关系是线性的。 另外，当与在溶液中制备的等量缀合物比较时，固相缀合物显示更低的百分数聚集。
[0326] 实施例3-柱上固相部分TCEP还原
[0327] 该实施例显示固定的抗体缀合可以卓越的再生性适合色谱流方法。
[0328] 通过以120(^/1^负载，将赫赛汀（51111的211^/1111?83 4117.4)结合至11111的 Fabsorbant? F1P HF树脂柱(之前在PBS中平衡）。通过用PBS、2mM EDTA平衡树脂，制备结合 的赫赛汀用于还原。
[0329] 微型蠕动栗用于产生小体积的PBS/EDTA再循环回路通过添加TCEP的柱(柱外部约 200此），以产生2TCEP每摩尔赫赛汀的摩尔比。这使得在环境下再循环120分钟，以使赫赛汀 还原。
[0330] 容器和柱的内容物被冲洗以进行破坏(waste)，并且用添加vcMMAE的PBS/EDTA/ 5%v/v DMA替换，以产生5vcMMAE每摩尔还原的赫赛汀的摩尔比。这使得在环境下再循环60 分钟，以缀合还原的赫赛汀。
[0331] 添加N-乙酰基半胱氨酸(NAC)，以淬火未反应的vcMMAE并且使得反应20分钟，然后 用PBS/EDTA/5 % v/v DMA和0 ? 1M甘氨酸pH5 ? 0顺序清洗树脂。
[0332] 用0.1M甘氨酸pH 3.0洗脱缀合物。将洗脱的缀合物收集至2%v/v的1M三(羟甲基） 氨基乙烷(TRIS)中，以使它们中和。
[0333] 在独立第二实验中使用第二个柱/操作器重复该过程。
[0334] 然后通过疏水作用色谱法（图3)和尺寸排阻色谱法（图4)分析洗脱的缀合物，以测 定百分数聚集物和平均药物负载。
[0335] 结果总结在下面表3中：
[0337]数据显示当适应色谱流模式时，vcMMAE与赫赛汀的缀合关于平均药物负载和聚集 产生是一致的。当TCEP与抗体比例匹配时，在批量模式和色谱模式中实现的DAR是相同的。 [0338] 实施例4-在批量模式中经赖氨酸侧链的SMCC活化用DM1的固相赫赛汀缀合。
[0339]该实施例显示固定的抗体可通过用SMCC修饰随后用DM1缀合而缀合在赖氨酸的侧 链上，并且相对于在溶液中制备的相同缀合物提高了产物质量。
[0340]通过轻轻混合树脂淤浆和抗体溶液30分钟，将赫赛汀（0.5ml的4mg/ml PBS， PH7.4)结合至100yl(固定树脂体积)在PBS中平衡的Fabsorbant? F1P HF树脂。通过用roS 随后用'改性缓冲液'（50mM NaPi、150mM NaCl、2mM EDTA pH6.7)清洗树脂去除未结合的赫 赛汀，并且最终树脂再悬浮在包含5 % v/v DMA的改性缓冲液中。
[0341 ] 通过添加4-(N_马来酰亚胺甲基)环己基-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC)至5至20摩 尔SMCC每摩尔赫赛汀的比例，并且然后在环境温度下孵育悬液4小时，使结合的赫赛汀改 性。通过用roS/5%v/v DMA随后用'缀合缓冲液'（35mM柠檬酸钠、150mM NaCl、2mM EDTA pH5.0)清洗树脂去除未反应的SMCC，并且最终将树脂再悬浮在包含3%v/v DMA的缀合缓冲 液中。
[0342]添加DM1以实现15摩尔的DM1每摩尔赫赛汀并且使得缀合在环境中进行18小时。然 后用PBS/EDTA/5 % v/v DMA和0 ? 1M甘氨酸pH5 ? 0顺序清洗树脂。
[0343]用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱缀合物。洗脱的缀合物收集至2%v/v的1M三(羟甲基)氨 基乙烷(TRIS)中，以使它们中和。
[0344]通过使赫赛汀与7.6摩尔的SMCC随后5摩尔的DM1每摩尔赫赛汀反应产生赫赛汀与 DM1与匹配DAR的等量溶液相缀合物，并且分析以提供固相和溶液相缀合物质量的比较。改 性和缀合反应期间赫赛汀的浓度分别是10和5mg/ml。
[0345]然后通过尺寸排阻色谱和UV分析洗脱的缀合物，以测定百分数聚集体和平均药物 负载。
[0346] 结果总结在下面表4中：
[0348]数据显示，在固体载体上，赖氨酸侧链缀合是可能的，并且SMCC与抗体比例和最终 药物负载之间的关系是线性的。
[0349]另外，当比较在溶液中制备的等量缀合物时，固相缀合物显示等量的百分数聚集， 但是在缀合反应期间四倍的蛋白质浓度增加。
【主权项】
1. 合成生物分子-药物-缀合物的方法，所述方法包括： (i) 使生物分子在适于固定所述生物分子的情况下与捕获树脂接触，从而提供固定的 生物分子，其中所述生物分子是抗体、改性的抗体或抗体片段;和其中所述捕获树脂包括选 自下述的生物分子捕获部分：（1)非肤型的，包括氨基酸型的，蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L 模拟物，（2)肤型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，（3)核巧酸结合位点捕获部分和(4) 糖蛋白捕获部分； (ii) 任选地使所述固定的生物分子接触化学改性试剂或活化试剂，W提供化学改性的 或活化的固定的生物分子； (iii) 使所述固定的生物分子或所述化学改性的或活化的固定的生物分子接触药物组 分，W形成固定的生物分子-药物-缀合物； (iv) 从所述捕获树脂释放所述生物分子-药物-缀合物。2. 权利要求1所述的方法，其中步骤(i)包括用所述捕获树脂解育所述生物分子。3. 权利要求2所述的方法，其中所述解育在约10°C至约40°C，任选地约15°C至约37°C的 溫度进行。4. 权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述解育进行约10分钟至约18小时的时 段。5. 权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述解育在缓冲液，任选地憐酸盐缓冲盐 水(PBS)中进行。6. 权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述解育在约5至约8的pH进行。7. 前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤（i)之后，清洗所述固定的生物分子， W去除还未固定在所述捕获树脂上的任何生物分子。8. 前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(i i)包括使所述生物分子还原。9. 权利要求8所述的方法，其中通过使所述生物分子接触还原剂，比如Ξ(2-簇乙基)麟 (TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)、琉基乙胺或其他适合适的还原剂，使所述生物分子还原。10. 权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤（ii)包括使所述生物分子与交联剂 部分反应，任选地其中所述交联剂部分是4-(N-马来酷亚胺甲基)环己烧-1-簇酸班巧酷亚 胺醋(SMCC)。11. 权利要求8至10中任一项所述的方法，步骤（ii)在缓冲液比如憐酸盐缓冲盐水 (PBS)中进行。12. 权利要求8至11中任一项所述的方法，其中步骤(ii)在约7至约8的pH进行。13. 权利要求8至12中任一项所述的方法，其中步骤(ii)在存在馨合剂比如抓TA的情况 下进行。14. 权利要求8至13中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括用还原剂解育所述生物分 子约6小时至约18小时的时段。15. 前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤(ii)之后，清洗所述活化的固定的生 物分子W去除任何改性试剂/活化试剂。16. 前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括在缓冲液中使所述化学改性 的或活化的固定的生物分子与药物组分接触。17. 前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括在约7至约8,优选地在约7.4 的pH使所述化学改性的或活化的固定的生物分子与药物组分接触。18. 前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(ii i)在存在馨合剂比如抓TA的情况下 进行。19. 前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括用药物组分解育所述化学改 性的或活化的固定的生物分子约6小时至约18小时的时段。20. 前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤（iii)之后，清洗所述固定的生物分 子-药物-缀合物W去除任何未反应的药物组分。21. 前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤（iv)包括改变pH，W破坏载体-生物分 子结合。22. 权利要求21所述的方法，其中所述pH下降至小于约pH 5,任选地约pH 3。23. 权利要求21或22所述的方法，其中在从所述捕获树脂释放所述缀合物的步骤之后 使洗脱的生物分子-药物-缀合物中和，任选地所述缀合物被捕获至2%v/v的謹立巧圣甲基） 氨基乙烧(TRIS)中。24. -种混合物，其包括： (i)捕获树脂，其包括抗体、改性的抗体或抗体片段捕获部分，所述捕获部分选自：（1) 非肤型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，（2)肤型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟 物，（3)核巧酸结合位点捕获部分和(4)糖蛋白捕获部分;和 (i i)化学改性试剂或活化试剂。25. 权利要求24所述的混合物，其中所述捕获树脂包括在其表面上固定的抗体、改性的 抗体或抗体片段。26. 包括抗体、改性的抗体或抗体片段捕获部分的捕获树脂在合成生物分子-药物-缀 合物中的用途，所述捕获部分选自：（1)非肤型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，（2)肤 型的蛋白质A、蛋白质G或蛋白质L模拟物，（3)核巧酸结合位点捕获部分和(4)糖蛋白捕获部 分。27. 前述权利要求任一项所述的方法、混合物或用途，其中所述捕获树脂是非蛋白质的 捕获树脂。28. 前述权利要求任一项所述的方法、混合物或用途，其中所述捕获树脂的生物分子捕 获部分具有约1000化或更小的分子量。29. 前述权利要求任一项所述的方法、混合物或用途，其中所述捕获树脂的配体具有下 述结构：30. 前述权利要求任一项所述的方法、混合物或用途，其中所述生物分子是抗体，任选 地其中所述抗体是单克隆抗体和/或其中所述抗体是曲妥珠单抗。31. 前述权利要求任一项所述的方法、混合物或用途，其中所述药物是微管蛋白抑制剂 或DNA相互作用试剂;任选地其中所述微管蛋白抑制剂选自：（a)阿里他汀；和(b)美登素衍 生物;任选地其中所述DNA相互作用试剂选自：（a)刺抱霉素、（b)多米卡新和(C)化咯并苯二 氮杂(P抓S)。
【专利摘要】本发明涉及固相合成生物分子-药物-缀合物的方法。尤其，本发明涉及合成抗体-药物-缀合物(ADC)的固相方法。本发明也涉及产生固定的化学改性的生物分子例如抗体的中间方法。本发明也涉及捕获树脂的各种用途，并且涉及本发明方法的生物分子-药物-缀合物、中间体产物和组合物。
【IPC分类】A61K47/48
【公开号】CN105579066
【申请号】CN201480035757
【发明人】D·J·埃文斯, C·M·麦基
【申请人】Adc生物技术公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年4月25日
【公告号】CA2910064A1, EP2988785A1, US20160067352, WO2014174316A1