I型硫酸酯酶中的甲酰甘氨酸(醛）(Wu 等，PNAS，2009，106，9，3001)。待缀合至这样改性抗体的药物、配体或标记物必须包含醛活 性化学物质，比如羟基胺或肼。醛活性功能的全部内容可见Hermanson和Perbio目录。
[0044] Ambryx已经开发了他们称为EuCode的技术（Liu等，Anu.Rev.Biochem.，2010,79， MShEuCode是借助其将细胞改造以通过在表达系统中包括三个非天然组分而并入异源蛋 白质中的非天然氨基酸的平台：
[0045] 1.补充至培养基的非天然氨基酸
[0046] 2 ?正交氨酰基-tRNA合酶(aaRS)
[0047] 3 ?正交 tRNA
[0048] 已经改造/选择正交aaRS/tRNA对，以促进在琥珀终止密码子通读并且在该位置并 入非天然氨基酸。使用该方法，多达70种nnAA已经并入蛋白质。下面的图阐释了正交氨基酸 侧链和活性化学物质可能的组合(改编自2012年2月Hanson Wade ADC峰会的Ambryx陈述）。 [0049] Sutro已经描述了使用开放的、无细胞合成(0CFS)技术生产抗体和细胞因子。0CFS 的特征是用可引导至特定密码子的负载tRNA在蛋白质中并入非天然氨基酸的能力，以将非 天然氨基酸递送至蛋白质上的特定位置-使得蛋白质易于特定的改性或赋予新期望的性质 (Goerke等，Biotechnol.Bioeng.，2008,99:351_367)〇
[0050] 固定的抗体缀合与所有的非天然氨基酸侧链相容并且以一个前提条件与活性化 学物质互补。抗体捕获配体必须不包含作为非天然氨基酸侧链的一部分并入的新的化学物 质。
[0051]
[0052] 用过碘酸钠氧化糖蛋白中的多糖残基提供了产生用于随后与包含胺或酰肼的分 子、药物、配体或标记物缀合的活性醛基的温和及有效的方式。该方法涉及首先使抗体接触 过碘酸钠并且然后与选自胺、酰肼、氨氧基或本领域已知的其他醛活性化学物质的活性基 团缀合。
[0053] 步骤(i):
[0054] 在一种实施方式中，使生物分子接触捕获树脂的步骤包括用捕获树脂孵育生物分 子。
[0055] 孵育可在约0至约100°C的温度，优选地在约5至约50°C的温度，任选地在约10至约 40°C的温度进行。理想地，孵育在约15至约37°C的温度进行，例如孵育在室温下，比如约21 °C进行。可选地，孵育在约37°C进行。
[0056] 孵育可进行约1分钟至约3天的时段，例如约10分钟至约18小时的时段。优选地，孵 育进行约20分钟至约1小时的时段。
[0057] 在一种实施方式中，孵育在水性媒介中进行。在可选的实施方式中，孵育在缓冲 液，比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或与期望的结合pH和化学物质相容的任何缓冲盐中进行，任 选地孵育在缓冲液比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行。在一种实施方式中，使用包括溶剂比 如DMS0或DMF的助溶剂进行孵育。助溶剂可存在的范围是0.5-80 % v/v，比如0.5-50 % v/v。 [0058] 在一种实施方式中，孵育在约5至约10,优选地约5至约8,更优选地约6至约8的pH 下进行。在优选的实施方式中，孵育在约6至约7.5的pH，理想地在约6.5的pH进行。在另一优 选的实施方式中，孵育在约7至约8的pH，理想地在约7.4的pH进行。这产生改善的抗体与衍 生载体的结合。
[0059]在一种实施方式中，清洗固定的生物分子（即固定在捕获树脂上的生物分子），以 去除还未固定在捕获树脂上的任何生物分子。固定的生物分子的清洗可通过受用新鲜的溶 剂冲洗作用。例如，固定的生物分子的清洗可受用缓冲液比如PBS的清洗作用。任选地，固定 的生物分子的清洗是在存在螯合剂，比如m)TA的情况下进行。可选地，固定的生物分子的清 洗可受用包括磷酸钠缓冲液、NaCl和螯合剂比如EDTA的'改性的缓冲液'的清洗作用。
[0060] 步骤(ii):
[0061] 在一种实施方式中，使固定的生物分子接触化学改性试剂或活化试剂，以提供改 性的或活化的固定的生物分子的步骤涉及使生物分子还原。在一种实施方式中，生物分子 的还原涉及完全还原。在一种实施方式中，生物分子的还原涉及部分还原。在一种实施方式 中，生物分子的还原涉及完全还原随后再氧化。
[0062]在一种实施方式中，通过使生物分子接触还原剂，比如三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二 硫苏糖醇(DTT)、巯基乙胺或其他适当的还原剂，使其还原。优选地，还原剂是三(2-羧乙基） 膦(TCEP)〇
[0063] 在一种实施方式中，通过使还原的生物分子接触氧化剂比如空气、CuS〇4或脱氢抗 坏血酸(DHAA)，使其再氧化。优选地，氧化剂是脱氢抗坏血酸(DHAA)。
[0064] 在一种实施方式中，使生物分子还原的过程在缓冲液比如磷酸盐缓冲盐水(PBS) 中进行。
[0065] 在一种实施方式中，使生物分子还原的过程在约5至约10,优选地约7至约8,优选 地约7.4的pH下进行。
[0066]在一种实施方式中，使生物分子还原的过程在存在螯合剂比如EDTA的情况下进 行。
[0067] 在一种实施方式中，使生物分子还原的过程涉及用还原剂孵育生物分子约20分钟 至约3天，任选地，约1小时至约2天和进一步任选地约6小时至约18小时的时段。
[0068] 在一种实施方式中，使固定的生物分子接触化学改性试剂或活化试剂以提供改性 的或活化的固定的生物分子的步骤涉及使生物分子与交联剂部分反应。例如，交联剂部分 可以是胺-硫氢基交联剂，例如具有NHS-酯和在相对端的马来酰亚胺活性基团的交联剂。使 生物分子改性或活化的该方法有效产生生物分子_连接体_药物-缀合物。适当的交联剂一 般能够与药物上的伯胺反应(经活性NHS酯端)并且也与生物分子上的半胱氨酸残基反应 (经活性马来酰亚胺端）。在该具体的例子中，马来酰亚胺端与固定的生物分子中的半胱氨 酸反应。这样的交联剂的例子是4-(N_马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯 (SMCC) 〇
[0069]在一种实施方式中，与交联剂反应的过程在缓冲液，比如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中 进行。可选地，与交联剂反应的过程在包括磷酸钠缓冲液、NaCl和螯合剂比如EDTA的'改性 缓冲液'中进行。
[0070] 在一种实施方式中，与交联剂反应的过程在约7至约9,优选地约7至约8,优选地约 8.0的pH下进行。
[0071] 在一种实施方式中，与交联剂反应的过程在存在螯合剂比如m)TA的情况下进行。
[0072] 在一种实施方式中，与交联剂反应的过程涉及用交联剂孵育生物分子约20分钟至 约3天，任选地，约1小时至约2天和进一步任选地约6小时至约18小时的时段。
[0073] 在一种实施方式中，使固定的生物分子接触化学改性试剂或活化试剂以提供改性 的或活化的固定的生物分子的步骤涉及使生物分子与Traut试剂反应。
[0074] 在一种实施方式中，与Traut试剂反应的过程在缓冲液，比如磷酸盐缓冲盐水 (PBS)中进行。
[0075] 在一种实施方式中，与Traut试剂反应的过程在约7至约9,优选地约7至约8,优选 地约8.0的pH下进行。
[0076]在一种实施方式中，与Traut试剂反应的过程在存在螯合剂，比如EDTA的情况下进 行。
[0077] 在一种实施方式中，与Traut试剂反应的过程涉及用还原剂孵育生物分子约20分 钟至约3天，任选地，约1小时至约2天和进一步任选地约6小时至约18小时的时段。
[0078]在一种实施方式中，清洗活化的固定生物分子以去除任何改性/活化试剂。在一种 实施方式中，清洗涉及用缓冲液冲洗，任选地其中缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其他适 当的缓冲液包括磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、Bi s-Tri s丙烷缓冲液、 HEPES缓冲液、醋酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、二甲胂酸缓冲液、乙酸铵缓冲液、咪唑缓冲 液、N-二羟乙基甘氨酸缓冲液和2-(N-吗啉代）乙磺酸(MES)缓冲液。例如，固定的生物分子 可用缓冲液，比如pH为约7至约8,优选地约7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。任选地，活化 的固定的生物分子的冲洗在存在螯合剂比如EDTA的情况下进行。冲洗活化的固定的生物分 子的另一例子涉及用缓冲液比如PBS，随后用包括柠檬酸钠、NaCl和螯合剂比如EDTA的'缀 合缓冲液'冲洗树脂。
[0079]步骤(iii):
[0080] 在一种实施方式中，使化学改性的或活化的固定生物分子接触药物组分以形成固 定的生物分子-药物-缀合物的步骤涉及使化学改性的或活化的固定生物分子在如之前结 合步骤(i i)描述的缓冲液中接触药物组分。
[0081] 在一种实施方式中，使化学改性的或活化的固定生物分子接触药物组分以形成固 定的生物分子-药物-缀合物的步骤涉及使化学改性的或活化的固定生物分子在约5至约8， 优选地约约7至约8和更优选地约7.4的pH下接触药物组分。
[0082] 在一种实施方式中，使化学改性的或活化的固定生物分子接触药物组分以形成固 定的生物分子-药物-缀合物的步骤在存在螯合剂比如H)TA的情况下进行。
[0083] 在一种实施方式中，使化学改性的或活化的固定生物分子接触药物组分以形成固 定的生物分子-药物-缀合物的步骤涉及用药物组分孵育化学改性的或活化的固定生物分 子约20分钟至约3天，任选地，约1小时至约2天和进一步任选地约6小时至约18小时的时段。
[0084] 在一种实施方式中，在从捕获树脂释放生物分子-药物-缀合物之前清洗固定的生 物分子_药物-缀合物。清洗去除任何未反应的药物组分。在一种实施方式中，清洗涉及用缓 冲液冲洗，任选地其中缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS )，和其他溶剂。其他适当的缓冲液包 括磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、Bi s-Tri s丙烷缓冲液、HEPES缓冲液、醋 酸钠缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、二甲胂酸缓冲液、乙酸铵缓冲液、咪唑缓冲液、N-二羟乙基甘 氨酸缓冲液和2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液。例如，固定的生物分子-药物-缀合物可用 缓冲液，比如pH为约5至约7的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和二甲基乙酰胺(DMA)清洗。任选地，固 定的生物分子-药物-缀合物的冲洗在存在螯合剂比如H)TA的情况下进行。
[0085] 步骤(iv):
[0086] 在一种实施方式中，从捕获树脂释放生物分子_药物-缀合物的步骤涉及：
[0087] a)将载体-生物分子化合物暴露于释放剂;和/或
[0088] b)改变pH，以破坏载体-生物分子结合。
[0089]在一种实施方式中，释放剂是氢键破坏剂(disrupter)，比如六氟异丙醇、2,2,2-三氟乙醇或二甲亚砜(DMS0)的助溶剂。
[0090] 在一种实施方式中，释放剂用载体-生物分子孵育。
[0091] 孵育可在约0至约100°C的温度，优选地在约5至约50°C的温度和任选地在约10至 约40°C的温度进行。理想地，孵育在约15至约37°C的温度进行，例如孵育在室温，比如约21 °C进行。可选地，孵育在约37°C进行。
[0092] 孵育可进行约1分钟至约3天的时段。优选地，孵育进行约30分钟至约2小时的时 段。
[0093] 孵育可在水性媒介中进行。可选地，孵育可在溶剂，比如DMF、DMS0、Me0H或MeCN中 进行。可选地，孵育可在具有多达80 %的溶剂，优选地0.5至50 %和最优选的0.5 %至10 % v/ v的溶剂的水性_溶剂混合物中。在某些情况下，一种或多种上述溶剂一一包括水一一的混 合物，可以是适当的。在必要的情况下，也可包括稳定剂，以确保缀合物保持完整。
[0094]在一种实施方式中，从捕获树脂释放生物分子-药物-缀合物的步骤涉及改变pH。 可使pH以足够破坏载体-生物分子结合但是不影响生物分子的活性、完整性或3D结构的任 何量改变。
[0095] 例如，可调节pH以使其是酸性的。在一种实施方式中，pH下降约pH2至约pH6。任选 地，调节pH至小于约pH 5，例如约pH3至约5，例如小于约pH 4。在一种实施方式中，pH下降至 约 pH 3。
[0096] 可选地，可调节pH，以使其是碱性的。在一种实施方式中，pH升高至约pH8至约 pHIO。任选地，调节pH大于pH 8。例如，pH可升高至约pH^pH可升高大于pH9。例如，pH可升高 至约pHHLpH可升高至大于pHIO,但是通常小于pH14。
[0097] 生物分子-药物-缀合物可用释放剂进行一次或多次处理。有利地，使用新鲜释放 剂的第二次或随后处理可使得增加从捕获树脂释放的生物分子_药物-缀合物的量。新鲜释 放剂是之前还未用固定的生物分子-药物-缀合物孵育的释放剂。
[0098] 在一种实施方式中，从捕获树脂释放生物分子-药物-缀合物的步骤涉及使生物分 子-药物-缀合物接触盐。例如，生物分子-药物-缀合物可能接触NaCl。盐的浓度的范围可以 是约0.1至约10M，优选地约0.1至约1M。
[0099] 在一种实施方式中，在从捕获树脂释放缀合物的步骤之后中和洗脱的生物分子-药物-缀合物。例如，缀合物可捕获至2%v/v的1M三(羟甲基)氨基乙烷(TRIS)。
[0100] 清洗步骤:
[0101] 在一种实施方式中，本发明的方法中清洗中间体的步骤包括去除未与捕获树脂结 合的物质，比如污染物。典型的污染物包括用于活化固定的生物分子的过量试剂、还未固定 在捕获树脂上的生物分子和未与活化的固定的生物分子反应的药物组分。不影响生物分子 的活性、完整性或3D结构或固定的生物分子和捕获树脂之间的结合完整性的任何媒介可用 于清洗中间体。
[0102] 优选地，缓冲液是等渗的并且通过模拟生理学pH和离子强度为生物分子比如抗体 产生稳定环境。在一种实施方式中，通过过滤清洗活化的固定生物分子。任选地，所得滤液 是缓冲液交换的，例如通过使用膜盒(membrane cartridge)离心。
[0103]典型地，将添加剂引入缓冲液媒介。这些添加剂引起控制水平的缓冲液系统和包 含在其中的生物分子。例如，添加剂比如Tris或组氨酸被引入至缓冲工艺流，以保持pH并且 使容易发生的酸化最小化。典型地，生物分子工艺流的pH应保持在pH5和9.5之间，极端的pH 限制避免了延长的时间。可添加无机盐，比如0.1M NaCl(aq)