专利名称：阿糖醇的生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产以所产生的所有多元醇的总重量为基准计算的主要量的且具有相对高的浓度的阿糖醇的方法，且更具体地涉及从包括诸如甘油的碳源的混合物生产阿糖醇的方法。该方法在一个实施方案中包括利用选择酵母菌株以高产率生产阿糖醇，同时将其他多元醇的量减至最低，其中使用诸如甘油的碳源作为培养基中的组分。在有益的实施方案中，使用生物柴油副产品甘油作为用于阿糖醇生产的底物。
背景技术：
从诸如植物油和动物脂肪的可再生能源生产的生物柴油是有吸引力的替代燃料(Krawczykl996) 0在使用甘油三酯的酯交换生产生物柴油时，甘油是产生的主要副产品:每产生9kg生物柴油，形成约Ikg甘油(Dasari等人,2005)。美国的生物柴油消耗量已从2005年的7，500万加仑急剧增加至2008年的70，000万加仑。后者导致产生约5，000万加仑甘油(http://biodiesel, orgiresources/faqs/, (Dasari2007))。精制甘油在食品、药物、纺织品和化妆工业中有许多应用，而由生物柴油工业产生的粗甘油的价值低，因为其中存在杂质如废催化剂、中和后的盐、残留的甲醇、甲基酯和游离脂肪酸(Liu等人，2002 ；Boumay等人，2005)。生物柴油工业的副产品的价值严重地影响了生物柴油工业的经济学。开发生物柴油甘油的新用途是生物柴油工业的经济学和可持续性发展迫切需要解决的问题(Demirbas20 03 ；Haas 等人，2006)。阿糖醇是可用作低热量甜味剂的多羟基醇(Huck等人，2004)。另外，能源部的一项研究将阿糖醇及其对映体木糖醇鉴定为排名前12位的生物质衍生的砌块化合物之一。阿糖醇和木糖醇可以被转化成数组化合物如木糖二酸/木糖酸(xylaric/xylonic acid)、阿糖酸 / 阿糖酸(arabonic/arabinoic acid)、丙二醇和乙二醇(Werpy 和 Petersen2004)。阿糖醇和木糖醇的熔点分别为103°C和93°C。这两者都很容易溶解于水，并且在纯化时这两者都形成白色晶体(LeToumeaul966 ；Tal ja和Roos2001 )。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)对阿糖醇的分解代谢涉及阿糖醇磷酸酯的形成，阿糖醇磷酸酯诱导抑制细菌代谢的化合物的合成(Scangos和Reinerl979)。尽管需要更多的研究,但上述特性使得使用阿糖醇作为用于减少龋齿的甜味剂成为可能。而且，阿糖醇的热值是0.2kcal/g，而木糖醇的热值是2.4kcal/g。阿糖醇很有可能可以作为天然甜味剂、龋齿减少剂和适合于糖尿病患者的糖替代物用在木糖醇的许多已知应用中(Gare2003)。如果需要，还可以(例如)通过使用氧化葡萄糖酸杆菌(Glucanobacter oxydans)将阿糖醇转化为木糖醇(Suzuki等人,2002)。这种细菌能够使用膜结合的D-阿糖醇脱氢酶将D-阿糖醇氧化成D-木酮糖，然后使用同样膜结合的D-木糖醇脱氢酶将D-木酮糖转化为D-木糖醇。已报道木糖醇的产率约为25%(Sugiyama 等人，2003)。目前，木糖醇在一种实施方案中通过来源于木材水解产物的木糖在碱性条件下的化学还原来生产(Melaja和Hamalainenl977)。这种方法需要高的压力(50atm)和温度(80-140°C )，并且使用相对昂贵的催化剂和相对多的分离步骤。还探究了通过生物方法从木糖生产木糖醇(Leathers等人,2000 ；Kim等人,2002 ；Kastner等人,2003 ；Buhner和Agblevor2004)o酵母可以使用NAD (P) H-偶联的木糖还原酶将木糖转化为木糖醇。不幸地，所产生的木糖醇倾向于被NAD+-偶联的木糖醇脱氢酶氧化为木酮糖。从此种方法获得良好的木糖醇产率需要严格控制的高细胞内NAD(P)H/NAD+比率。这种控制在大规模工业化经营中并非易事，在大规模工业化经营中大型生物反应器内的环境(特别是溶解氧浓度)是不均匀的。上述化学和生物方法需要将木糖从生物质水解产物中的复杂糖混合物中分离，这种分离花费昂贵。从生物柴油甘油生产阿糖醇并然后在需要时将阿糖醇转化为木糖醇的替代途径可被证明是有经济吸引力的。已知，阿糖醇由耐高渗酵母菌种如德巴利酵母属假丝酵母属(Debaryomyces Candida) (Bernard 等人，1981)、毕赤酵母属(Pichia) (Bisping 等人，1996)、汉逊酵母属(Hansenula) (Van Eck 等人，1989)和拟内抱霉属(Endomycopsis)(Hajnyl964)产生。当暴露于渗透压力中时，酵母聚积相容性溶解物如阿糖醇、甘油、木糖醇、赤藓糖醇和甘露糖醇从而平衡穿过细胞膜的渗透压力。美国专利2，793，981涉及多羟基醇的生产。更具体地，它涉及通过糖发酵来同时形成甘油和D-阿糖醇。美国专利2，934，474 涉及多羟基醇的生产，具体地涉及通过发酵生产D-阿糖醇。美国专利3，607，652涉及D-阿糖醇的发酵生产方法，该方法如下进行:在好氧条件下，在含有可发酵糖类如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖等作为碳源的营养培养基中培养微生物奥默毕赤酵母(Pichia ohmeri)N0.230(ATCC保藏号20209)，并回收聚积在所培养的溶液中的D-阿糖醇。D-阿糖醇据报道以高产率获得，而没有大量形成具有相似性质的其他多羟基醇。美国专利4，271，268涉及通过发酵方法制备D-阿糖醇，所述发酵方法使用毕赤酵母盐藻属(Pichiahaplophila)物种或其突变体的微生物在含有作为碳源的烃或乙醇的营
养培养基中进行。美国专利5，846，794涉及D-阿糖醇的制备方法，其特征在于它包含以下阶段:水解乳糖溶液、将如此获得的葡萄糖和半乳糖的混合物氧化成葡萄糖酸和半乳糖酸的混合物、将葡萄糖酸和半乳糖酸的混合物脱羧为D-阿拉伯糖和D-来苏糖的混合物、将这种D-阿拉伯糖和D-来苏糖的混合物催化氢化为D-阿糖醇。Production of D-Arabitol by a Newly Isolated Kodamaea ohmeri,BioprocessBiosyst Eng(2010)33:565-571报道了使用特定菌株从葡萄糖生产阿糖醇。该项工作是在不存在pH和DO (溶解氧浓度)控制的情况下在摇瓶中完成的。该物种产生副产物甘油和乙醇，它们的浓度分别为8g/L和20g/L。鉴于上述，需要提供使用生物发酵试剂和生物发酵方法生产阿糖醇的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供使用微生物生产阿糖醇的方法，优选具有相对高的产率或浓度。又一个目的在于提供使用相对温和的反应条件生产阿糖醇的方法。再一个目的在于提供制备阿糖醇的方法，其产生相对最少或较小百分比的其他反应产物如其他多元醇。本发明的进一步目的在于提供包括以下步骤的方法:合并组分以形成培养基混合物，其包含水、碳源(如甘油、葡萄糖和/或木糖)、酵母及促进细胞生长的其他营养素(例如蛋白胨和麦芽)；以及从该培养基混合物生产阿糖醇。本发明还有一个目的在于利用相对经济的方法生产阿糖醇。还有一个目的在于提供经由发酵生产阿糖醇的方法，所述发酵使用德巴利酵母属(Debaryomyces)、地霉属(Geotrichum),和梅奇酵母属(Metschnikowiayeast genera)中的一种或多种，其中德巴利酵母属和梅奇酵母属是最优选的，其中在一个实施方案中至少甘油用作培养基中的碳源，而在进一步实施方案中葡萄糖和木糖用作碳源。因此，在本发明的一方面公开了生产阿糖醇的方法，其包括以下步骤:将碳源与酵母合并在培养基中，以及生产以由该方法产生的所有多元醇的总重量为基准计算的主要量的阿糖醇，并且其中阿糖醇是以大于30g/L培养基的量并以所消耗碳源的至少40%的转化率(就是说，每消耗10克碳源，产生至少4g阿糖醇)制备的。在另一方面，公开了阿糖醇混合物，其包含以通过将碳源与酵母合并在培养基中而产生的混合物中的所有多元醇的总重量为基准计算的主要量的阿糖醇，并且其中阿糖醇是以大于30g/L培养基的量存在的。
图1是示出在具有 不同初始培养基体积的系统中产生的阿糖醇、消耗的甘油和生长的细胞的浓度的图表，其中阿糖醇和甘油浓度是在120h时测量的，而细胞浓度是在80h时测量的。图2是德巴利酵母属、地霉属和梅奇酵母属的选定菌株在不同温度下产生的阿糖醇的图表，其中样品是在培养3天后取出的。图3(a)_(d)是示出不同的初始甘油浓度对汉森德巴利酵母(D.hansenii)发酵的影响的图表，其中(a)示出细胞生长曲线，(b)示出阿糖醇产量曲线，(C)示出在120h时消耗的甘油和产生的阿糖醇的浓度，和(d)示出在120h时从所消耗的甘油得到的阿糖醇产率。图4(a)和(b)是示出在初始甘油浓度为100g/L时不同的盐浓度对汉森德巴利酵母发酵的影响的图表，其中(a)示出细胞生长且(b)示出阿糖醇产量曲线。图5是示出盐的添加对在初始甘油浓度为100g/L的培养基中的汉森德巴利酵母的阿糖醇产量的影响的图表，其中该盐是在生长2天后添加的；图6 (a)和(b)是示出作为潜在第二碳源的30g/L葡萄糖、30g/L木糖或30g/L山梨糖醇连同50g/L甘油的添加对静止期汉森德巴利酵母的阿糖醇产量的影响的图表，其中让细胞在含有30g/L (即)甘油的培养基中生长74h，(a)中比较了阿糖醇产量曲线，(b)中示出由静止期培养物(在74-145h)消耗的第二碳源和甘油的浓度，且尽管没有示出，但在(b)中所消耗浓度的标准偏差在13%至22%的范围内；
图7示意性示出各种底物转化至阿糖醇的可能途径；图8是示出随时间推移的葡萄糖和木糖消耗量及阿糖醇产量的图表；以及图9是示出在不同溶解氧浓度下的阿糖醇产率的图表。
具体实施例方式采用本发明方法，通过使用微生物(具体地为酵母，优选德巴利酵母属、地霉属和梅奇酵母属，更优选德巴利酵母属和梅奇酵母属)，利用在培养基中的碳源(如甘油及植物生物质的水解产物中的一种或多种，如葡萄糖和木糖中的一种或多种)来生产多羟基醇或糖醇阿糖醇。除了其他用途如用作中间体，阿糖醇可以用作低热量甜味剂。用于生产阿糖醇的微生物为德巴利酵母属、梅奇酵母属和地霉属的酵母。优选使用德巴利酵母属和梅奇酵母属的酵母，因为已发现当甘油用作底物时，以总多元醇含量为基准计算，此类菌株主要产生阿糖醇。虽然地霉属菌株产生大量阿糖醇，但它们被发现产生较小量的其他多元醇(如甘露糖醇)。关于德巴利酵母属，其合适的物种或菌株为汉森德巴利酵母。关于梅奇酵母属的酵母，其合适的物种或菌株为佐贝尔梅奇酵母(M.zobellii)。关于地霉属，其合适的物种或菌株为白地霉(G.candidum)、发酵地霉(G.fermentans)和G.cucujoidarum,其中白地霉和G.cucujoidarum是优选的。微生物的各种菌株可以从美国农业研究服务部的北方地区研究实验室(NRRL)培养物保藏中心(Northern RegionalResearch Laboratories (NRRL) Culture Collection of United States Department ofAgriculture’s Research Service)获得。在初始培养基混合物中使用的酵母浓度一般在约0.05g/L至约5g/L, 期望约0.lg/L至约3g/L,并优选约0.5g/L至约2g/L培养基的范围内。通过在该过程中生长而达到的最大酵母浓度一般在约5g/L至约60g/L，期望约10g/L至约50g/L，并优选约20g/L至约40g/L培养基的范围内。优选使用水作为培养基的主要成分。根据本发明的方法通过将用于生产阿糖醇的微生物(即，酵母)在液体培养基混合物中生长或以其他方式培养来实施，所述液体培养基混合物包括但不限于，碳源、氮源和营养素(如有机或无机营养素)、维生素、氨基酸等中的一种或多种。在优选的实施方案中，所述液体培养基混合物包括至少酵母、碳源和氮源。用作用于制备阿糖醇的碳源的甘油可以来自任何期望来源。在一个优选实施方案中，甘油是作为生物柴油生产的副产品获得的。生长培养基中的甘油初始浓度一般在50g/L至约400g/L，期望约80至约200g/L，优选100至约130g/L培养基的范围内。在一些实施方案中，一种或多种另外的碳源(例如葡萄糖、木糖和木质纤维素生物质的水解产物)可以与甘油一起使用或代替甘油。可使用的其他任选的碳源为蔗糖、阿拉伯糖和木酮糖。当与甘油一起使用时，其他碳源的量在一个实施方案中优选小于所使用的甘油量。在其中甘油与葡萄糖和木糖独立地组合使用的一个实施方案中，初始葡萄糖浓度可以在约30g/L至约200g/L的范围内，并且初始木糖浓度可以在约30g/L至约150g/L的范围内。在优选的实施方案中，包括甘油的培养基混合物优选不含山梨糖醇，山梨糖醇已被发现会降低阿糖醇产量。在进一步的实施方案中，碳源是葡萄糖和木糖及任选的其他合适的底物(例如从木质纤维素生物质制备的水解产物中存在的丰度较低的糖)的组合。在此种实施方案中，葡萄糖的初始浓度在约30g/L至约400g/L培养基，一般约80g/L至约300g/L培养基，且期望约100g/L至约200g/L培养基的范围内，并且木糖的初始浓度在约30g/L至约200g/L培养基，一般约80g/L至约150g/L培养基，期望约50g/L至约100g/L培养基的范围内。在一个实施方案中，培养基利用氮源(例如，蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、硫酸铵、硝酸铵，和尿素)。除了用作氮源之外，蛋白胨、酵母提取物和麦芽提取物还用作碳水化合物、蛋白质、单糖、二糖和寡糖的源。可以使用合适的氮源初始量，例如酵母提取物的量可以在约3g/L至约30g/L培养基的范围内，硫酸铵的量可以在约2g/L至约20g/L培养基的范围内，蛋白胨的量可以在约3g/L至约30g/L培养基的范围内，并且麦芽提取物的量可以在约3g/L至约50g/L培养基的范围内。在一个实施方案中培养基还可以包括磷酸盐源(如磷酸钾，如用于细胞生长和产物产生的磷酸二氢钾或磷酸氢二钾)。一般而言，使用的初始磷酸二氢钾和磷酸氢二钾浓度在约lg/L至约12g/L培养基的范围内。在一个实施方案中阿糖醇的生产在好氧条件下实施，优选通过利用任何合适的设备(如混合器、搅拌器、压缩空气、压缩氧气、空气/氧气喷射口、空气/氧气扩散器等)搅拌培养基和/或使培养基通气来进行。该过程需要充足浓度的溶解氧以便提供细胞生长和阿糖醇形成。在一个实施方案中，溶解氧浓度为空气饱和度的至少2% (即，约0.15mg溶解氧/升培养基)，并期望地为约5%至10% (即，约0.4mg/L至0.8mg/L)。本发明中使用的酵母在不同温度下产生不同浓度的阿糖醇。一般而言，该方法的温度在介于约20°C至约50°C之间的范围内，且期望地在约28°C至约30°C的范围内，优选为约30°C。就具体酵母微生物而论，汉森德巴利酵母菌株一般被维持在约20°C至约35°C且优选约25°C至约30°C的温度范围内；白地霉菌株被维持在约20°C至约35°C且优选约25°C至约30°C的温度范围内；G.cucujoidarum菌株被维持在约20°C至约35°C且优选约25°C至约30°C的温度范围内；佐贝尔梅奇酵母菌株被维持在约25°C至约30°C且优选约25°C至约30°C的温度范围内。培养基混合物的合适的pH —般为约3至约6且优选为约3至约4。鉴于上述，在一个实施方案中本发明方法包括以下步骤:将期望浓度的碳源(在优选实施方案中为至少甘油)和一种或多种选定的酵母微生物，以及任何其他所需组分合并在一起；以及在培养基中形成混合物；以及优选利用本文描述的条件从该混合物产生阿糖醇。在一个实施方案中，将甘油和/或其他碳源以及除了酵母之外的任何其他所需组分与其他培养基组分分开来在合适的温度下进行高压灭菌，然后进行混合以便破坏不期望的生物试剂(如有机体和孢子)或以其他方式灭菌待在发酵中使用的非酵母组分。根据所使用的酵母菌株，可以产生其他多元醇产物。根据需要持续发酵过程，直到产生适宜量的阿糖醇。该方法的时间可以随着诸如所利用的酵母微生物的因素而变化，并且可以在约2天至约10天且优选约3天至约6天的范围内。该方法产生的阿糖醇的量以由该方法产生的多元醇的总共100重量份为基准计算一般大于60重量份，期望地大于70、80或90重量份，优选大于92或95重量份。在优选实施方案中，阿糖醇和其他多元醇的存在和浓度可以使用HPLC测量。本发明方法的重要益处是每升培养基产生大量阿糖醇。当甘油单独地用作碳源或者与总量为较小量的其他碳源组合用作碳源时，每升培养基产生至少35克，期望地至少50克阿糖醇。本发明方法以所消耗碳源的至少40%(期望至少50%，优选至少60%)的转化率产生阿糖醇。就是说，对于至少40%的转化率而言，消耗每IOg碳源，产生至少4g阿糖醇。在一个实施方案中，其中葡萄糖和木糖用作碳源混合物，每消耗60g/L葡萄糖和木糖，产生至少30g/L培养基(期望地大于34g/L培养基)的量的阿糖醇。实施例酵母菌株筛选为了从甘油生产阿糖醇而对来自25个属的214个菌株进行广泛的培养筛选。以下5个属含有最大数目的被筛选菌株:德巴利酵母属、地霉属、梅奇酵母属、假丝酵母属和双足囊菌属(Dipodascus)。完整的属列表和每个属中的被筛选菌株数目在表I中给出。所有菌株都得自NRLL。表I属和被筛选的菌株数目
权利要求
1.一种生产阿糖醇的方法，其包括以下步骤: 将碳源与酵母合并在培养基中，形成培养基混合物；以及 生产以由所述方法产生的所有多元醇的总重量为基准计算的主要量的阿糖醇，并且其中所述阿糖醇是以大于30g/L培养基的浓度并以所消耗碳源的至少40%的转化率产生的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酵母是德巴利酵母属、梅奇酵母属，和地霉属中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述酵母是德巴利酵母属和梅奇酵母属中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述碳源是甘油、葡萄糖、木糖和木质纤维素生物质的水解产物中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括从生物柴油生产中获取作为副产物的甘油的步骤。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述酵母是汉森德巴利酵母和佐贝尔梅奇酵母中的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的方法，其中使用至少甘油作为碳源，其中所述甘油在所述初始混合物中的浓度为约50g/L至约400g/L培养基，其中所述酵母在所述初始混合物中的浓度为约0.05g/L至约5g/L培养基，其中所述阿糖醇是以以多元醇的总共100重量份为基准计算的大于60重量份的量产生的，并且其中所述阿糖醇是以大于35g/L培养基的量产生的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中阿糖醇的生产是在介于约20°C至约50°C之间的范围内的温度下进行的，其中 所述混合物的PH为约3至约6，并且其中所述混合物进一步包括以下氮源中的一种或多种:约3至约30克酵母提取物/升培养基、约2至约20克硫酸铵/升培养基、约3至约30克蛋白胨/升培养基，和约3至约50克麦芽提取物/升培养基。
9.根据权利要求7所述的方法，其进一步包括在好氧条件下进行生产的步骤，其中所述酵母是德巴利酵母属和梅奇酵母属中的一种或多种，其中所述阿糖醇是以以多元醇的总共100重量份为基准计算的大于90重量份的量产生的，并且其中所述阿糖醇是以大于50g/L培养基的量产生的。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述碳源进一步包括葡萄糖、木糖和木质纤维素生物质的水解产物中的一种或多种。
11.一种阿糖醇混合物，其包含:以通过将碳源与酵母合并在培养基中而产生的混合物中的所有多元醇的总重量为基准计算的主要量的阿糖醇，并且其中所述阿糖醇是以大于30g/L培养基的量存在的。
12.根据权利要求11所述的阿糖醇混合物，其中所述碳源是甘油、葡萄糖、木糖和木质纤维素生物质的水解产物中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的阿糖醇混合物，其中所述碳源是至少甘油，并且其中所述阿糖醇是以至少大于50g/L培养基的量存在的。
14.根据权利要求13所述的阿糖醇混合物，其中所述混合物包含以所述混合物中的多元醇的总共100重量份为基准计算的大于60重量份的量的阿糖醇，并且其中所述酵母是德巴利酵母属、梅奇酵母属，和地霉属中的一种或多种。
15.根据权利要求14所述的阿糖醇混合物，其中所述阿糖醇是以大于90重量％的量存在的，并且其中所述酵母是德巴利酵母属和梅奇酵母属中的一种或多种。
16.根据权利要求15所述的阿糖醇混合物，其中所述阿糖醇是以大于94重量％的量存在的。
17.根据权利要求11所述的阿糖醇混合物，其中所述碳源是葡萄糖、木糖和木质纤维素生物质的水解产物。
18.根据权利要求15所述的阿糖醇混合物，其中阿糖醇是以大于50g/L培养基的量存在的。
19.根据权利要求17所述的阿糖醇混合物，其中阿糖醇是以大于34g/L培养基的量存在的。
20.根据权利要求19所述的阿糖醇混合物，其中所述酵母是汉森德巴利酵母和佐贝尔梅奇酵母中的一种或多种，并且其中所述甘油是作为生物柴油生产中的副产品获得的。
全文摘要
本发明涉及一种生产阿糖醇的方法，且更具体地涉及从包括诸如甘油的碳源的混合物生产以所产生的所有多元醇的总重量为基准计算的主要量的且具有相对高的浓度的阿糖醇的方法。该方法在一个实施方案中包括利用选择酵母菌株以高产率生产阿糖醇，同时将其他多元醇的量减至最低，其中使用诸如甘油的碳源作为培养基中的组分。在有益的实施方案中，使用生物柴油副产品甘油作为用于阿糖醇生产的底物。
文档编号C12P7/18GK103168103SQ201180037817
公开日2013年6月19日 申请日期2011年7月22日 优先权日2010年7月23日
发明者L-K·朱 申请人:阿克伦大学