高效的小体积核酸合成的制作方法

高效的小体积核酸合成的制作方法
【专利摘要】总体而言，本公开内容涉及用于产生核酸分子的组合物和方法。在一些方面，本发明允许核酸分子的微量产生，任选地随后为这些核酸分子装配成更大的分子。在一些方面，本发明允许核酸分子(例如，大核酸分子例如基因组)的有效产生。
【专利说明】高效的小体积核酸合成
发明领域
[0001]总体而言，本公开内容涉及用于产生核酸分子的组合物和方法。在一些方面，本发明允许核酸分子的微量产生，任选地随后为这些核酸分子装配成更大的分子。在一些方面，本发明允许核酸分子(例如，大核酸分子例如基因组)的有效产生。
[0002]发明背景
[0003]核酸分子的产生可以是相当简单或复杂的，这取决于诸如待产生的核酸分子的类型等的因素。例如，历史上，短的单链核酸分子例如引物典型地通过化学合成来产生(参见例如，U.S.专利号5，837，858，其公开内容通过提及而并入本文)。进一步地，更长的核酸分子典型地通过聚合酶链式反应(PCR)来产生。PCR的一个缺点是通常需要模板核酸。
[0004]许多核酸合成方法对于从头产生大的核酸分子具有有限的能力。本公开内容的一个方面是解决该限制。
[0005]发明概述
[0006]本发明部分地涉及用于合成核酸分子的组合物和方法。本发明还涉及用于装配核酸分子从而形成诸如质粒、染色体和基因组之类的分子的组合物和方法。
[0007]在一些方面，本发明涉及用于核酸分子的非模板指导的合成的多孔平板。在一些实施方案中，所述平板包含位于所述平板的众多孔的每个孔中的珠粒(例如，磁性珠粒)和存在于所述众多孔的一个或多个孔中的以电化学方式产生的酸(EGA)。代替在一个或多个孔中具有EGA或者除了在一个或多个孔中具有EGA，所述平板的孔可以包含有在别处陈述的与核酸分子的合成相关的其他试剂。
[0008]在本发明的实践中使用的珠粒大小可以广泛地变化，但是包括具有下列直径的珠粒:0.01 μ m至 100 μ m、0.005 μ m至 100 μ m、0.005 μ m至 10 μ m、0.01 μ m至 100 μ m、0.01 μ m至 1，000 μπκΙ.Ομηι 至 2.0μηι、1.0μηι 至 100μηι、2.0μηι 至 100μηι、3.0μηι 至 100 μ m、0.5 μ m 至 50 μ m、0.5 μ m 至 20 μ m、1.0 μ m 至 10 μ m、1.0 μ m 至 20 μ m、1.0 μ m 至 30 μ m、10 μ m至40 μ m、10 μ m至60 μ m、10 μ m至80 μ m或0.5 μ m至10 μ m。正如本领域技术人员将会认识到的，当固体颗粒降到一个特定的大小水平之下时，它们开始看上去获得了流体的属性(例如，形成胶体悬浮液的等价物)。因此，在一些情况下(例如，在使用直径低于大约500nm的珠粒时)，可以期望将所述珠粒作为流体对待。这可以意味着从磁性尖端上移除珠粒，例如，通过搅拌、洗涤，或通过使用表面活性剂。
[0009]在本发明的特别的实施方案中，可以依赖于孔的大小来选择珠粒大小，以允许仅一个单珠粒占据孔。在其他实施方案中，多于一个的珠粒(或其他形状的核酸合成基质)可以在所述孔的一些或所有中。在一些情况下，珠粒数目/孔可以为二至二十，二至三十，二至十，四至二十，四至十，四至五十，等等。
[0010]孔的数目也可以广泛地变化，并且受到诸如待产生的核酸的量之类的因素以及诸如可制造性和与使用有关的机械因素(例如，磁性珠粒提取器的大小下限)之类的技术因素限制。在任何情况下，孔的数目可以总计为例如为10至10，000，000、10至5，000，000、10 至 2，000，000、10 至 I, 000, OOOUO 至 800，000、10 至 650，000、10 至 500, 000,500 至500，000、10 至 50，000、1，000 至 500，000、10，000 至 500，000,20, 000 至 500，000 或 I,000至50，000。进一步地，制备了多孔表面，其具有数目在I千万范围内的孔。因此，在一些情况下，孔的数目可以少于5百万、I千万、2千万等。
[0011]每个孔的总体积是可以变化的另一个项目，并且可以例如为ι.οχιο_9μ I至 50μ 1、1.0X 10—V I 至 10 μ 1、1.0X 10—9μ I 至 1.0μ 1、1.0X 10—V I 至 ο.?μL、1.0Χ10-9μ1 至 1.0X 10-2μ 1、1.0X 10-9μ I 至 1.0X 10-3μ 1、1.0X 10-9μ I 至1.0X 10-4μ 1、1.0X 10-9μ I 至 50μ 1、1.0X 10-5μ I 至 1.0X 10-6μ 1、1.0X 10-9μ I 至1.0Χ10_7μ 1、2.5Χ10-> I至L ΟΧΙΟ-2 μ 1、2.5 XlO-V I至 L 0Χ10-3μ 1、2.5Χ10-9μ I 至1.0Χ10_4μ 1、2.5Χ10-> I至L ΟΧΙΟ-5 μ 1、2.5 XlO-V I至 L 0Χ10-6μ 1、1.0Χ10-8μ I 至
1.0Χ10_6μ 1、1.0Χ10_8μ I 至 1.0Χ10_5μ 1、1.0Χ10_7μ I 至 1.0Χ10_5μ 1、1.0Χ10_7μ I至 1.0Χ10_4μ 1、1.0Χ10-7μ I 至 1.0Χ10_3μ 1、1.0Χ10-7μ I 至 1.0Χ10_2μ 1、0.1μ I 至50μ 1、0.01 μ I 至 50μ 1、0.01 μ I 至 25μ 1、0.01 μ I 至 15μ 1、0.01 μ I 至 10μ 1,0.001 μ I至 50μ 1、0.001 μ I 至 5μ 1、0.001 μ I 至 I μ 1、0.001 μ I 至 0.01 μ I 或 0.001 μ I 至 I μ I。
[0012]在许多情况下，将会将本发明的多孔平板或适合用于本发明的多孔平板可操作地与一个电极或一套(例如，一对或数对)电极相连接。如在本文别处所讨论的，这些电极可以用于产生与一个或多个化学反应的催化相关的微环境(例如，用于核苷酸去保护的EGA)。
[0013]在一些实施方案中，将会将本发明的多孔平板或适合用于本发明的多孔平板与用于引入和移除试剂的微观流体通道相连接。这允许试剂的有效和自动化的控制。
[0014]本发明还提供了用于产生从更小的化学合成的核酸分子形成的经装配的核酸分子的方法。在一些实施方案中，这样的方法可以包括一个或多个下列步骤:
[0015](a)合成众多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制备每个核酸分子；
[0016](b)将在(a)中产生的核酸分子或其一部分进行合并，从而产生汇集物；
[0017](C)将一些或所有存在于在(b)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的核酸分子；
[0018](d)从在(C)中形成的所述众多更大的核酸分子中去除包含序列错误的核酸分子，从而产生校正了错误的核酸分子汇集物；和
[0019](e)将在所述校正了错误的核酸分子汇集物中的核酸分子进行装配，从而形成经装配的核酸分子。
[0020]在一些实施方案中，存在于汇集物中的核酸分子的连接将由聚合酶链式反应(PCR)来介导。
[0021]在一些实施方案中，步骤(b)可以进一步包括将在(a)中产生的核酸分子与通过其他方式获得的核酸分子进行合并，从而形成汇集物，其中所述其他方式包括PCR、限制酶消化或核酸外切酶处理。 在一些情况下，可以将在(C)和/或(e)中产生的经装配的核酸分子进行装配并引入到载体(例如，克隆载体、目的载体，等等)中。
[0022]通过本发明的方法进行装配的核酸分子的数目可以变化，并且在合适时将会与经汇集的核酸分子的数目相关联。在任何情况下，在本发明的方法中装配的核酸分子可以由至少五个其他(例如，更小的)核酸分子(例如，大约五个至大约五千个，大约五个至大约两万个，大约五个至大约十万个，大约五十个至大约五千个，大约五十个至大约两万个，大约五十个至大约十万个，大约一百个至大约五千个，大约一百个至大约十万个，大约五百个至大约五千个，大约五百个至大约十万个等的核酸分子)组成。
[0023]通过本发明的方法进行装配的核酸分子可以很大地变化，并且包括至少20千碱基(例如，大约0.5千碱基至大约10兆碱基、大约0.5千碱基至大约5兆碱基、大约0.5千碱基至大约I兆碱基、大约0.5千碱基至大约500千碱基、大约0.5千碱基至大约100千碱基、大约0.5千碱基至大约10兆碱基、大约0.5千碱基至大约I千碱基、大约I千碱基至大约10兆碱基、大约10千碱基至大约5兆碱基、大约I千碱基至大约5兆碱基、大约I千碱基至大约2兆碱基、大约I千碱基至大约I兆碱基、大约I千碱基至大约500千碱基、大约10千碱基至大约I兆碱基、大约10千碱基至大约500千碱基、大约10千碱基至大约100千喊基，等等)的分子。
[0024]通过本发明的方法进行装配的核酸分子可以例如是单链的、部分单链的或双链的，闭合的，环状的(例如，质粒)；带切口的，环状的；或线性的(例如，质粒、染色体等)。进一步地，可以如此地施行本发明的方法，从而在相同的反应混合物中同时形成两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、十个、二十个等)经装配的核酸分子。
[0025]本发明还提供了用于产生产物核酸分子的方法。在一些情况下，这样的方法包括:
[0026](a)设计大小为10千碱基至500千碱基(例如，500碱基至500千碱基、500碱基
至100千碱基、500碱基至I千碱基、500碱基至800碱基，2千碱基至100千碱基、2千碱基至50千碱基、2千碱基至5千碱基、10千碱基至500千碱基、10千碱基至300千碱基、10千碱基至200千碱基、10千碱基至100千碱基、10千碱基至50千碱基，等等)的产物核酸分子，其中所述产物核酸分子通过核苷酸序列来进行定义；
[0027](b)合成众多在核苷酸序列方面不同的独个核酸分子，其中合成每个独个核酸分子以制备1，000至1.0 X IO9个拷贝的数量，并且其中所述独个核酸分子能够与一个或多个其他独个核酸分子杂交；
[0028](C)在一定的条件下将在(b)中合成的独个核酸分子进行合并，所述条件允许所述独个核酸分子在允许形成至少一个更大的核酸分子的条件下进行杂交；和
[0029](d)将在(C)中形成的所述至少一个更大的核酸分子与一个或多个另外的核酸分子进行合并，从而形成产物核酸分子，其中所述产物核酸分子包含少于一个的序列错误/千碱基。
[0030]在许多情况下，在产生产物核酸分子过程中采用错误校正程序。在上面的工作流程中可以施行错误校正程序的一个地方是在步骤(b)之后。错误校正程序在本文别处进行描述，并且将会经常包括使用一种或多种错配修复核酸内切酶。
[0031]作为产物核酸分子的制备的一部分而合成的独个核酸分子的数目可以很大地变化，但是包括1,000至1.0X IO9个拷贝、1,000至1.0X IO8个拷贝、1,000至1.0X IO7个拷贝、1，000至1.0X IO6个拷贝、1，000至1.0X IO5个拷贝、2.0X IO7至1.0X IO9个拷贝、
5.0XlO7M 1.0X IO9 个拷贝、7.0X IO7 至 1.0X IO9 个拷贝、2.0XlO7 至 8.0X IO8 个拷贝、
2.0X IO7 至 5.0X IO8 个拷贝、5.0X IO4 至 1.0X IO9 个拷贝、1.0X IO6 至 1.0X IO9 个拷贝、
1.0X IO7至LOXlO8个拷贝，等等。
[0032]在许多情况下，可以使用聚合酶链式反应来扩增在上面的产物核酸分子制备方法中在步骤(C)中形成的所述至少一个更大的核酸分子。
[0033]用于合成核酸分子的平板形式在本文别处进行描述，并且它们可以用在上面的产物核酸分子制备方法中。进一步地，当在珠粒上合成独个核酸分子时，其中每个珠粒可以包含在孔中。进一步地，在本发明的该方面以及本发明的其他方面中使用的珠粒可以例如具有诸如下列的大小:1 μ m至100 μ m的直径、5 μ m至50 μ m的直径、3 μ m至100 μ m的直径、5 μ m M 100 μ m 白勺;6^:5、20 μ m M 100 μ m 白勺μ m M 60 μ m 白勺;6^:5、10 μ m M 100 μ m 白勺直径,等等。在一些实施方案中，珠粒可以具有大约30 μ m的直径(例如，28至32μπι)的大小。
[0034]本发明还包括用于以小的量和以高的序列保真度产生核酸分子的方法。在一些方面，本发明包括用于产生核酸分子的方法，所述方法包括以3.0X IO6至4.0X IO8个分子的总量合成核酸分子，其中序列错误的数目为1/100至1/500。
[0035]因此，本发明包括用于产生核酸分子集合的方法，囊括了包括下列步骤的方法:
[0036](a)合成众多核酸分子，其中以微量制备每个核酸分子；
[0037](b)将一些或所有存在于在(a)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的的核酸分子；和
[0038](C)将所述众多更大的核酸分子进行装配，从而形成核酸分子集合，其中从生物信息学信息方面，所述核酸分子集合选自下列:
[0039](I)互补DNA (cDNA)文库，其仅包含与信使RNA (mRNA)分子相对应的DNA ；
[0040](2)部分cDNA文库，其包含与小于在所述生物信息学信息所来自的细胞类型中发现的mRNA分子的完全互补物相对应的DNA分子；和
[0041](3)核酸分子集合，其中一些或所有的所述核酸分子为在所述生物信息学信息所来自的细胞类型中发现的核酸分子的密码子经改变的变体。
[0042]本发明还提供了用于产生从更小的化学合成的核酸分子形成的自我复制性核酸分子的方法。在一些实施方案中，这样的方法可以包括一个或多个下列步骤:
[0043](a)合成众多核酸分子，其中在平板中以微量制备每个核酸分子；
[0044](b)将一些或所有存在于在(a)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的核酸分子；和
[0045](C)将所述众多更大的核酸分子进行装配，从而形成自我复制性核酸分子。
[0046]通过本发明的方法制备的自我复制性核酸分子包括染色体、人工染色体(例如，BAC或YAC)、质粒和基因组(例如，诸如下列的基因组:病毒基因组、核基因组、原核生物(例如，细菌、藻类等)基因组、叶绿体基因组或线粒体基因组)。
[0047]本发明还包括用于合成和装配编码多于一种的表达产物的核酸分子的方法，所述方法包括:
[0048](a)合成众多核酸分子，其中以微量制备每个核酸分子；
[0049](b)将一些或所有存在于在(a)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的核酸分子；和
[0050](c)将所述众多更大的核酸分子进行装配，从而形成编码多于一种的表达产物的核酸分子。
[0051]在本发明的各种不同的方面，所述多于一种的表达产物可以为在相同的生物学途径中所牵涉的蛋白质。在更特别的方面，所述多于一种的表达产物可以为在相同的生物学途径中所牵涉的蛋白质，所述在相同的生物学途径中所牵涉的蛋白质为催化在该生物学途径中的一系列化学反应的酶。进一步地，此类在相同的生物学途径中的化学反应可以为顺次反应，其意义为:一个化学反应跟随另一个化学反应，直接地(直接顺次的)或者在一个或多个插入反应发生之后。
[0052]本文所指的生物学途径包括导致产生选自下列的终产物的那些:
[0053](a)生物燃料前体；(b)抗生素或抗生素前体；(C)食物组分；⑷化学中间体(例如，1，4-丁二醇、2，3-丁二醇、苯、丁二烯、2-丁醇、3-羟基丙酸、丙烯酸、己二酸、氨基己酸、己内酰胺、乙炔、正丁醇、环己酮、富马酸、4-羟基丁酸、GBL/BD0、六亚甲基二胺、异丁醇、异丙醇、正丙醇、长链醇、甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯、甲基.乙基酮、丙烯、腐胺、粘康酸、对甲苯甲酸、对苯二酸、乙酸、葡糖二酸)；(d)工业酶；和(e)天然产物。生物燃料前体包括选自下列的醇:(a) 丁醇；(b)戊醇；(c)己醇；(d)庚醇；和(e)辛醇。食物组分包括牲畜饲料组分，其包括选自下列的氨基酸:(a) L-赖氨酸；(b) L-苏氨酸；(c) L-甲硫氨酸；(d) L-亮氨酸；(e) L-异亮氨酸；(f) L-缬氨酸；和(g)高丝氨酸。
[0054]可以将经装配的核酸分子引入到许多细胞(包括原核细胞和真核细胞)中。此类细胞的例子包括下列成员:棒杆菌属(Corynebacterium)(例如，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum))、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)(铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、芽抱杆菌属物种(Bacillus sp.)(迟缓芽 孢杆菌(Bacillus lentus)、凝结芽抱杆菌(Bacilluscoagulans)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis))、曲霉属物种(Aspergillus sp.) (土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(A.niger)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor))、链霉菌属物种(Streptomycetes spp.)(灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、紫色链霉菌(Streptomyces violaceans)、吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)、八抱链霉菌(Streptomyces octosporus))、梭菌属(Clostridium)(梭菌)、热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、扬氏梭菌(ClostridiumIjungdahlii)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、糖丁醇梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)、糖多丁基丙酮梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)(红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、(乳酸)克鲁维酵母(Kluyveromyces(Iactis))、粗糖脉抱菌(Neurospora crassa)、解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolitica)、腐质霉属(Humicola)(灰腐质霉(Humicola grisea))、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)(狭小毕赤酵母(Pichia angusta))、醋杆菌属(Acetobacters)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、金孢属(Chrysosporium)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、粘细菌属(Myxobacteria)、深黄被抱霉(Mortierella isabellina)、产玻拍酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)、产玻?自酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)/ 东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)(酵母)(克鲁斯假丝酵母(Candida krusei))、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、凝结芽孢杆菌 GB1-30、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BB-12、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.1nfant is) 35624、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii) La1、植物乳杆菌(Lactobacillus pi ant arum)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、布拉氏糖酵母(Saccharomyces boulardii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜酸乳杆菌 NCFM、双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)BB_12、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌、黄单胞菌属(Xanthomonas)(野油菜黄单胞菌(X.campestris))、古细菌(Archea)(盐杆菌属物种(Halobacterium sp.)NRC_1、东大硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)、东大硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)、詹氏甲焼热球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)和火山热原体(Thermoplasma volcanium))、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、鼠抱菌属物种(Sporomusa species)、扬氏梭菌、醋酸梭菌、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、地杆菌属物种(Geobacter species)、 希瓦氏菌属物种(Shewanella sp.)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、索诺拉假丝酵母(Candida sonorensis)、热带假丝酵母(Candidatropical is)、多形汉逊酵母、东方伊萨酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、树干毕赤酵母、贝糖酵母(Saccharomyces bay anus)、博伊丁糖酵母(Saccharomyces bulderi)、葡萄汁糖酵母(Saccharomyces uvarum)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、生物降解(Aromatoleum aromaticum、芳香脱氯单胞菌(Dechloromonas aromatica)、哈夫尼脱亚硫酸菌(Desulfitobacterium hafniense)、金属还原地杆菌(Geobacter metal Iireducens)、博尔库姆岛食焼菌(Alcanivoraxborkumensis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、规则游动放线菌(Actinoplanes regularis)、东方诺卡氏菌(Nocardia orientalis)、Actinocorrulia regularis、膨大弯颈霉(Tolypocladiuminf latum)、红色红曲(Monascus ruber)、?於泥两面神菌(Janibacter Iimonus)、马杜拉放线菌属物种(Actinomadura sp.)、抚抱菌属物种(Verucosispora sp.)、Muscodar albus 和粗糙脉孢菌。
[0055]正如本领域技术人员将会理解的，本发明的许多方面很好地适合于自动化。自动化系统常常由可以实施重复任务的软件来进行驱动，尤其是当与为组分和试剂流的微量操作而设计的硬件相整合时。因此，根据本文所描述的各种不同的实施方案，装配和合成核酸的方法可以在计算机系统上施行。进一步地，根据本文所描述的各种不同的实施方案，用于装配和合成核酸的处理器可执行的指令。因此，在一些方面，本发明包括用通过处理器可执行的指令进行编码的、非暂时性的、计算机可读的存储介质，其用于产生经装配的核酸分子，所述指令包括用于下列步骤的指令:
[0056](a)合成众多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制备每个核酸分子；
[0057](b)将在(a)中产生的核酸分子进行合并，从而产生汇集物；
[0058](c)将一些或所有存在于在(b)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的核酸分子；[0059](d)从在(C)中形成的所述众多更大的核酸分子中去除包含序列错误的核酸分子，从而产生校正了错误的核酸分子汇集物；和
[0060](e)将在所述校正了错误的核酸分子汇集物中的核酸分子进行装配，从而形成经装配的核酸分子。
[0061]本发明还包括用于产生经装配的核酸分子的系统，所述系统包括:
[0062]-处理器；和
[0063]-用由处理器可执行的指令进行编码的存储器，所述指令用于下列步骤:
[0064](a)合成众多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制备每个核酸分子；
[0065](b)将在(a)中产生的核酸分子进行合并，从而产生汇集物；
[0066](c)将一些或所有存在于在(b)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的核酸分子；
[0067](d)从在(C)中形成的所述众多更大的核酸分子中去除包含序列错误的核酸分子，从而产生校正了错误的核酸分子汇集物；和
[0068](e)将在所述校正了错误的核酸分子汇集物中的核酸分子进行装配，从而形成经装配的核酸分子。
[0069]附图简述
[0070]图1是本发明的工作流程的方面的总体描述。该工作流程被切分为四个部分，为了描述的容易而将这些部分称作“模块”。该工作流程在该图的右侧显示出在本发明的方法的一些方面中包括的一些特殊步骤。
[0071]图2A-2B是根据本发明的一个实施方案的一行孔的示意性图示。孔I中的较暗区域指明了存在有在给定的时间处在其他孔中不存在的试剂(例如，EGA)。
[0072]图3显示了核酸装配流程方案。在该图的底部显示的经装配的核酸分子上的粗末端表示通过外部引物(也称为末端引物)而添加的区域。
[0073]图4显示了第二种核酸装配流程方案。具有箭头的点线显示了基于PCR的合成方向和区域。
[0074]图5显示了通过使用缝合性核酸分子来将两个不共享有任何同源性的DNA片段装配到载体中。在该图的下面部分中以粗体显示的69碱基对双链缝合性核酸分子与每个相邻片段(片段I和2)共享有30-bp同源性。这些缝合性核酸分子用于在所述相邻片段的接合点处插入9bp。插入碱基显示为具有下划线。
[0075]图6是用于合成最小化了错误的核酸分子的示例性过程的流程图。
[0076]图7是用于合成最小化了错误的核酸分子的示例性过程的工作流程图。双链核酸分子的不同链通过较粗和较细的线条来表示。“MME”是指错配核酸内切酶。小的圆形物表示序列错误。
[0077]图8总体性地图解说明了用于在酵母中装配和克隆核酸区段的方法。在本发明的一些实施方案中，将许多核酸区段(其中之一为载体)与片段共转化到酵母宿主细胞中，在那里它们通过同源重组而装配形成例如闭合的环状核酸分子。
[0078]图9是可以在本发明的实践中使用的电线圈的图画。
[0079]图10是适合用于本发明的流体试剂递送系统的一个实施方案的横截面视图。
[0080]图11显示了通过本发明的方法产生的线性核酸分子的文库(上部)和被设计用于接受文库成员的载体(下部)。该图的上面部分显示了代表所述文库的四个成员的一系列线条。下面的开放环线表示载体。在所述核酸分子的每个末端处的块状物表示促进连接的核酸区段(例如,Gateway?位点,同源区域，等等)。核酸分子的末端的数字指明了相容的末端。
[0081]图12显示了可以通过本发明的方法制备的一系列变体核酸分子以及其所编码的氨基酸序列。图12A显示了编码不同的氨基酸序列的变体核酸分子。图12B显示了使用不同的密码子但编码相同的氨基酸序列的变体核酸分子。
[0082]图13显示了用于合成平台的微孔平板实施方案的两种不同的流体移除选项。
[0083]图14显示了被设计用于在每行(1401)中产生相同的核酸分子的核酸分子合成平台的两个不同的视图。图14A是顶视图，和图14B是侧视图。在该图中显示了流体通道(1401)，与每个通道相关联的两个电极/行孔(1402)，和一系列包含位于孔中的核酸合成基质(例如，独个珠粒)的孔(1400)。在一些实施方案中，所述孔将会相隔300 μ m，并且将会在形状上是圆柱形的(具有40 μ m的直径和35 μ m的深度)。
[0084]图15是图解说明计算机系统的方框图，本教导的实施方案可在所述计算机系统上实施。
[0085]图16是用于施行本发明的方法的自动化系统的示意图。
[0086]图17是通道“芯片”的顶视示意图。
[0087]发明详述
[0088]定义:
[0089]固体支持物:如本文中所使用的，术语“固体支持物”是指可以在其上可以合成和/或固定聚合物例如核酸分子的多孔或无孔材料。如本文中所使用的，“多孔(的)”意味着所述材料包含可以具有不均一或均一的直径(例如在rim范围内)的孔。多孔材料包括纸张、合成滤纸，等等。在这样的多孔材料中，反应可以在孔内发生。固体支持物可以具有许多形状中的任一种，例如针状、条状、片状、盘状、棒状、纤维状、弯曲状、圆柱体结构、平面表面、凹或凸表面或者毛细管或柱子。固体支持物可以是颗粒，包括珠粒、微颗粒、纳米颗粒等。固体支持物可以是具有类似大小的非珠粒类型的颗粒(例如，纤丝)。支持物可以具有可变的宽度和大小。例如，可以在本发明的实施中使用的珠粒(例如，磁性珠粒)的大小描述在本文别处。支持物可以是亲水的或可能被变成亲水的，并且包括无机粉末例如二氧化硅、硫酸镁和氧化铝；天然的聚合材料，特别是纤维素材料；和源自纤维素的材料，例如包含纤维的纸张，例如滤纸、色谱纸等。
[0090]在一些实施方案中，固体支持物可以是可碎片化的。固体材料可以是合成的或经修饰的天然出现的聚合物，例如硝化纤维素、碳、乙酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、玻璃、受控孔径玻璃、磁性受控孔径玻璃、磁性珠粒、陶瓷、金属等；其要么单独地进行使用，要么与其他材料一同进行使用
[0091]在一些实施方案中，支持物可以是芯片、阵列、微阵列或微孔平板形式。在许多情况下，通过本发明的方法产生的支持物将会是这样的支持物，在所述支持物中，独个核酸分子在分开的或不连续的区域上合成从而在所述支持物上产生特征部位(features)(即，包含独个核酸分子的位置)。
[0092]在一些实施方案中，选择所定义的特征部位的大小以允许在所述特征部位上形成微体积小滴或反应体积，其中每个小滴或反应体积互相保持分开。如本文所描述的，特征部位，通常地，但并不需要，被特征部位间(interfeature)空间分开,从而确保小滴或反应体积或者两个相邻特征部位之间不融合。通常地，特征部位间空间在其表面上将不携带任何核酸分子，并且将会相应于惰性空间。在一些实施方案中，特征部位和特征部位间空间可以因其亲水性或疏水性特性而不同。在一些实施方案中，特征部位和特征部位间空间可以包含改性剂。在本发明的一个实施方案中，所述特征部位是孔或微孔或凹槽。
[0093]可以将核酸分子共价或非共价地附着至表面或者沉积在表面上。
[0094]在本发明的一个实施方案中，模块I可以涉及使用多于一个的固体支持物。在一些实施方案中，可以在平板上布置两个或更多个固体支持物。可以采用固体支持物的任何布置，例如行或列或其组合。例如，行可以是对齐的和/或列可以是对齐的。在其他实施方案中，行和/或列是相等地间隔和交错的。在行之间和/或在列之间的间距可以是可变的。包含在例如平板中的固体支持物的数目可以是可变的。在一些实施方案中，平板可以包含多达1536个(或更多个)固体支持物。
[0095]核酸分子:如本文中所使用的，术语“核酸分子”是指核苷酸或碱基(例如，核糖核苷酸，对于RNA ;和脱氧核糖核苷酸，对于DNA ;但还包括DNA/RNA杂合体，其中DNA在分开的链中或在相同的链中)的共价连接的序列，其中一个核苷酸的戊糖的3’位置通过磷酸二酯键而连接至下一个核苷酸的戊糖的5’位置。核酸分子可以是单链或双链的或者部分双链的。核酸分子可以以线性或环化形式(在用平头或粘性末端进行的超螺旋的或松弛的形成中)出现，并且可以包含“切口”。核酸分子可以由完全互补的单链或者形成至少一个碱基错配的部分互补的单链组成。核酸分子可以进一步包含两个自我互补的序列，其可以形成双链茎区，所述双链茎区任选地在一个末端处通过环序列而分开。包含双链茎区的核酸分子的两个区域基本上是相互互补的，这导致自我杂交。然而，茎可以包括一个或多个错配、插入或缺失。
[0096]核酸分子可以包含经以化学、酶促或代谢方式进行修饰的形式的核酸分子或其组合。化学合成的核酸分子可以是指长度通常少于或等于150个核苷酸(例如，长度为5至150，10至100，15至50个核苷酸)的核酸，而酶促合成的核酸分子可以包括更小的以及更大的核酸分子(如在本申请中别处所描述的)。核酸分子的酶促合成可以包括使用酶(例如，聚合酶、连接酶、核酸外切酶、核酸内切酶等，或其组合)的分步过程。因此，本发明部分地提供了涉及化学合成的核酸分子的酶促装配的组合物和联合方法。
[0097]核酸分子也指短的核酸分子，其常常被称为例如引物或探针。引物常常被称为用于酶促装配反应的单链起动核酸分子，而探针通常可以用于检测至少部分互补的核酸分子。核酸分子具有“5’ -末端”和“3’ -末端”，因为核酸分子磷酸二酯键出现在取代的单核苷酸的戊糖环的5’碳和3’碳之间。在其处新的键将会至5’碳的核酸分子的末端为其5’末端核苷酸。在其处新的键将会至3’碳的核酸分子的末端为其3’末端核苷酸。如本文中所使用的，末端核苷酸或碱基是在3’-或5’-末端的末端位置处的核苷酸。核酸分子序列，即使在更大的核酸分子的内部(例如，在核酸分子内的序列区域)，也可以说是具有5’-和3’ -末端。[0098]概览:
[0099]本发明部分地涉及用于制备核酸分子的组合物和方法。尽管本发明具有许多方面和与之相关的变化形式，但这些方面和变化形式中的一些以概要形式呈现在图1中。
[0100]本发明的一个优点是，对于许多应用，小量的合成的核酸适合于达到所想要的目的(例如，制备微阵列，构建包含选择标记的质粒，等等)。在一些情况下，小量的核酸适合于用来进行工作，由于诸如酶促的(例如，PCR)和细胞内的扩增之类的因素。
[0101]图1的左侧显示了四个总的“模块”，其代表了本发明的一些实施方案的不同部分。这样，在一些方面，本发明涉及下列中的一个或多个:(I)核酸分子合成，(2)核酸分子的汇集，(3)众多核酸分子的装配，和/或(4)经装配的核酸的转移(例如，转移至细胞)。
[0102]关于本发明的更特别的实施方案，图1的右侧显示了与在该图的左侧中所显示的模块相关的额外细节。在许多文本块上方是以粗体表示的术语，例如“酶促的”和“细胞的”。这些术语指明了示例性的一般性手段，通过所述手段可以施行所提及的过程。正如本领域技术人员将会理解的，一些过程可以例如以化学方式、以酶促方式或在细胞中来施行。
[0103]如在图1中所显示的，模块I是指被称为“微量平行核酸分子合成”的单个过程。如在本文别处所陈述的，该过程通常将会涉及几个步骤，这些步骤将会随如何实施该过程而变化。在许多实施方案中，模块I的总体功能将会是产生众多核酸分子。可以将这些核酸分子作为组进行设计，该组待进行连接从而形成一个或多个更大的核酸分子或当与另外的核酸分子(例如，“缝合性核酸分子”)相接触时形成一个或多个更大的核酸分子。
[0104]如在图1中所显示的，模块2是指被称为“固体支持物的汇集”、“核酸分子切割”和“去保护”的过程。模块2的总体功能将会是制备用于参与一个或多个在模块3中所指出的过程的核酸分子。这常常将会意味将在序列上不同的核酸分子进行合并，并且去除对于实施一个或多个在模块3中所指出的过程来说非必需的或不希望的任何化学基团。
[0105]使用模块2作为例子，正如本领域技术人员将会认识到的，图1显示了本发明的一般性实施方案。更特别地，模块2是指固体支持物的汇集。这些支持物通常将会包含核酸分子。在一些实施方案中，可以以没有固体支持物的形式获得核酸分子，然后进行汇集。
[0106]如在图1中所显示的，模块3是指被称为“片段扩增和装配”、“错误校正”和“最终的装配”的过程。模块3的过程的总体功能是产生与所寻求产生的核酸分子的序列相比较而言具有高的序列保真度的经装配的核酸分子。
[0107]如在图1中所显示的，模块4是指被称为“受者细胞插入”的过程。正如本领域技术人员将会理解的，将通过本发明的方法产生的核酸分子引入到细胞中仅是一种应用。在大多数情况下，根据本发明的方法进行装配的核酸分子将会被设计用于特殊的应用。应用广泛地变化，并且包括生物燃料生产、生物除污和化学前体生产。
[0108]在一些实施方案中，可以使用具有聚乙烯基骨架的包含氨基基团的支持基体作为固体支持物。例如，可以在本发明的实践中使用通过在U.S.专利号6，335，438(其公开内容通过提及而并入本文)中所描述的方法而获得的单分散颗粒。
[0109]模块I
[0110]在本发明中，可以将核酸分子附着至固体支持物，例如颗粒或珠粒(例如，受控孔径玻璃珠)。在一个实施方案中，使用磁性微珠粒作为固体支持物。在许多情况下，可以在本发明中使用具有大的“表面/体积”比的单活化的多孔的I μ m大小微珠粒。这样的单分散颗粒的均一性质通常提供了均一的反应速率，这特别适合于在自动化学合成仪(例如，核酸分子合成仪)中的合成。最初，可以给珠粒提供反应性基团。例如，在本发明的一些实施方案中，可以使用 Dviiabeads? M-280 (Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway) ?
Dviiabeads? m-280是以许多形状出现的2.8 μ m珠粒。Μ-280珠粒往往是相当均一的、超顺磁的、包被有聚氨酯层的聚苯乙烯珠粒。这些珠粒可以用适合用于不同应用的各种化学活化基团来获得。
[0111]磁性珠粒技术描述在U.S.专利号5，512，439 (其在此通过提及而并入本文)中。
[0112]除了由CPG或磁性材料组成的那些之外的其他合成基质也可以用于本发明，并且包括由聚苯乙烯(例如，聚苯乙烯-1%二乙烯基苯、大孔聚苯乙烯和聚(乙二醇)_聚苯乙烯(PEG-PS))、聚酰胺(例如，聚酰胺粘合的硅胶)、硅胶和纤维素组成的那些。这些基质中的一些可以树脂形式得到。在许多情况下，可以将为树脂的基质置于孔中(代替珠粒或与珠粒一同)，并且可以用于核酸合成。
[0113]本领域已知其他的核酸连接方法，以及采用它们的阵列。例如，已知使用经氨或过氧化物(其朝向醚桥)活化的表面的方法。如本文别处所指明的，对于本领域中的EGA方法，已描述了羟基基团并将其用于将核酸连接至二氧化硅磁性珠粒表面。本发明包括这样的连接方法和包含它们的组合物。
[0114]在一些情况下，也可能希望使用具有凝胶样或粘性稠度或基体的半固体支持物以代替固体支持物。本发明考虑了这点，并且在合适的情况下，在此当提及固体支持物时，可以使用非固体支持物。
[0115]决定可以合成的核酸的量的因素包括，在其上发生合成的颗粒的表面面积和大小。因此，在某种程度上，可以调整支持物(例如，珠粒)参数以改变所合成的核酸的量。可在本发明的实践中使用的珠粒可以在大小方面广泛地变化，包括下列大小范围:平均直径为大约0.01 μ m至大约1，000 μ m、大约0.1 μ m至大约1，000 μ m、大约1.0 μ m至大约
1,000 μ m、大约0.01 μ m至大约400 μ m、大约0.01 μ m至大约200 μ m、大约0.01 μ m至大约100 μ m、大约0.1 μ m至大约100 μ m、大约0.1 μ m至大约50 μ m、大约1.0 μ m至大约600 μ m、大约1.0 μ m至大约400 μ m、大约1.0 μ m至大约200 μ m、大约1.0 μ m至大约100 μ m、大约
2.0 μ m至大约400 μ m、大约2.0 μ m至大约200 μ m、大约5.0 μ m至大约500 μ m,等等。
[0116]进一步地，可以使用这样的珠粒，其允许以下列量的待产生的核酸的平均量:大约 0.001纳摩尔至大约1，000纳摩尔、大约0.1纳摩尔至大约1，000纳摩尔、大约1.0纳摩尔至大约1,000纳摩尔、大约5.0纳摩尔至大约1,000纳摩尔、大约10纳摩尔至大约1,000纳摩尔、大约30纳摩尔至大约1，000纳摩尔、大约50纳摩尔至大约1，000纳摩尔、大约200纳摩尔至大约1，000纳摩尔、大约1.0纳摩尔至大约500纳摩尔、大约1.0纳摩尔至大约250纳摩尔、大约10纳摩尔至大约500纳摩尔，等等。
[0117]
【权利要求】
1.用于核酸分子的非模平板定向合成的多孔平板，所述平板包含: (a)位于所述平板的众多孔的每个孔中的磁性珠粒，和 (b)存在于一个或多个孔中的以电化学方式产生的酸， 其中所述珠粒的直径为1.0 μ m至100 μ m。
2.权利要求1的多孔平板，其中所述平板中的孔的数目为10至50，000。
3.权利要求1的多孔平板,其中每个孔的总体积为0.1 μ I至50 μ I。
4.权利要求1的多孔平板，其中每个孔可操作地与一对电极相连接。
5.权利要求1的多孔平板，其中所述平板的孔与用于引入和移除试剂的微观流体通道相连接。
6.用于产生经装配的核酸分子的方法，所述方法包括: (a)合成众多核酸分子，其中以大约0.001纳摩尔至大约1，000纳摩尔的平均量在平板的孔中制备每个核酸分子； (b)将在(a)中产生的核酸分子进行合并，从而产生汇集物； (c)将一些或所有存在于在(b)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的核酸分子； (d)从在(c)中形成的所述众多更大的核酸分子中去除包含序列错误的核酸分子，从而产生校正了错误的核酸分子汇集物；和 (e)将在所述校正了错误的核酸分子汇集物中的核酸分子进行装配，从而形成经装配的核酸分子。
7.权利要求6的方法，其中(c)中的连接由聚合酶链式反应和/或连接酶来介导。
8.权利要求6的方法，其中所述经装配的核酸分子由至少五个核酸分子组成。
9.权利要求6的方法，其中所述经装配的核酸分子由五至五千个核酸分子组成。
10.权利要求6的方法，其中所述经装配的核酸分子具有至少20千碱基。
11.权利要求6的方法，其中所述经装配的核酸分子具有10千碱基至I兆碱基。
12.权利要求6的方法，其中所述经装配的核酸分子是闭合的、环状的。
13.权利要求12的方法，其中所述经装配的核酸分子为质粒。
14.权利要求6的方法，其中同时形成两个或更多个经装配的核酸分子。
15.权利要求6的方法，其中在校正了错误的核酸分子汇集物中的核酸分子的装配在真菌细胞中发生。
16.权利要求6的方法，其中将在(c)或(e)之一或两者中产生的经装配的核酸分子装配和引入到克隆载体中。
17.用于产生产物核酸分子的方法，所述方法包括: (a)设计大小为10千碱基至500千碱基的产物核酸分子，其中所述产物核酸分子通过核苷酸序列来进行定义； (b)合成众多在核苷酸序列方面不同的独个核酸分子，其中合成每个独个核酸分子以制备1.0 X IO7至1.0 X IO9个拷贝的数量，并且其中所述独个核酸分子能够与一个或多个其他独个核酸分子杂交； (C)在一定的条件下将在(b)中合成的独个核酸分子进行合并，所述条件允许所述独个核酸分子在允许形成至少一个更大的核酸分子的条件下进行杂交；和(d)将在(c)中形成的所述至少一个更大的核酸分子与一个或多个另外的核酸分子进行合并，从而形成产物核酸分子，其中所述产物核酸分子包含少于一个的序列错误/千碱基。
18.权利要求17的方法，其中所述产物核酸分子具有选自下列的大小: (a)10千碱基至300千碱基； (b)10千碱基至200千碱基； (c)10千碱基至100千碱基；和 (d)10千碱基至50千碱基。
19.权利要求17的方法，其中在步骤(b)之后采用错误校正程序。
20.权利要求17的方法，其中合成每个独个核酸分子以制备选自下列的数量:
(a)5.0XlO4M 1.0X IO9 个拷贝；
(b)1.0X IO6 至 1.0X IO9 个拷贝；
(c)1.0X IO7 至 1.0X IO8 个拷贝；
(d)2.0 X IO7 至 1.0X IO9 个拷贝；
(e)5.0 X IO7 至 1.0X IO9 个拷贝；
(f)7.0 X IO7 至 1.0X IO9 个拷贝；
(g)2.0 X IO7 至 8.0 X IO8 个拷贝；和
(h)2.0 X IO7 至 5.0 X IO8 个拷贝。
21.权利要求17的方法，其中使用聚合酶链式反应来扩增在步骤(c)中形成的所述至少一个更大的核酸分子。
22.权利要求17的方法，其中所述产物核酸分子是可自我复制的。
23.权利要求22的方法，其中所述可自我复制的核酸分子为质粒。
24.权利要求17的方法，其中在珠粒上合成所述独个核酸分子，其中每个珠粒包含在孔中。
25.权利要求17的方法，其中所述珠粒具有选自下列的大小: (a)5 μ m至100 μ m的直径；
(b)20 μ m 至 100 μ m 的直径； (c)5 μ m至60 μ m的直径；和 (Cl)IOym至 IOOym 的直径。
26.用于产生自我复制性核酸分子的方法，所述方法包括: (a)合成众多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制备每个核酸分子； (b)将一些或所有存在于在(a)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的核酸分子；和 (C)将所述众多更大的核酸分子进行装配，从而形成自我复制性核酸分子。
27.权利要求26的方法，其中所述自我复制性核酸分子为染色体或质粒。
28.权利要求26的方法，其中所述自我复制性核酸分子为基因组。
29.权利要求28的方法，其中所述基因组为病毒基因组、核基因组、细胞器基因组或原核细胞的基因组。
30.用于合成和装配编码多于一种的表达产物的核酸分子的方法，所述方法包括:(a)合成众多 核酸分子，其中以微量制备每个核酸分子； (b)将一些或所有存在于在(a)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的核酸分子；和 (C)将所述众多更大的核酸分子进行装配，从而形成编码多于一种的表达产物的核酸分子。
31.权利要求30的方法，其中所述多于一种的表达产物为在相同的生物学途径中所牵涉的蛋白质。
32.权利要求31的方法，其中所述多于一种的表达产物为在相同的生物学途径中所牵涉的蛋白质，所述在相同的生物学途径中所牵涉的蛋白质为催化在生物学途径中的一系列化学反应的酶。
33.权利要求32的方法，其中所述在相同的生物学途径中的化学反应为顺次反应。
34.权利要求30的方法，其中所述生物学途径导致选自下列的终产物: (a)生物燃料前体； (b)抗生素或抗生素前体； (C)食物组分； (d)化学中间体；和 (e)工业酶。
35.权利要求34的方法，其中所述生物燃料前体为选自下列的醇: (a)丁醇； (b)戊醇； (C)己醇； (d)庚醇；和 (e)辛醇。
36.权利要求34的方法，其中所述食物组分为选自下列的氨基酸: (a)L-赖氨酸； (b)L-苏氨酸； (c)L-甲硫氨酸； (d)L-亮氨酸； (e)L-异亮氨酸； (f)L-纟颜氨酸；和 (g)高丝氨酸。
37.权利要求30的方法，其中将所述经装配的核酸分子引入到原核细胞中。
38.权利要求37的方法,其中所述原核细胞为棒杆菌属(Corynebacterium)细菌。
39.权利要求37的方法,其中所述棒杆菌属细菌为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
40.用通过处理器可执行的指令进行编码的、非暂时性的、计算机可读的存储介质，其用于产生经装配的核酸分子，所述指令包括用于下列步骤的指令: (a)合成众多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制备每个核酸分子； (b)将在(a)中产生的核酸分子进行合并，从而产生汇集物；(c)将一些或所有存在于在(b)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的核酸分子； (d)从在(c)中形成的所述众多更大的核酸分子中去除包含序列错误的核酸分子，从而产生校正了错误的核酸分子汇集物；和 (e)将在所述校正了错误的核酸分子汇集物中的核酸分子进行装配，从而形成经装配的核酸分子。
41.用于产生经装配的核酸分子的系统，所述系统包括: -处理器；和 -用由处理器可执行的指令进行编码的存储器，所述指令用于下列步骤: (a)合成众多核酸分子，其中在平板的孔中以微量制备每个核酸分子； (b)将在(a)中产生的核酸分子进行合并，从而产生汇集物； (C)将一些或所有存在于在(b)中形成的汇集物中的核酸分子进行连接，从而形成众多更大的核酸分子； (d)从在(c)中形成的所述众多更大的核酸分子中去除包含序列错误的核酸分子，从而产生校正了错误的核酸分子汇集物；和 (e)将在所述校正了错误的核酸分子汇集物中的核酸分子进行装配，从而形成经装配的核酸分子。
【文档编号】C12N15/64GK103945931SQ201280057089
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年9月26日 优先权日:2011年9月26日
【发明者】T·彼得森, A·特里弗泽, T·珀米墨尔 申请人:基因技术股份公司