专利名称：用于培养羊膜来源间充质干细胞的培养基组合物和用其培养羊膜来源间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于培养间充质干细胞的培养基，更特别涉及一种用于培养间充质干细胞的培养基组合物和使用所述培养基组合物培养间充质干细胞的方法，其中所述培养基组合物含有基础培养基、L-抗坏血酸2-磷酸盐、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、非必需氨基酸(NEAA)、胰岛素、N-乙酰基-L-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。
背景技术：
干细胞是指不仅具有自我复制能力而且还具有分化为至少两种细胞的能力的细胞，并且可分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stemcell)和多向干细胞(multipotent stem cell)。成体干细胞通过从各种人器官获取细胞并使细胞发育成干细胞而获得，成体干细胞的特点是它们仅分化为特定组织。然而，近来将成体干细胞分化为包括肝细胞在内的多种组织的实验获得了巨大成功，成为众目之焦点。多向干细胞最初分离自成体骨髓(Y.Jiang等人，Nature，418:41，2002)，随后在其他几种成体组织中也有发现(C.M.Verfaillie, Trends Cell Biol.，12:502，2002)。换句话说，骨髓是最广为人知的干细胞源，多功能性干细胞也发现于皮肤、血管、肌肉和脑中(J.G.Toma 等人，Nat.Cell Biol., 3:778, 2001 ;M.Sampaolesi 等人，Science, 301:487，2003; Y.Jiang 等人，Exp.Hemato1.，30:896，2002)。然而，干细胞很少存在于成体组织如骨髓中，并且没有诱导分化则该细胞难以培养，因此在不存在特定筛选的培养基的情况下难以培养。即，难以在体外维持所分离的干细胞。同时，从胎儿组织分离间充质干细胞的研究结果显示，胎儿组织中有丰富的间充质干细胞。然而，将胎儿组织用作细胞治疗剂的来源已受到伦理方面的限制。也可从作为胎儿间充质干细胞(MSCs)源的脐带血(UCB)中分离间充质干细胞，但是它们的数量非常少，且且显示出弱的增殖性。近年来，已知间充质干细胞存在于羊膜(羊膜内膜(amniotic liningmembrane))中，即，胎盘和发育的哺乳动物胚胎周围的最内薄膜凹陷(thin innermostmembrane sag)。因此，已经开发了分离和培养该间充质干细胞的技术(PCT国际专利公开W02006/019357，韩国专利注册号 0795708 和 0818214)。然而，培养羊膜来源的干细胞的常规方法的缺点是干细胞增殖的时间长。因此，本发明人通过大量努力建立了一种能提高羊膜来源的干细胞的增殖率同时保持分化能力的方法，并由此发现当羊膜来源的干细胞在含有DMEM-P和KSFM-P的培养基中培养时，细胞增殖能力可得到提高同时保持分化能力，由此实现了本发明。
发明内容
抟术问是页
本发明的一个目的是提供一种用于培养间充质干细胞的培养基，其使细胞显示高增殖率同时使细胞保持分化能力。
本发明的另一个目的是提供一种使用上述培养基培养间充质干细胞的方法。
技术方案
为达到上述目的，本发明提供了一种用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其含有基础培养基、L-抗坏血酸2-磷酸盐、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、非必需氨基酸(NEAA)、胰岛素、N-乙酰基-L-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。
本发明还提供一种用于培养间充质干细胞的方法，所述方法包括在上述培养基组合物中培养间充质干细胞。
通过以下详细描述和所附权利要求使本发明的其他特征和实施方案更明显。
图1显示了在DMEM-P、KSFM-P或DMEM-P和KSFM-P的混合培养基中培养3天的羊膜来源间充质干细胞的图片。
图2是在DMEM-P、KSFM-P或DMEM-P和KSFM-P的混合培养基中培养4天的羊膜来源间充质干细胞的图片。
图3显示了各组针对⑶31的流式细胞分析结果。
图4显示了各组针对⑶34的流式细胞分析结果。
图5显示了各组针对⑶45的流式细胞分析结果。
图6显示了各组针对⑶29的流式细胞分析结果。
图7显示了各组针对⑶44的流式细胞分析结果。
图8显示在各组针对⑶73的流式细胞的结果。
图9显示了在DMEM-P和KSFM-P混合培养基中培养的羊膜间充质干细胞(第2组)的第I代(PD的组图。
图10显示了在DMEM-P和KSFM-P混合培养基中培养的羊膜间充质干细胞(第2组)的第2代(P2)的组图。
图11显示了在不同条件下使用菌素红S (Alizarin red s)染色分析在DMEM-P和KSFM-P混合培养基中培养的羊膜间充质干细胞(第2组)的成骨分化的结果。
图12是显示在不同条件下在DMEM-P或混合培养基(第2组)中培养且分化为骨细胞的羊膜来源间充质干细胞中茜素红S的定量浓度与对照组(其成骨分化没有被诱导)之间的比较图。
具体实施方式
在一个方面中，本发明涉及一种用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其含有基础培养基、L-抗坏血酸2-磷酸盐、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、非必需氨基酸(NEAA)、胰岛素、N-乙酰基-L-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。
在本发明中，所述基础培养基可选自由DMEM-HG、无血清角朊细胞培养基(definedkeratinocyte-SFM)和其混合物构成的组。
在本发明中，所述培养基组合物 可含有0.05-lmM的抗坏血酸2_磷酸盐、2_20%胎牛血清、l-100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(b_FGF)、1-100 μ L/ml的非必需氨基酸(NEAA)、0.1-100 u g/ml的胰岛素、0.2-20mM的N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.0l-1mM的氯化钙和5ng/ml-l u g/ml的氢化可的松。在本发明中，所述非必需氨基酸(NEAA)可由甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸构成。此外，所述非必需氨基酸(NEAA)可由750mg/L的甘氨酸、890mg/L的丙氨酸、1，320mg/L的天冬酰胺、1，330mg/L的天冬氨酸、1，470mg/L的谷氨酸、1，150mg/L的脯氨酸和1，050mg/L的丝氨酸构成。 在本发明中，所述间充质干细胞可来源于羊膜。在另一个方面中，本发明涉及一种用于培养间充质干细胞的方法，所述方法包括在上述培养基组合物中培养间充质干细胞。在本发明中，间充质干细胞可来源于羊膜。在本发明一个实施例中使用的羊膜来源间充质干细胞不是从胎盘分离的完整羊膜中提取的多种细胞，而仅仅是羊膜来源的间充质干细胞。在本发明的一个实施例中，对于分离羊膜来源的间充质干细胞的方法，羊膜组织是从分娩过程中收集的胎盘组织中分离的，分离的羊膜组织用无菌生理盐水洗涤并用手术剪尽可能地剪小。加入胶原酶溶液并与剪小的组织充分混合。将混合物放入烧瓶，其后将烧瓶在37°C、5%C02的培养箱中温育90分钟以裂解组织。使裂解的组织过滤通过细胞滤网并离心。离心后， 除去上清液，将细胞沉淀物悬浮在DMEM-P中并接种到方瓶(T-f Iask)中，然后在37°C、5%C02的培养箱中培养3-4天。接下来，仅收集附着至培养瓶上的间充质干细胞。在本发明的一个实施例中，羊膜来源的间充质干细胞在DMEM-P和KSFM-P混合培养基中的细胞增殖率比单独的DMEM-P或KSFM-P中的高。特别地，羊膜来源的间充质干细胞在由以66:33比率混合的DMEM-P和KSFM-P构成的培养基中显示最高的增殖率。实施例在下文中，将参照实施例进一步详细描述本发明。本领域普通技术人员知晓，这些实施例仅出于说明的目的而不被解释为限制本发明的范围。实施例1:从羊膜组织分离间充质干细胞本发明实施例中所用的羊膜组织分离自胎盘，将分离的组织放入含抗生素的盐水或DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium)培养基中，然后转移到实验室。在干净的工作台上，用无菌生理盐水洗涤5g羊膜组织，并且在皮氏培养皿内用手术剪将经洗涤的羊膜组织尽可能剪小。添加胶原酶溶液并与剪小的组织充分混合。将混合物放入烧瓶，然后将烧瓶在37°C、5%C02的培养箱中温育90分钟以裂解组织。在50mL管内使裂解的组织过滤通过细胞滤网并离心。离心后，除去上清液，将细胞沉淀物悬浮在DMEM-P中并接种到方瓶中，然后在37°C、5%C02的培养箱中培养3-4天。接下来，仅收集附着至培养瓶的间充质干细胞。实施例2:在DMEM-P和KSFM-P混合培养基中培养分离的羊膜间充质干细胞将实施例1中获得的羊膜来源的间充质干细胞以1.0X IO6细胞的密度分散于T175瓶中，并在由以表4所示的比率混合的DMEM-P培养基(表I)和KSFM-P培养基(表3)构成的混合培养基中培养，同时每隔2天更换培养基。培养第3天和第4天的细胞图片如图1和2所示。
表1:DMEM-P培养某的鉬分
权利要求
1.一种用于培养间充质干细胞的培养基组合物，其含有基础培养基、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、非必需氨基酸(NEAA)、胰岛素、N-乙酰基-L-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。
2.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中所述基础培养基选自DMEM-HG、无血清角朊细胞培养基及其混合物。
3.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中所述培养基组合物含有0.05-lmM的抗坏血酸-2-磷酸盐、2-20%胎牛血清、l-100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(b_FGF)、1-100 μ L/ml的非必需氨基酸(NEAA)、0.1-100 μ g/ml的胰岛素、0.2_20mM的N-乙酰基-L-半胱氨酸、0.0l-1mM的氯化I丐和5ng/ml-l μ g/ml的氢化可的松。
4.根据权利要求1或3所述的培养基组合物，其中所述非必需氨基酸(NEAA)由甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸组成。
5.根据权利要求4所述的培养基组合物，其中所述非必需氨基酸(NEAA)由750mg/L的甘氨酸、890mg/L的丙氨酸、I, 320mg/L的天冬酰胺、1，330mg/L的天冬氨酸、I, 470mg/L的谷氨酸、1，150mg/L的脯氨酸和1，050mg/L的丝氨酸组成。
6.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中所述间充质干细胞来源于羊膜。
7.一种用于培养间充质干细胞的方法，所述方法包括在权利要求1-3任一项所述的培养基组合物中培养所述 间充质干细胞。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述间充质干细胞来源于羊膜。
全文摘要
本发明涉及一种用于培养间充质干细胞的培养基，更特别涉及一种用于培养间充质干细胞的培养基组合物，并且涉及一种使用所述培养基组合物培养间充质干细胞的方法，所述培养基组合物含有基础培养基、L-抗坏血酸2-磷酸盐、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、非必需氨基酸(NEAAs)、胰岛素、N-乙酰基-L-半胱氨酸、氯化钙和氢化可的松。根据本发明，可短时间内获得干细胞治疗所需的很多间充质干细胞，并且间充质干细胞的分化能力也有所改进因而它们可用于干细胞治疗。
文档编号C12N5/02GK103154241SQ201180038199
公开日2013年6月12日 申请日期2011年7月18日 优先权日2010年7月16日
发明者罗廷灿, 姜成根, 徐宙延, 金孝银 申请人:Rnl生物技术株式会社