专利名称：透明质酸的脱乙酰基水解酶、由脱乙酰基水解酶脱乙酰化的透明质酸及其衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及透明质酸的脱乙酰基水解酶，以及使用该脱乙酰基水解酶制备的脱乙酰化的透明质酸或其衍生物。
背景技术：
透明质酸属于糖胺聚糖(GAGs)，如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素及肝素，并且透明质酸是重复单元的多阴离子天然线型聚合物，每个重复单元由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸组成。透明质酸存在于眼睛、胎盘、关节的滑液润滑剂、皮肤，以及鸡冠中。根据体内存在的位置，其分子量的范围为在IO3至IO7道尔顿的内。此外，透明质酸是细胞外基质的主要成分，并作为支架在包括表皮和真皮的皮肤的所有层中起重要作用。透明质酸还存在于滑液、脐带，以及所有高等动物的血液中，并且几乎50%的身体体内的透明质酸位于皮肤、呼吸道，以及肠道中。透明质酸是糖胺聚糖中唯一的非硫酸化的。由于透明质酸的充足的负电荷，其可结合阳离子，并吸收大量的水，在天然细胞外基质中充当渗透性缓冲液并形成水凝胶。因此，透明质酸可作为细胞外基质中的其它成分的极好的替代物，并且由于其极好的保水性，透明质酸为组织和关节提供细胞外基质水合的内稳态，且通过物理力负责抵抗压缩。此外，透明质酸参与组织之间的渗透性调节，并在关节摩擦中诱导润滑作用，且作为载体给关节的无血管区域提供营养物，或从关节的无血管区域中去除废物。因此，利用透明质酸的高吸水性和高粘度，天然存在的透明质酸自身或其衍生物(Glenn D.Prestwich, Jing-wen Kuo,Chemically-Modified HA for Therapy andRegenerative Medicine, Current Pharmaceutical Biotechnology, 9(4), 242-245(2008))已被应用于化妆品中或医学上中用于眼睛(E. A. Balazs, Μ.1. Freeman, R. Kloti, G.Meyer-Schwickerathj F. Regnaultj and D. B. Sweeney, ^Hyaluronic acid and replacementof vitreous and aqueous humor"，Mod. Probl. Ophthalmol.，10，3 21 (1972) ) 另外，发现透明质酸应用于不同的组织再生和组织工程领域，包括软骨和骨骼的再生(A. H.1sdaleiLD.Hordonj H.A.Bird,和 V.Wright,〃Intra_articular hyaluronate (Healon) : Adose-ranging study in rheumatoid arthritis and osteoarthritis' J.Drug Dev.，4，93 99 (1991) · M. Kawabataj M.1garashij R. Mikamij S. Ninomiyaj 和H. Oda，"Clinical evaluations of SLM-1O(sodium hyaluronate injection) in patientswith osteoarthritis of the knee"，Yakuri to Chiryo，21，257 283 (1993))、皮肤和软组织的再生，以及压抑组织的换肤术和整形手术，例如直接向体内注射透明质酸。尽管作为医学生物材料，透明质酸十分适用，但是由于其在体内的半衰期短，所以在许多使用上受到限制。实际上，透明质酸在体内很容易降解，半衰期比胶原更短。在不分泌淋巴液的骨骼和软骨中，透明质酸很可能通过同时与胶原和蛋白聚糖原位代谢性降解来发生降解。在皮肤和关节中，2(Γ30%的透明质酸很可能通过局部新陈代谢降解，且其余的透明质酸通过淋巴途径去除。透明质酸的组织半衰期为半天到2天或3天(J. R. Ε. Fraser, Τ.C. Laurent,和 IL B. G. Laurent, Hyaluronan:1ts nature, distribution, functions, andturnover, J.1ntern. Med.，242 (I)，27-33 (1997))。特别地，当将透明质酸植入到正常关节时，据报道透明质酸的半衰期少于I天(T. C. Laurentj和J. R. E. Fraser, Hyaluronanj FASEBJ.，6，2397-2404(1992))。在眼睛中，透明质酸的半衰期延伸至70天，在眼睛中透明质酸不与其它糖胺聚糖结合(U. B. G. Laurent，和 R. K. Reed，Turnover of hyaluronan in thetissue, Adv. Drug Delivery Rev.，7，237-56 (1991))。尽管透明质酸作为医学生物材料具有极高的潜能，但是由于在体内的迅速降解并且半衰期短，以及天然聚合物自身的机械性能低，目前透明质酸的使用受到限制。用于整形手术时，透明质酸凝胶必须在体内长时间保持需要的机械强度，并且由于其半衰期短，通常需要由具有2，00(T3，OOOkDa的超高分子量的透明质酸制备。此外，需要对透明质酸进行化学改性，并将其开发成保持透明质酸结构，但在体内不会迅速降解的衍生物，从而使透明质酸适用于各种临床目的的生物材料。已经尝试对透明质酸进行许多化学改性。例如，交联透明质酸，制备成烷基和苄基酯衍生物，或使用偶联剂改性。回顾到目前为止的研究报告已证明，通过化学改性开发的透明质酸衍生物适合作为医学用聚合物，该聚合物具有适用于靶组织、器官以及药物递送系统中的机械和化学性能。根据制药学功能，其中一些衍生物显示保持透明质酸固有的生物学功能。然而，通过化学改性很难合成具有1. 5Χ106道尔顿分子量或更高分子量的透明质酸衍生物，因为这样的高分子量聚合物有可能经受分子间缠结(Y. S. Soh，"Hyaluronic acid:properties and application'Polymer (Korea)，12，(1988))。针对上述问题，已经提出各种解决方案。例如，可以制备低分子量的透明质酸，或使用肼脱乙酰化N-乙酰-D-葡萄糖胺部分后，将获得的具有有机胺基的透明质酸进行化学改性(V. Crescenzij A. FrancescangelijD. RenierjD. Bellini，New cross-linkedand sulfated derivatives of partially deacetylated hyaluronan:Synthesis andpreliminary characterization, Biopolymers, Vol. 64，86-94 (2002). S.OertherjA-CMaurinjE. Payanj P. Hubert, F. LapicquejN. PreslejJ. Dexheimerj P.Netterj 和F. Lapicquej High Interaction alginate-hyaluronate associations by hyaluronatedeacetylation for the preparation of efficient biomaterials, Biopolymer, 54,273-281 (2000))。另外，将位于β-葡萄糖醛酸的第6位的被认为是透明质酸酶的靶位点的羧基进行化学性替换从而制备不溶于水的透明质酸凝胶(Oh EJj Kang SWj Kim BSj Jiang Gj ChoIH，Hahn SK. , Control of the molecular degradation of hyaluronic acid hydrogelsfor tissue augmentation. J Biomed Mater Res A.，86(3):685-93(2008)Hahn SKj ParkJK，Tomimatsu T，Shimoboji T., Synthesis and degradation test of hyaluronic acidhydrogels.1nt J Biol Macromol.，40 (4)，374-80 (2007) · ) 进一步地，据报道，不仅可以对重复单元的乙醇基(-0H)进行化学改性，而且还可以通过破坏糖环结构进行化学改性，并且使用羧酸基上的负电荷进行物理改性(V. Crescenzij A. Francescangelij D. Renierj D.Bellini，New hyaluronan chemical derivatives. Regioselectively C(6)oxidized products, Macromolecules, 34，6367 6372 (2001))。然而，化学脱乙酰化以及使用偶联剂的化学改性产生具有显著减小的分子量的透明质酸，其导致透明质酸固有的机械性能弱化(S. Oertherj A-C Maurinj E. Payanj P. Hubert, F. Lapicquej N. Preslej J. Dexheimerj P.Netterj 和 F. Lapicque，High Interaction alginate-hyaluronate associations byhyaluronate deacetylation for the preparation of efficient biomaterials, Biopolymer, 54，273-281 (2000))。此外,脱乙酰化或改性可能引起用于离子交联的多价金属的分离以及引入的官能团的解离，并且连同降解的透明质酸一起非常易于产生细胞毒性。另外，降低机械强度的透明质酸大大地限制了其在医学和工业领域中作为生物材料的应用，并且不能制备成各种类型的生物材料。特别地，当水凝胶、片材、薄膜、小珠、或纳米纤维作为组织工程支架应用于再生医学时，一定要保持它们的强度和形态直到引入周围的细胞到支架为止，从而迅速地构建组织。否则，它们的形态将容易瓦解，同时功效及周围组织的移植率显著下降。因此，为了保持透明质酸的必要的骨架，以用作组织工程支架以及作为细胞、蛋白质、金属和药物的载体，以及作为涂层剂，透明质酸的生物降解性和分子量必须是可调节的。另一方面，对N-乙酰-D-葡萄糖胺部分的脱乙酰基水解酶进行研究，主要研究了壳多糖脱乙酰基水解酶(CDA:E，C，3. 5.1. 41)，其催化壳多糖至壳聚糖的转化。在1936年，Watanabe报告指出动物组织中存在N-乙酰-D-葡萄糖胺的可能性，并且在1957年· S.Roseman首先从大肠杆菌菌株K-12的提取物中分离出该酶。随后，成功地从鲁氏毛霉的提取物，以及蜡状芽孢杆菌的提取物；真菌，诸如菜豆炭疽病菌、黄瓜炭疽病菌及葡枝根霉；昆虫物种；甲壳动物；以及原生动物兔脑炎原虫中分离出壳多糖脱乙酰基水解酶。另外，已报告出从鲁氏毛霉、蓝色犁头霉，及构巢曲霉中分离并纯化壳多糖脱乙酰基水解酶的研究结果。从卵形孢球托霉和酿酒酵母中成功地分离出钴-活化的壳多糖脱乙酰基水解酶(Cda2P)，并且从兔脑炎原虫、金龟子绿僵菌、及大肠杆菌和米根霉的培养基中成功地分离出壳多糖脱乙酰基水解酶。近年来，已报告从短帚霉、被孢霉属真菌DY-52、卷柄根霉，以及霍乱弧菌中分离出壳多糖脱乙酰基水解酶，但是其纯化结果尚未确定。另外，自从发现真菌的壳多糖脱乙酰酶和根瘤菌结瘤蛋白质(NodB蛋白质)之间存在结构相似性，分析了来自真菌，诸如鲁氏毛霉、菜豆炭疽病菌、酿酒酵母、卵形孢球托霉以及黑根霉中的壳多糖脱乙酰酶的序列，但尚未公布。如前所述，对多糖的脱乙酰基水解酶的研究是围绕壳多糖脱乙酰基水解酶进行的，其能够对一系列连续的N-乙酰-D-葡萄糖胺残留物具有催化作用，但不能与单糖N-乙酰-D-葡萄糖胺反应。这样的壳多糖脱乙酰基水解酶不会对肽聚糖N-乙酰化肝素和N-乙酸基半乳糖胺显不酶活性(Araki, Y. &Ito, E. (1975) · A pathway of chitosan formationin Mucor rouxii, Eur. J. Biochem. , 55, 71-78 (1975)),并且也不会催化透明质酸的 N-乙酸-D-葡萄糖胺部分的脱乙酸化(Martinou A, Kafetzopoulos D, Bouriotis V. , Chitindeacetylation by enzymatic means:monitoring of deacetylation process, Carbohyd.Res.，273，235-242 (1995))。如此，已报告指出除了对壳多糖和壳聚糖的N-乙酰基-D-葡萄糖胺具有酶活性以外，壳多糖脱乙酰基水解酶不具有酶活性。也就是说，没有在以前的任何文件中报道过对透明质酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺部分的乙酰基具有选择性的脱乙酰酶。
因此，需要研究和开发能够选择性地脱乙酰化透明质酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺部分的脱乙酰基水解酶
发明内容
技术问题本发明人研究了对透明质酸的N-こ酰-D-葡萄糖胺的こ酰基具有选择性的脱こ酰基水解酶，成功地从微生物中分离并纯化了透明质酸脱こ酰酶，并发现脱こ酰酶在制备脱こ酰化的透明质酸及其衍生物中是有用的，并且脱こ酰化的透明质酸及其衍生物在体内降解速度缓慢，最小限度的減少分子量和粘度，具有低胶凝点从而促进凝胶化，并且对人骨髓间充质干细胞的细胞活性没有影响，由此完成本发明。技术方案本发明的ー个目的在于提供从微生物中分离并纯化的透明质酸的脱こ酰基水解酶，其能够催化透明质酸的N-こ酰-D-葡萄糖胺部分上的こ酰基的选择性水解。本发明的另ー个目的在于提供脱こ酰化的透明质酸或其衍生物，该透明质酸或其衍生物通过使用本发明的透明质酸的脱こ酰基水解酶制备。有益效果根据本发明的脱こ酰化的透明质酸及其衍生物移植到体内后在初始时期不容易降解，并显示出显著地降低分子量和粘度，胶凝点低于未脱こ酰化的透明质酸，从而促进凝胶化。此外，脱乙酰化的透明质酸及其衍生物甚至在高浓度下几乎不对人骨髓间充质干细胞的细胞活性产生任何负面影响。因此，根据本发明的脱こ酰化的透明质酸及其衍生物能够用作生物材料，诸如细胞、基因和药物的载体，以及组织工程支架。
图1是从构巢曲霉中分离并纯化的透明质酸脱こ酰酶对壳多糖低聚物五-N-こ酰壳六糖的活性的色谱图。图2示出了通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析透明质酸脱こ酰酶的分离及纯化的图示[泳道1:标志物(标准分子量)，泳道2 :30%硫酸铵组分，泳道3 :Q-琼脂糖组分(未结合)，泳道4 :苯基-琼脂糖组分，泳道5 :聚丙烯酰胺葡聚糖组分]。图3示出了从短帚霉中分离并纯化的脱こ酰酶的水性HPLC色谱图。图4示出了通过SDS-PAGE分析的从短帚霉中分离的脱こ酰酶的图示。图5示出了通过双向电泳系统分析的从短帚霉中分离并纯化的脱こ酰酶的Pl值。图6示出了未脱こ酰化的和通过透明质酸酶脱こ酰化的透明质酸的降解率的图
/Jn o图7是表示通过凝胶电泳测量的以酶法和化学方法脱こ酰化的透明质酸的分子量的图示。图8是表示以酶法和化学方法脱こ酰化的透明质酸的粘度的流变图。图9是表示根据与P -磷酸缩水甘油酯相互作用的以酶法和化学方法脱こ酰化的透明质酸的粘弾性图。图10示出了脱乙酰化的透明质酸对壳聚糖/ P -磷酸缩水甘油酯的凝胶化的影响[(a)不存在脱乙酰化的透明质酸，(b)存在脱乙酰化的透明质酸]。图11示出了人骨髓间充质干细胞的显微图像，该人骨髓间充质干细胞示出了随着未脱乙酰化的透明质酸和脱こ酰化的透明质酸的浓度变化的形态变化。图12示出了随着未脱乙酰化的和脱乙酰化的透明质酸的浓度以及培养时间改变的人骨髓间充质干细胞的细胞活性的图示。
具体实施例方式根据本发明的一方面，本发明提供了透明质酸的脱こ酰基水解酶，其能够催化透明质酸的N-こ酰-D-葡萄糖胺上的こ酰基的选择性水解。根据本发明的另一方面，本发明提供了通过脱こ酰基水解酶脱こ酰化的透明质酸及其衍生物。以下，对本发明进行详细说明。本发明的脱こ酰基水解酶从微生物中分离并纯化，且对透明质酸的N-こ酰-D-葡萄糖胺部分上的こ酰基进行选择性地水解。微生物的例子包括构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、短帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)、鲁氏毛霉(Mucor rouxii)、腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、卵形抱球托霉(Gongronella butleri)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、兔脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi )、金龟子绿僵菌(Metarhiziumani sop Iiae)、肺炎链球菌(Streptococus pneumoniae)、被抱霉属真菌 DY_52( Morti ere I Iasp. DY-52)、卷柄根霉(Rhizopus circinans),以及霍乱弧菌(Vibrio cholerae),但并不限制于此。在一个实施方案中，本发明的脱こ酰基水解酶从构巢曲霉和短帚霉中分离并纯化，并分析了从构巢曲霉中分离并纯化的脱こ酰基水解酶的核苷酸序列，并表示为SEQ ID NO:1o另 外，本发明涉及使用透明质酸的脱こ酰基水解酶制备脱こ酰化的透明质酸及其衍生物。详细地，将透明质酸或其衍生物溶于PH3. (T9. 0的缓冲液或蒸馏水，并在1(T70°C，优选在30 60° C与透明质酸的脱こ酰基水解酶一起培养0. 001 24小时，更优选培养1 10小时，最优选培养3飞小时，接着，向反应混合物中加入こ醇以沉淀脱こ酰化的透明质酸或其衍生物。关于这点，こ醇的量为反应混合物重量的疒10倍，且优选为约4 7倍。随后，使用こ醇洗涤脱こ酰化的透明质酸或其衍生物的沉淀物，将其溶于蒸馏水，并在冷冻干燥前使用蒸馏水透析。通过酶法脱こ酰化的透明质酸比化学法脱こ酰化的透明质酸具有更高的脱こ酰化程度证明了与化学方法相比，本发明的脱こ酰基水解酶能够更有效地从透明质酸中去除
こ酰基。发现通过透明质酸酶本发明的脱こ酰化的透明质酸在体内的初始降解速度延迟，并且最小限度的减小分子量和粘度，从而能制备具有高分子量和高粘度的脱こ酰化的透明质酸。另外，本发明的脱こ酰化的透明质酸的胶凝点低于未脱こ酰化的透明质酸，即完整的透明质酸，这表明通过阴离子的￠-磷酸缩水甘油酯和脱こ酰化的透明质酸的阳离子的游离胺基之间的相互静电作用促进脱こ酰化的透明质酸的凝胶化。根据本发明的脱こ酰化的透明质酸的浓度，观察到人骨髓间充质干细胞的形态没有显著地变化，并且人骨髓间充质干细胞的活性基本上没有受培养基中脱こ酰化的透明质酸浓度的增长的影响。
如上所述，根据本发明的脱こ酰化的透明质酸及其衍生物在体内初始降解速度延迟，最小限度的减小分子量和粘度，且具有低于未脱こ酰化的透明质酸的胶凝点以易于胶凝化，并且尽管其在细胞培养基中的浓度增加但对人骨髓间充质干细胞的细胞活性几乎没有影响。因此，根据本发明的脱こ酰化的透明质酸及其衍生物能够用作生物材料，适用于细胞、基因和药物的载体，或组织工程支架。通过以下实施例更好地理解本发明，该实施例仅在于说明，并不限制本发明。实施例1 :从构巢曲霉中分离并纯化透明质酸脱こ酰酶1、构巢曲霉的培养首先，将构巢曲霉在液体培养基[(葡萄糖5g,酵母提取物2g,蛋白胨5g,NaC15g)或(1%葡萄糖，0. 15%酵母提取物，0. 15%酪蛋白水解产物，Ix维生素溶液，Ix最低盐溶液，0. 5%壳多糖)，总体积为1L]或在平板培养基[3%蔗糖，0. 2%NaN03,1%K2HP04, 0 . 05%KC1, 0. 05% MgSO4]中在5 40° C下培养4 2，400小时。然后在液体培养基[(NaNO3 2g，K2HPO4 lg, KC10. 5g, MgSO4 0. 5g，蛋白胨 lg，壳多糖(TlOg)或(1% 葡萄糖，0. 15%酵母提取物，0. 15%酪蛋白水解产物，Ix维生素溶液，Ix最低盐溶液，0. 5%壳多糖)]或在平板培养基[3% 蔗糖，0. 2%NaN03,1%K2HP04,0 . 05%KC1,0. 05%MgS04]中在 5 40° C下，以I 1，OOOrpm震荡培养4 200小时。所述维生素溶液包含15. 2%NaN03，2. 6%MgS04，15. 2%K2HP04, 2. 6%KC1，0. 04%ZnCl2，0. 4% (NH4) 2Mo7024，0. 001%MnCl2，0. 03%CuS04,以及
0.001%FeS04,并且姆5OOmL的所述最低盐溶液中包含核黄素50mg、对氨基苯甲酸250mg、盐酸批卩多醇250mg、生物素2mg、抗坏血酸250mg、叶酸250mg、硫胺素250mg以及烟酸50mg。对于细胞内酶蛋白，通过超声波处理破坏真菌菌丝，然后以1，00(T100，OOOxg离心分离广500分钟。使用(Tl00%梯度的硫酸铵处理上清液0. 1 48小吋。以
1,000^100, OOOxg离心分离(T500分钟后，使用0 100%梯度的硫酸铵处理上清液0.1 48小吋。以1，000^50, OOOxg离心分离1飞00分钟，获得作为沉淀物的酶。对于细胞外酶蛋白，使用0 100%硫酸铵(Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO，USA)使6L的细胞培养液饱和。以1，000^100, OOOxg离心分离(T500分钟之后，使用(Tl00%硫酸铵使上清液饱和。然后，以1，000^100, OOOxg离心分离(T500分钟，获得作为沉淀物的酶。收集获得的构巢曲霉沉淀物，并悬浮在Tris-HCl缓冲液中(pH7. 5)，使用(Tl00%硫酸铵(50mM Tris-HCl，pH7. 5)过夜透析悬浮液。2、根据硫酸铵浓度的来自构巢曲霉培养物的沉淀物的酶的脱こ酰化活性通过测定由五-N-こ酰壳六糖的酶解产生的醋酸根离子水平分析根据硫酸铵浓度的来自构巢曲霉培养物的沉淀物的酶的脱こ酰化活性。关于这点，使用酶偶联法，通过测量从糖中分离的游离醋酸盐离子的水平来检测脱こ酰化的程度。在醋酸试剂盒(ENZYTEC )中，如以下反应流程所示，通过脱こ酰酶的酶促作用释放醋酸根离子，并且在ACS、CS和MDH的存在条件下与共存的化学计量的NADH的产物连续反应。在吸光度340nm下用消光系数e34(l=6. 31mM^cm^对NADH进行定量分析。醋酸盐 +ATP+CoAACS —こ酰基-CoA+AMP+PPiこ酸基-CoA+草酸こ酸盐+H2O---CS —朽1樣酸盐+CoAL-苹果酸盐 +NAD+ — L-MDH —草酰こ酸盐 +NADH+H+作为对照，将包含在醋酸试剂盒中的330 ii L的TEA (三こ醇胺)缓冲液，67 ii L的ATP/CoA/NAD溶液，4 y L的MDH/CS溶液，7 y L的ACS溶液按顺序连续地加入到1. 5mL e_管中，并且使用蒸馏水填充该管使其总体积达到lmL。在25° C下培养30分钟后，将反应物转移到 96-孔板中，并利用酶标仪(SpecUtiiVIax '' M2, Molecular Devices, USA)在 340nm 下測量吸光度。当使用五-こ酰壳六糖作为基质进行测量时，根据硫酸铵浓度的来自构巢曲霉培养物的沉淀物的脱こ酰化活性总结在以下表I中。表I
权利要求
1.一种透明质酸的脱乙酰基水解酶，所述透明质酸的脱乙酰基水解酶从微生物中分离并纯化，其能够催化存在于透明质酸的N-乙酰-D-葡萄糖胺上的乙酰基的选择性水解。
2.根据权利要求1所述的透明质酸的脱乙酰基水解酶，其中所述微生物选自由构巢曲霉、短帝霉、鲁氏毛霉、腊状牙抱杆囷、黄瓜炭痕病囷、葡枝根霉、监色舉头霉、卵形抱球托霉、酿酒酵母、兔脑炎原虫、金龟子绿僵菌、肺炎链球菌、被孢霉属真菌DY-52、卷柄根霉、霍乱弧菌，以及其组合构成的组中。
3.根据权利要求1所述的透明质酸的脱乙酰基水解酶，所述透明质酸的脱乙酰基水解酶由具有SEQ ID N01的核苷酸序列的基因编码，所述基因从构巢曲霉中分离。
4.一种脱乙酰化的透明质酸或其衍生物，所述脱乙酰化的透明质酸或其衍生物使用权利要求I所述的透明质酸的脱乙酰基水解酶制备。
5.一种权利要求4所述的脱乙酰化的透明质酸或其衍生物的制备方法，所述方法包括将透明质酸或其衍生物溶解于pH 3. (T9. O的缓冲液或蒸馏水中，并且在权利要求1所述的透明质酸的脱乙酰基水解酶存在的条件下，将溶液在10 70°(培养0.00广24小时。
6.一种包含权利要求4所述的脱乙酰化的透明质酸或其衍生物的用于细胞、基因或药物的载体。
7.一种包含权利要求4所述的脱乙酰化的透明质酸或其衍生物的组织工程支架。
全文摘要
本发明涉及透明质酸的脱乙酰基水解酶，由该酶脱乙酰化的透明质酸及其衍生物。本发明的脱乙酰化的透明质酸及其衍生物具有如下特征在活体中延迟初始分解率；最小限度地减小分子量和粘度；由于具有比未脱乙酰化的透明质酸的凝胶化温度低的凝胶化温度从而促进凝胶化；以及几乎不受培养基中脱乙酰化的透明质酸及其衍生物的浓度的增长影响的人骨髓间充质干细胞的存活率。因此，本发明的脱乙酰化的透明质酸及其衍生物作为生物成分是有用的，诸如细胞、基因、药物等的传递系统，或组织工程的支架等。
文档编号C12P19/04GK103038339SQ201180038352
公开日2013年4月10日 申请日期2011年6月10日 优先权日2010年6月11日
发明者金千皓, 金锺一 申请人:韩国原子力医学院