用于产生乙酰透明质酸的改良的方法和手段的制作方法

专利名称：用于产生乙酰透明质酸的改良的方法和手段的制作方法
专利说明用于产生乙酰透明质酸的改良的方法和手段 本发明涉及合成增加的乙酰透明质酸量的植物细胞和植物，以及用于制备这类植物的方法，也涉及借助于这些植物细胞或植物制备乙酰透明质酸的方法。在此，与野生型植物细胞或野生型植物相比较，根据本发明的植物细胞或经遗传修饰的植物具有乙酰透明质酸合成酶活性和额外的增加的谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性和增加的UDP葡萄糖脱氢酶(UDP-Glc-DH)活性。此外，本发明还涉及具有增加的乙酰透明质酸合成的植物在制备乙酰透明质酸和含有乙酰透明质酸的食物或饲料中的应用。
乙酰透明质酸是是天然存在的无支链的线性粘多糖(葡糖胺聚糖)，其由交替的葡糖醛酸和N-乙酰基-葡糖胺构成。乙酰透明质酸的结构单元由二糖葡糖醛酸-β-1，3-N-乙酰基-葡糖胺组成。在乙酰透明质酸中，这些重复单元通过β-1，4键彼此相连。
在药学中，经常使用术语透明质酸。由于在大多数情况中乙酰透明质酸作为聚阴离子而不是作为游离酸存在，因此在下文，优选使用术语乙酰透明质酸，但是每个术语都应理解为包含这两类分子形式。
乙酰透明质酸具有不寻常的理化特性，例如，诸如聚电解质的特性、粘弹性质、高度结合水的能力、凝胶形成的特性等，这些连同乙酰透明质酸的其它特性描述于Lapcik等的综述文章中(1998，chemical Reviews98(8)，2663-2684)。
乙酰透明质酸是脊椎动物的胞外结缔组织和体液的成分。在人类中，透明质酸由所有体细胞的细胞膜合成，尤其是间充质细胞，并且普遍存在于体内，其中在结缔组织、胞外基质、脐带、关节液、软骨组织、皮肤和眼的玻璃体中浓度尤其地高(Bernhard Gebauer，1998，Inaugural-Dissertation，Virchow-Klinikum Medizinische

Charitéder Humboldt

zu Berlin；Fraser等，1997，Journal of InternalMedicine 242，27-33)。
最近，也在非脊椎动物生物体(软体动物)中发现了乙酰透明质酸(Volpi和Maccari，2003，Biochimie 85，619-625)。
此外，由于乙酰透明质酸是非免疫原性物质，因此一些致病性革兰氏阳性细菌(A和C组链球菌(Streptococcus))和革兰氏阴性细菌(巴斯德氏菌(Pasteurella))合成乙酰透明质酸作为外泌多糖，以保护这些细菌抵抗其宿主免疫系统的攻击。
感染小球藻(Chlorella)属单细胞绿藻的病毒(其中有些在草履虫(Paramecium)物种中作为内共生体存在)在病毒感染后赋予单细胞绿藻合成乙酰透明质酸的能力(Graves等，1999，Virology 257，15-23)。然而，合成乙酰透明质酸的能力不是所讨论藻类特有的特征。藻类合成乙酰透明质酸的能力是由病毒感染介导的，所述病毒基因组具有编码乙酰透明质酸合成酶的序列(DeAngelis，1997，Science 278，1800-1803)。此外，病毒基因组含有编码UDP-葡萄糖脱氢酶(UDP-Glc-DH)和谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFTA)的序列。UDP-Glc-DH催化用作乙酰透明质酸合成酶底物的UDP-葡糖醛酸的合成。GFTA将6-磷酸果糖和谷氨酰胺转换成葡糖胺6-磷酸，其为在例如细茵的乙酰透明质酸合成的代谢路径中的重要代谢产物。两个algeal基因都编码活性蛋白质，它们象病毒的乙酰透明质酸合成酶一样，在病毒感染的早期同时转录(DeAngelis等，1997，Science 278，1800-1803，Graves等，1999，Virology 257，15-23)。具有谷氨酰胺6-磷酸果糖酰胺转移酶(GFTA)活性的蛋白的活性既不能在没有感染病毒的细胞提取物中检测到，也不能在病毒感染的细胞中检测到(Landstein等，1998，Virology 250，388-396)。因此，在病毒感染的小球藻细胞中用于乙酰透明质酸合成的UDP-Glc-DH和GFAT表达的作用，以及它们是否为乙酰透明质酸合成所需，是不为所知的。
天然存在的植物本身在它们的基因组中没有任何编码催化乙酰透明质酸合成的蛋白质的核酸，尽管已描述并表征了大量植物碳水化合物，但是迄今尚不可能在未感染的天然存在的植物中检测到乙酰透明质酸或与乙酰透明质酸相关的分子(Graves等，1999，Virology 257，15-23)。
乙酰透明质酸合成的催化是通过单一的膜整合或膜结合酶乙酰透明质酸合成酶而实现的。可将迄今已研究的乙酰透明质酸合成酶分成两组I类乙酰透明质酸合成酶和II类乙酰透明质酸合成酶(DeAngelis，1999，CMLS，Cellular and Molecular Life Sciences 56，670-682)。
通过所鉴定的同工酶进一步对脊椎动物的乙酰透明质酸合成酶进行了区分。使用阿拉伯数字按照它们的鉴定顺序命名不同的同工酶(例如，hsHAS1、hsHAS2、hsHAS3)。
将合成的乙酰透明质酸分子穿过细胞质膜转移到细胞周围介质的机制还没有完全被阐明。较早的假说认为穿过细胞膜的转运是通过乙酰透明质酸合成酶本身实现的。然而，较新的结果表明乙酰透明质酸穿过细胞质膜的转运通过由负责这一行为的转运蛋白进行能量依赖的转运完成。因此，通过突变产生了链球菌株，该菌株中主动转运蛋白的合成被抑制了。这一菌株与相应的野生型细菌菌株相比较，合成了较少的乙酰透明质酸(Ouskova等，2004，Glycobiology 14(10)，931-938)。可以推论，在人成纤维细胞中，借助于特异抑制已知转运蛋白的试剂，有可能减少乙酰透明质酸的产量和乙酰透明质酸合成酶的活性(Prehm和Schumacher，2004，Biochemical Pharmacology 68，1401-1410)。目前还不知道其中在植物中存在的能够转运乙酰透明质酸的转运蛋白的量(如果有的话)。
乙酰透明质酸不寻常的特性提供了在各领域应用的许多可能性，例如，诸如在药物、化妆品工业、在食品和饲料的生产方面、在技术应用(例如润滑剂)方面等等。当前使用乙酰透明质酸的最重要的应用是在医学和化妆品领域(见，例如，Lapcik等，1998，Chemical Reviews 98(8)，2663-2684，Goa和Benfield，1994，Drugs 47(3)，536-566)。
在医学领域中，当前含乙酰透明质酸的产品用于关节病的关节内治疗以及眼外科的眼药。乙酰透明质酸也用于治疗赛马的关节病。另外，透明质酸是某些鼻科药的成分，例如以眼滴剂和鼻剂的形式，用于湿润干燥的粘膜。使用含乙酰透明质酸的注射用溶液作为止痛药和抗风湿药。含乙酰透明质酸或衍生的乙酰透明质酸的贴剂被用于伤口愈合。至于皮肤病，使用含乙酰透明质酸的凝胶植入物在整形外科中用于纠正皮肤变形。
对于药学应用，优选使用具有高分子量的乙酰透明质酸。
在化妆医药领域，乙酰透明质酸制品属于最适宜的皮肤填充材料。通过在有限的时间期间注射乙酰透明质酸，可消除皱纹或增加唇厚。
在化妆产品中，特别是在皮肤霜剂和化妆水中，由于其高的水结合能力，乙酰透明质酸常常用作湿润剂。
此外，还以所谓的营养保健品(nutraceuticals)(食物补充物)销售含乙酰透明质酸的制品，其也可在动物(例如狗、马)中用于关节病的预防和缓解。
用于商业目的的乙酰透明质酸目前从动物组织(公鸡鸡冠)中分离或使用细菌培养物发酵制备。
US 4,141,973描述了从公鸡鸡冠或者可选地从脐带中分离乙酰透明质酸的方法。除了乙酰透明质酸，动物组织(例如公鸡鸡冠、脐带)也含有与乙酰透明质酸有关的其他粘多糖，如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和肝素。此外，动物生物体含有特异性结合乙酰透明质酸的蛋白质(透明质酸粘素(hyaladherin))，并且其对于生物体中的大多数不同的功能是必需的，例如，诸如肝脏中乙酰透明质酸的降解，乙酰透明质酸作为前导结构用于细胞迁移、调控胞吞的功能、乙酰透明质酸在细胞表面的锚定或乙酰透明质酸网络的形成(Turley，1991，Adv Drug DeliveryRev 7，257 ff.；Laurent和Fraser，1992，FASEB J.6，183 ff.；Stamenkovic和Aruffo，1993，Methods Enzymol.245，195 ff；Knudson和Knudson，1993，FASEB 7，1233 ff.)。
用于通过细菌生产乙酰透明质酸的链球菌菌株全部是致病性细菌。在培养期间，这些细菌也产生释放到培养基中的(热原性)外毒素和溶血素(链球菌溶血素，特别是α-和β-溶血素)(Kilian，MStreptococcus andEnterococcus.在Medical Microbiology中.Greenwood，D.；Slack，RCA；Peutherer，J.F.(编辑).第16章.Churchill Livingstone，Edinburgh，UK174-188页，2002，ISBN 0443070776)。这使得通过链球菌菌株所制备的乙酰透明质酸的纯化和分离更为困难。特别是对于药物应用，制剂中外毒素和溶血素的存在是个问题。
US4,801,539描述了通过诱变的细菌菌株(兽疫链球菌(Streptococcuszooedemicus))发酵制备乙酰透明质酸。所使用的诱变的细菌菌株不再合成β-溶血素。产量达到每升培养物3.6克乙酰透明质酸。
EP 0694616描述了培养兽疫链球菌或马链球菌(Streptococcus equi)的方法，其中，在所使用的培养条件下无链球菌溶血素，但合成了增产的乙酰透明质酸。产量达到每升培养物3.5克乙酰透明质酸。
在培养期间，链球菌菌株将透明质酸酶释放到培养基中，结果在该生产系统中，在纯化期间也降低了分子量。在US 4,782,046描述了使用透明质酸酶阴性链球菌菌株或使用在培养期间抑制透明质酸酶产生的生产乙酰透明质酸的方法。所达到的产量高达每升培养物2.5克乙酰透明质酸，所达到的最大平均分子量是3.8×106Da，分子量分布在2.4×106至4.0×106。
US 20030175902和WO 03 054163描述了通过在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中异源表达类马链球菌(Streptococcus equisimilis)乙酰透明质酸合成酶制备乙酰透明质酸。为了实现生产足够量的乙酰透明质酸，除了乙酰透明质酸合成酶的异源表达，也需要在芽孢杆菌(Bacillus)细胞中同时表达UDP-葡萄糖脱氢酶。US 20030175902和WO 03 054163没有陈述在借助于枯草芽孢杆菌的生产中所获得的乙酰透明质酸的绝对量。所达到的最大平均分子量是约4.2×106。然而，该平均分子量仅是重组芽孢杆菌株所达到的，其中将编码类马链球菌乙酰透明质酸合成酶的基因和编码枯草芽孢杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶的基因整合到amyQ启动子控制下的枯草芽孢杆菌基因组中，其中同时使枯草芽孢杆菌内源的cxpY基因(其编码细胞色素P450氧化酶)失活。
WO 05 012529描述了用来自感染小球藻的病毒的编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子转化的转基因烟草植物的制备。在WO 05 012529中，一方面利用了小球藻病毒株CVHI1的乙酰透明质酸合成酶的编码核酸序列，以及在另一方面，利用了小球藻病毒株CVKA1转化烟草植物。只有在用从小球藻病毒株CVKA1分离的编码乙酰透明质酸的核酸序列转化的植物中才能证实有乙酰透明质酸的合成。对于用从小球藻病毒株CVHI1分离的编码乙酰透明质酸的核酸序列转化的烟草植物，不可能在相应的转基因植物中检测到乙酰透明质酸。在WO 05 012529中唯一能够生产乙酰透明质酸的转基因植物合成乙酰透明质酸的量被陈述为大约是每ml测定的体积4.2μg乙酰透明质酸，考虑到进行所讨论实验的说明，该量大约对应于每克植物材料鲜重产生至多12μg的乙酰透明质酸的量。
乙酰透明质酸合成酶催化从起始物UDP-N-乙酰-葡糖胺和UDP-葡糖醛酸合成乙酰透明质酸。两种提到的起始物都存在于植物细胞中。
在植物细胞中，UDP-葡糖醛酸是合成抗坏血酸的多个途径之一的代谢物(Lorence等，2004，Plant Physiol 134，1200-1205)以及是在植物细胞内质网中合成的细胞壁成分果胶和半纤维素合成的关键代谢物(Reiter，1998，Plant Physiol Biochem 36(1)，167-176)。最重要的和最经常存在的果胶单体是用UDP-葡糖醛酸合成的D-半乳糖醛酸(2004，H.W.Heldt，″PlantBiochemistry″，第3版，Academic Press，ISBN 0120883910)。此外，尤其也可能用UDP-葡糖醛酸合成UDP-木糖、UDP-阿拉伯糖、UDP-半乳糖醛酸和UDP-芹菜糖、以及用于半纤维素和果胶合成的代谢物(Seitz等，2000，Plant Journal，21(6)，537-546)。在植物细胞中，可以通过己醣磷酸代谢(尤其包括通过UDP-Glc-DH将UDP-葡萄糖转换到UDP-葡糖醛酸)，或通过氧化肌醇代谢(包括通过葡萄糖醛酸1-磷酸尿苷酰转移酶将葡萄糖醛酸1-磷酸转换到UDP-葡糖醛酸的)合成UDP-葡糖醛酸酸。合成葡萄糖醛酸的两个代谢途径显示出彼此独立存在并且在拟南芥(Arabidopsis)植物的不同组织/生长阶段是可选择的(Seitz等，2000，Plant Journal 21(6)，537-546)。所提到的两个代谢途径(己醣磷酸或氧化肌醇代谢)分别对UDP-葡糖醛酸合成的贡献还没有被阐明(

2005，PlantBiosystems 139(1)，46-49)。
酶UDP-Glc-DH催化UDP-葡萄糖到UDP-葡糖醛酸的转换。Samac等(2004，Applied Biochemistry and Biotechnology 113-116，HumanaPress，编辑Ashok Mulehandani，1167-1182)描述了在苜蓿(Alfalfa)韧皮部细胞中大豆UDP-Glc-DH的组织特异性过量表达，目的是增加在这些植物茎中的果胶含量。与相应的野生型植物相比较，UDP-Glc-DH的活性增加了200％以上；然而，相应植物生产的果胶量低于相应野生型植物生产的果胶量。所讨论的转基因植物细胞壁部分中的木糖和鼠李糖单体的量增加了，而细胞壁部分的甘露糖单体的量减少了。
在拟南芥(Arabidosis)植物中UDP-Glc-DH的组成型过量表达导致了所讨论的植物与相应的野生型植物相比的异常生长和矮小植物表型。与相应的野生型植物相比较，相应植物的细胞壁部分含有增加的甘露糖和半乳糖的量和减少的木糖、阿拉伯糖和糖醛酸的量(Roman，2004，″对多糖生物合成中UDP-Glc-DH作用的研究(Studies on The Role of UDP-Glc-DHin Polysaccharide Biosynthesis)″，博士论文，Acta UniversitatisUpsaliensis，ISBN 91-554-6088-7，ISSN 0282-7476)。因此，这些结果至少部分地否定了Samac等的结果(2004，Applied Biochemistry andBiotechnology 113-116，Humana Press，Editor Ashok Mulehandani，1167-1182)，Samac等在相应的转基因植物的细胞壁部分检测到了减少的甘露糖的量和增加的木糖的量。
为在植物细胞中合成UDP-N-乙酰葡糖胺，WO 98 35047描述了一种代谢途径，其中葡糖胺被许多连续的酶催化反应步骤转换为UDP-N-乙酰葡糖胺，这些反应步骤有代谢物N-乙酰-葡糖胺，N-乙酰-葡糖胺6-磷酸，N-乙酰-葡糖胺1-磷酸的生成。可选择的代谢途径包含果糖6-磷酸和谷氨酰胺生成葡糖胺6-磷酸的反应，葡糖胺6-磷酸随后被一些连续的酶催化反应步骤转换到UDP-N-乙酰葡糖胺，这些反应步骤有代谢物葡糖胺-1磷酸和N-乙酰-葡糖胺1-磷酸的生成。果糖6-磷酸和谷氨酰胺生成葡糖胺6-磷酸的转换通过具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性的蛋白催化(Mayer等，1968，Plant Physiol.43，1097-1107)。
WO 00 11192描述了在转基因玉米中的胚乳特异性的玉米核酸分子的过量表达，其编码具有GFAT酶活性的蛋白，目的是在具有2-氨基-葡糖酐分子的植物中合成阳离子淀粉。根据WO 00 11192的说明书，描述的代谢途径会导致2-氨基-葡糖酐被掺入淀粉中，尤其包括UDP-葡糖胺被淀粉合成酶和/或糖原合成酶掺入到淀粉中。据说能在所讨论的转基因玉米植物胚乳的面粉中检测到增加的UDP-葡糖胺的量，该植物过量表达了与质体信号肽翻译地融合的编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白的核酸分子。当具有GFAT(酶的)活性的蛋白在没有信号肽而表达时，能在相应的来自玉米胚乳组织的面粉中检测到增加的葡糖胺1-磷酸的量。在转基因植物中不可能检测到阳离子淀粉。
由于细菌必需在昂贵可控的培养条件下在密封的无菌容器中发酵(见，例如，US 4,897,349)，因此通过发酵细菌菌株生产乙酰透明质酸成本高。此外，可通过细菌菌株的发酵所生产的乙酰透明质酸的量受每种情况下存在的生产设备的限制。这方面也必需考虑，由于物理规律，发酵罐不能建成具有非常大的培养体积。这里特别提到的是，在大发酵罐中，如果有的话，从外面所加入的物质(例如细菌的必需营养源、调节pH的试剂、氧)与有效生产所需培养基的均匀混合只有用大量技术花费才可确保。
由于在动物组织中存在特异性结合乙酰透明质酸的其它粘多糖和蛋白质，因此从动物生物体中纯化乙酰透明质酸很复杂。在患者中，使用被动物蛋白质污染的含乙酰透明质酸的药物制品可导致对机体有害的免疫反应(US 4,141,973)，特别是如果患者对动物蛋白质(例如鸡卵清蛋白)过敏。此外，可从动物组织中获得的满意质量和纯度的乙酰透明质酸的量(产率)低(公鸡鸡冠0.079％w/w，EP 0144019，US 4,782,046)，这必需加工大量动物组织。从动物组织中分离乙酰透明质酸的另一个问题在于，由于动物组织也含有降解乙酰透明质酸的酶(透明质酸酶)，纯化期间乙酰透明质酸的分子量降低了。
除了所提到的透明质酸酶和外毒素，链球菌菌株也产生内毒素，当存在于药学产品中时，其危及患者的健康。在科学研究中，证明甚至市场上含乙酰透明质酸的药物产品含有可检测量的细菌内毒素(Dick等，2003，Eur J Opthalmol.13(2)，176-184)。借助于链球菌菌株所生产的乙酰透明质酸的另一个缺点是，分离的乙酰透明质酸具有比从公鸡鸡冠中分离的乙酰透明质酸更低的分子量(Lapcik等1998，Chemical Reviews 98(8)，2663-2684)。US 20030134393描述了链球菌菌株用于生产乙酰透明质酸的用途，其合成特大的乙酰透明质酸囊(超囊化)。发酵后所分离的乙酰透明质酸的分子量为9.1×106Da。然而，产率仅每升350mg。
通过细菌发酵或通过从动物组织分离生产乙酰透明质酸的一些缺点可以通过用转基因植物生产乙酰透明质酸来避免；然而，目前达到的能用转基因植物生产的乙酰透明质酸的量需要相对很大的栽培面积以生产相对大量的乙酰透明质酸。此外，从具有较低乙酰透明质酸含量的植物中分离或纯化乙酰透明质酸被认为比从具有较高乙酰透明质酸含量的植物中分离或纯化乙酰透明质酸更复杂和更昂贵。
尽管乙酰透明质酸具有不寻常的特性，但是由于其稀缺价高，即使可能的话，也是很少用于工业应用。
因此，本发明的目的是提供允许供应足够量和质量的乙酰透明质酸并且可提供甚至用于工业应用和在食物和饲料领域中应用的乙酰透明质酸的手段和方法。
该目的通过权利要求中所概述的实施方案实现。
因此，本发明涉及具有稳定地整合到其基因组中的编码乙酰透明质酸合成酶核酸分子的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物；与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞或没有经遗传修饰的野生型植物相比较，其中所述的植物细胞或所述的植物额外地具有增加的具有谷氨酰胺果糖-6磷酸酰胺转移酶(GFAT)(酶的)活性的蛋白的活性和增加的具有UDP-葡萄糖脱氢酶(UDP-Glc-DH)(酶的)活性的蛋白的活性。
在此，根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物的遗传修饰可以是任何遗传修饰，其能导致编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子稳定的整合进植物细胞或植物，以及与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞或没有经遗传修饰的野生型植物相比较，其能增加在经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物中具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性和具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性。
在本发明的上下文中，术语“野生型植物细胞”应理解为用作根据本发明经遗传修饰的植物细胞制备中的起始材料的植物细胞，即，除了引入并导致编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的稳定整合及增加具有GFAT活性的蛋白的活性和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性的遗传修饰外，它们的遗传信息与根据本发明经遗传修饰的植物细胞一致。
在本发明的上下文中，术语“野生型植物”应理解为作为根据本发明经遗传修饰的植物制备中的起始材料的植物，即，除了引入并导致编码乙酰透明质酸合成酶核酸分子的稳定整合及增加具有GFAT活性的蛋白的活性和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性的遗传修饰外，它们的遗传信息与根据本发明经遗传修饰的植物一致。
在本发明的上下文中，术语“相应的”意思是，当比较多个对象时，相互比较的所讨论对象处于相同条件下。在本发明的上下文中，在野生型植物细胞或野生型植物上下文中的术语“相应的”是指相互比较的植物细胞或植物在相同的培养条件下培养的以及它们具有相同的(栽培)年龄。
在本发明的上下文中，术语“乙酰透明质酸合成酶”(EC 2.4.1.212)应理解为是指由底物UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)和N-乙酰-葡糖胺(UDP-GlcNAc)合成乙酰透明质酸的蛋白质。根据下列反应式催化乙酰透明质酸合成 nUDP-GlcA+nUDP-GlcNAc→β-1，4-[GlcA-β-1，3-GlcNAc]n+2nUDP 特别是对于下列生物体已经描述了编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子和相应的蛋白质序列兔(家兔(Oryctolagus cuniculus))ocHas2(EMBLAB055978.1，US 20030235893)，ocHas3(EMBL AB055979.1，US20030235893)；狒狒(猎神狒狒(Papio anubis))paHas1(EMBLAY463695.1)；蛙(非洲爪蟾(Xenopus laevis))xlHas1(EMBL M22249.1，US20030235893)，xlHas2(DG42)(EMBL AF168465.1)，xlHas3(EMBLAY302252.1)；人(智人(Homo sapiens))hsHAS1(EMBL D84424.1，US20030235893)，hsHAS2(EMBL U54804.1，US 20030235893)，hsHAS3(EMBL AF232772.1，US 20030235893)；小鼠(小家鼠(Mus musculus))mmHas1(EMBL D82964.1，US 20030235893)，mmHAS2(EMBL U52524.2，US 20030235893)，mmHas3(EMBL U86408.2，US 20030235893)；牛(普通牛(Bos taurus))btHas2(EMBL AJ004951.1，US 20030235893)；鸡(红原鸡(Gallυs gallus))ggHas2(EMBL AF106940.1，US 20030235893)；大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))rnHas 1(rnHas 1(EMBL AB097568.1，Itano等，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)，rnHas2(EMBL AF008201.1)；rnHas 3(NCBI NM_172319.1，Itano等，2004，J.Biol.Chem.279(18)18679-18678)、马(家马(Equυs caballus))ecHAS2(EMBL AY056582.1，Gl23428486)、猪(小型猪(Sus scrofa))sscHAS2(NCBI NM_214053.1，Gl47522921)，sscHas 3(EMBLAB159675)、斑马鱼(Danio rerio)brHas1(EMBL AY437407)，brHas2(EMBL AF190742.1)brHas3(EMBLAF190743.1)；多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)pmHas(EMBLAF036004.2)；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)spHas(EMBL，L20853.1，L21187.1，US 6,455,304，US 20030235893)；马链球菌(Streptococcus equis)seHas(EMBL AF347022.1，AY173078.1)、乳链球菌(Streptococcus uberis)suHasA(EMBL AJ242946.2，US 20030235893)、类马链球菌(Streptococcus equisimilis)seqHas(EMBL AF023876.1，US20030235893)；硫磺矿硫化叶菌假(Sulfolobus solfataricus)ssHAS(US20030235893)、Sulfolobus tokodaii stHas(AP000988.1)、绿草履虫小球藻(Paramecium bursaria Chlorella)病毒1，cvHAS(EMBL U42580.3，PB42580，US 20030235893)。
在本发明的上下文中，术语“UDP-葡萄糖脱氢酶(UDP-Glc-DH)”(E.C.1.1.1.22)应理解为由UDP-葡萄糖(UDP-Glc)和NAD+合成UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和NADH的蛋白。催化作用根据下列反应式进行 UDP-Glc+2NAD+-→UDP-GlcA+2NADH 在本发明的上下文中，术语“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)”(E.C.2.6.1.16)(在专门的文献中也被称为葡糖胺合成酶)应该理解为由起始物谷氨酰胺和果糖6-磷酸(Fruc-6-P)合成葡糖胺6-磷酸(GlcN-6-P)的蛋白。催化作用根据下列反应式进行 谷氨酰胺+Fruc-6-P→GlcN-6-P+谷氨酸 特别在动物生物体中，能证明有两种不同的具有GFAT(酶的)活性的蛋白的同工型(在文献中分别称为GFAT-1和GFAT-2)。Hu等(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)描述了来自小鼠的各个蛋白的区别除了所讨论的具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶1(GFAT-1)和谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶2(GFAT-2)活性的蛋白在组织特异性表达上的区别外，还显示两种同工型都受到通过cAMP-依赖的蛋白激酶的磷酸化调节。具有GFAT-1(酶的)活性的蛋白的活性通过所讨论的氨基酸序列中的保守丝氨酸残基(小鼠GFAT-1丝氨酸205，GenBank登录号AF334736.1)的磷酸化而被抑制；而具有GFAT-2(酶的)活性的蛋白的活性通过所讨论的氨基酸序列中的保守丝氨酸残基(小鼠GFAT-2丝氨酸202GenBank登录号NM_013529)的磷酸化而增强。具有GFAT-1活性的蛋白和具有GFAT-2活性的蛋白两者都受到UDP-N-乙酰葡糖胺浓度依赖方式的抑制；然而，与具有GFAT-1活性的蛋白(被UDP-N-乙酰葡糖胺最多降低活性约51％或80％)相比较，具有GFAT-2活性的蛋白被UDP-N-乙酰葡糖胺的抑制较低(被UDP-N-乙酰葡糖胺最大降低活性约15％)。有迹象表明，在动物机体中具有GFAT-1活性的蛋白的抑制是基于这样的事实，即在升高的UDP-N-乙酰葡糖胺浓度下，会有所讨论蛋白的O-葡萄糖-N-乙酰葡糖胺糖基化。目前还没有完全弄清楚通过O-糖基化对蛋白质活性调节是否也发生在植物细胞中(Huber和Hardin，2004，Current Opinion in Plant Biotechnology 7，318-322)。
在本发明的上下文中，术语“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶1(GFAT-1)”应该理解为具有GFAT活性并且它的活性受到通过cAMP-依赖的蛋白激酶的磷酸化抑制的蛋白。
在本发明的上下文中，术语“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶2(GFAT-2)”应该理解为具有GFAT活性并且受到通过cAMP-依赖的蛋白激酶的磷酸化激活的蛋白。
在本发明的上下文中，术语“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)”被用作广泛的术语，包括所有具有GFAT活性的蛋白。因此，它也包括在文献中称为“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶1(GFAT-1)”或“谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶2(GFAT-2)”的蛋白，但不限于此。
在本发明上下文中，术语“具有GFAT(酶的)活性的蛋白增加的活性”意思是编码具有GFAT活性的蛋白的内源基因增加的表达和/或编码具有GFAT活性的蛋白的转录本增加的量和/或在细胞中具有GFAT活性的蛋白增加的量和/或在细胞中具有GFAT活性的蛋白增加的酶活性。
在本发明上下文中，术语“具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白增加的活性”意思是编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的内源基因增加的表达和/或编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的转录本增加的量和/或在细胞中具有UDP-Glc-DH活性的蛋白增加的量和/或在细胞中具有UDP-Glc-DH活性的蛋白增加的酶活性。
在每种情况下遇到的根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，至少在上面所提到的一种情况下意思是增加了具有GFAT(酶的)活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的酶活性。
例如可以通过测定编码具有GFAT活性的蛋白或编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的转录本的量，例如通过Northern印迹分析或RT-PCR，来检测增加的表达。这里，增加优选的意思是，与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞或没有经遗传修饰的野生型植物相比较，转录本量增加至少50％，特别地至少70％，优选地至少85％以及特别优选地至少100％。编码具有GFAT活性的蛋白或编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的转录本量的增加的也指，没有能检测得到的编码具有GFAT活性的蛋白或编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的转录本的量的植物或植物细胞在根据本发明进行遗传修饰后，具有可以检测得到的编码具有GFAT活性的蛋白和/或编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的转录本的量。
例如可以通过免疫学方法，诸如Western印迹分析、ELISA(酶联免疫吸附分析)或RIA(放射免疫分析)，来检测具有GFAT活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量的增加，这些量的增加能导致在所讨论的植物中的这些蛋白活性的增加。所属领域的技术人员已知制备特异性的与特定蛋白反应(即特异的结合到所述蛋白)的抗体的方法(见，例如，Lottspeich和Zorbas(编辑)，1998，Bioanalytik[Bioanalysis]，Spektrumakad.Verlag，Heidelberg，Berlin，ISBN 3-8274-0041-4)。一些公司(如Eurogentec，Belgium)以定购的方式提供制备这类抗体的服务。这里，蛋白的量增加优选的意思是，与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞或没有经遗传修饰的野生型植物相比较，具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量的增加至少50％，特别地至少70％，优选地至少85％以及特别优选地至少100％。具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量的增加也意思是指，没有能检测得到的具有GFAT活性的蛋白的量和/或没有能检测得到的具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量的植物或植物细胞在根据本发明进行遗传修饰后，具有可以检测得到具有GFAT活性的蛋白的量和/或可检测得到具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量。
在植物提取物中具有GFAT活性的蛋白增加的活性可以通过本领域技术人员所知的方法来测定，如，Samac等(2004，Applied Biochemistry andBiotechnology 113-116，Humana Press，Ashok Mulehandani编辑，1167-1182，ISSN 0273-2289)的方法。一般方法第6项中给出了测定具有GFAT活性的蛋白的活性量的优选方法。
在植物提取物中具有UDP-Glc-DH活性的蛋白增加的活性可以通过本领域技术人员所知的方法来测定，例如在WO 00 11192中描述的方法。一般方法第7项中给出了测定具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性量的优选方法。
具有GFAT活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白(酶的)活性的增加量的优选意思是，与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞或没有经遗传修饰的野生型植物相比较，此类蛋白活性的增加至少为50％，优选地至少70％，特别优选地至少85％以及尤其优选地至少100％。具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的(酶的)活性量的增加也意思是指，没有能检测得到的具有GFAT活性的蛋白的量和/或没有能检测得到具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性的植物或植物细胞在根据本发明进行遗传修饰后，具有可以检测得到的具有GFAT活性的蛋白的量和/或可以检测得到的具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的量。
在本发明的上下文中，术语“基因组”应理解为指植物细胞中存在的全部遗传物质。本领域技术人员已知，除了细胞核之外，其它区室(例如，质体、线粒体)也含有遗传物质。
在本发明的上下文中，术语“稳定整合的核酸分子”应理解为指核酸分子整合到植物的基因组内。稳定整合的核酸分子的特征是，在相应整合位点的复制期间，其连同与整合位点相连的宿主的核酸序列一起增殖，结果被复制的DNA链上的整合位点被与作为复制模板的链上的序列相同的核酸序列环绕。
可利用大量技术将核酸分子稳定地整合到宿主植物细胞中。这些技术包括使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化工具以T-DNA转化植物细胞，原生质体融合，DNA注射、电穿孔，使用生物射弹法引入DNA以及其他选择(综述见″Transgenic Plants″，Leandro编辑，Humana Press 2004，ISBN1-59259-827-7)。
已经深入地研究了使用农杆菌介导的植物细胞转化并且充分描述于EP 120516；Hoekema，The Binary Plant Vector System OffsetdrukkerijKanters B.V.Alblasserdam(1985)，V章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.4，1-46和An等EMBO J.4，(1985)，277-287。用于转化马铃薯的方法，参见例如Rocha-Sosa等，EMBO J.8，(1989)，29-33；用于转化番茄植物的方法，参见例如US 5,565,347。
也描述了单子叶植物的转化，使用基于农杆菌转化的载体(Chan等，Plant MoI.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等，Plant J.6，(1994)271-282；Deng等，中国科学(Science in China)33，(1990)，28-34；Wilmink等，PlantCell Reports 11，(1992)，76-80；May等，Bio/Technology 13，(1995)，486-492；Conner and Domisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。转化单子叶植物的可选系统是使用生物射弹法的转化(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104，(1994)，37-48；Vasil等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等，Plant MoI.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)，原生质体转化，部分渗透化处理过的细胞的电穿孔，用玻璃纤维导入DNA。特别是在文献中多次描述了玉米的转化(参见例如，WO95/06128，EP0513849，EP0465875，EP0292435；Fromm等，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等，Biotechnology11(1993)，194-200；Moroc等，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。也描述了其它禾本科植物，例如，诸如，柳枝稷(Panicum virgatum)的转化(Richards等，2001，Plant Cell Reporters 20，48-54)。
也描述了其它谷类植物种的成功转化，例如，大麦(Wan和Lemaux，见上；Ritala等，见上；Krens等，Nature 296，(1982)，72-74)和小麦(Nehra等，Plant J.5，(1994)，285-297；Becker等，1994，Plant Journal 5，299-307)。所有上述的方法都适合于本发明的上下文。
与现有技术相比较，根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物的优点是比只具有乙酰透明质酸合成酶活性的植物产生更高的乙酰透明质酸的量。由于从具有更高乙酰透明质酸含量的植物中分离乙酰透明质酸较不复杂和有较高的成本效率，这允许以低成本生产乙酰透明质酸。此外，与现有技术中描述的植物相比较，使用根本发明的经遗传修饰的植物需要更小的栽培面积以生产乙酰透明质酸。这使得可能提供甚至工业应用的足够量的乙酰透明质酸，而目前由于它的缺乏和高价格没有用于工业。病毒感染的小球藻(Chlorella)属植物生物体不适合生产相对大量的乙酰透明质酸。在乙酰透明质酸的生产中，病毒感染的藻类具有的缺陷在于合成乙酰透明质酸所需的基因没有稳定整合到它们的基因组中(Van Etten和Meints，1999，Annu.Rev.Microbiol.53，447-494)，所以，为生产乙酰透明质酸，需要重复地进行病毒感染。因此，也不可能分离持续合成所需质量和数量的乙酰透明质酸的单个小球藻细胞。此外，在病毒感染的小球藻藻类中，只在有限的时间段内合成乙酰透明质酸，以及由于病毒引起的裂解，仅仅在感染约8小时后，藻类就会被杀死(Van Etten等，2002，Arch Virol 147，1479-1516)。相反地，本发明提供的优点是，根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物可以通过非限制的无性繁殖或有性繁殖进行繁殖，以及它们持续的生产乙酰透明质酸。
WO 05 012529描述的具有编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的转基因植物合成相对小量的乙酰透明质酸。相反地，本发明提供的优点是，根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物合成相当更高量的乙酰透明质酸。
因此，本发明也提供了合成乙酰透明质酸的根据本发明的经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物。根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物每克植物材料鲜重(FW)优选地合成至少100，优选地至少600，特别优选地至少1000和尤其优选地至少1500μg乙酰透明质酸。
优选地，根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物每克鲜重合成最多25000μg乙酰透明质酸，优选的每克鲜重最多20000μg乙酰透明质酸，特别优选的每克鲜重最多15000μg乙酰透明质酸，尤其优选的最多每克鲜重10000μg乙酰透明质酸以及最优选的每克鲜重最多6500μg乙酰透明质酸。
为测定根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物关于鲜重的乙酰透明质酸含量，优选使用一般方法第2项描述的植物材料加工的方法和一般方法第4项描述的测定乙酰透明质酸量的方法。
本发明也提供根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其每克植物材料干重(DW)合成至少1000，优选的至少2000，特别优选的至少4000，尤其优选的至少5000μg乙酰透明质酸。为测定根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物关于干重的乙酰透明质酸含量，优选使用实施例13k)描述的植物材料的加工方法和一般方法第4项描述的测定乙酰透明质酸量的方法。
已观察到，在发育期间，乙酰透明质酸聚集在植物组织中；所以，根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物关于鲜重或关于干重的乙酰透明质酸的量特别优选的在所讨论的植物细胞或所讨论的植物收获期间或收获前数天(一或两天)测定。在此，对于乙酰透明质酸的量，特别利用了植物材料(例如块茎、种子、叶子)，其用于进一步加工。
合成乙酰透明质酸的根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物可以通过分离它们合成的乙酰透明质酸并验证其结构以鉴定。
由于植物组织具有不含有透明质酸酶的优点，可以使用简单和快速的分离方法来确定根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物中乙酰透明质酸的存在。为此，向将要检查的植物组织中添加水，然后将植物组织用机器粉碎(例如借助于，珠磨机、Warring搅拌机、榨汁机等)。如果需要的话，然后可向悬浮液中添加更多的水，接着通过离心或过滤除去细胞碎片和不溶于水的成分。然后可使用例如特异性结合乙酰透明质酸的蛋白质，证明离心后所获得的上清液中是否存在乙酰透明质酸。例如，在US 5,019,498中描述了借助于特异性结合乙酰透明质酸的蛋白质检测乙酰透明质酸的方法。可通过商业途径获得实施US 5,019,498中所述方法的检验试剂盒(例如，Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明质酸(HA)检验试剂盒，Prod.No.029-001)；也见一般方法第4项)。平行地，也可最初用透明质酸酶消化所获得的离心上清液的等分试样，然后如上所述，借助于特异性结合乙酰透明质酸的蛋白质确定是否存在乙酰透明质酸。通过平行批次中透明质酸酶的作用，降解其中存在的乙酰透明质酸，所以完全降解后，不再可能检测到显著量的乙酰透明质酸。
此外，也可使用其它分析方法进一步证实离心上清液中是否存在乙酰透明质酸，例如，诸如IR、NMR或质谱分析法。
如上面已讨论的那样，目前还不清楚在植物中用于合成UDP-葡萄糖醛酸采用哪条代谢途径(己糖磷酸或氧化肌醇代谢途径)，也不清楚两种代谢途径是否依赖植物的组织和/或发育阶段对UDP-葡萄糖醛酸的合成做了不同量的贡献。此外，在转基因植物中过量表达UDP-Glc-DH没有导致一致的结果，而且采用这种方法也不可能达到增加细胞壁中果胶含量的目的。此外，具有UDP-Glc-DH活性的蛋白活性的调节受到UDP-木糖的抑制。源自原核生物(Campbell等，1997，J.Biol.Chem.272(6)，3416-3422；Schiller等，1973，Biochim.Biophys Acta 293(1)，1-10)、动物生物体(Balduini等，1970，Biochem.J.120(4)，719-724)和植物(Hinterberg，2002，Plant Physiol.Biochem.40，1011-1017)的相关蛋白都证实了这一点。并且，来自具有UDP-Glc-DH活性的蛋白催化的反应的产物葡萄糖醛酸和NADH是调节具有GFAT活性的蛋白活性的抑制剂(Campbell等，1997，J.Biol.Chem.272(6)，3416-3422，Ordman和Kirkwood，1977，Biochim BiophysActa 482(1)25-32；Turner和Botha，2002，Archives of Biochem.Biophys.407，209-216)。
在谷物中过量表达与质体信号肽翻译地融合的具有GFAT(酶的)活性的蛋白导致了UDP-葡糖胺含量的增加，以及在谷物中具有GFAT(酶的)活性的蛋白的胞质过量表达导致了地面上胚乳组织中葡糖胺1-磷酸含量的增加。然而，UDP-葡糖胺和葡糖胺1-磷酸不是通过乙酰透明质酸合成酶合成乙酰透明质酸的起始材料。此外，已知葡糖胺对植物细胞有细胞毒性作用(Roberts等，1971，Plant Physiol.48，36-42)，以及如果在植物细胞中存在相对高的浓度，它会被转化为葡糖胺6-磷酸。葡糖胺6-磷酸同样对植物细胞有毒(WO 98 35047，US 6,444,878)。此外，已知具有GFAT活性的蛋白受到合成UDP-N-乙酰-葡糖胺另外的代谢途径形成的代谢物以抑制方式的调节。从真核生物中(动物和植物生物体)分离的具有GFAT活性的蛋白受到例如UDP-N-乙酰-葡糖胺的抑制，其中所述UDP-N-乙酰-葡糖胺是乙酰透明质酸合成酶的两个底物之一(Kornfeld，1967，J.Biol.Chem.242(13)，3135-3141；Graack等，2001，Biochem.J.360，401-412；Mayer等，1968，Plant Physiol.43，1097-1107)。具有GFAT活性的细菌蛋白受到GFAT催化的反应的直接反应产物葡糖胺-6-磷酸的抑制(Deng等，2005，Metabolic Engineering 7，201-214)。
文献没有显示有什么能限制在植物细胞中合成乙酰透明质酸的量。
因此，惊奇的发现，与(只)具有乙酰透明质酸合成酶活性的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物相比较，具有编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子和具有额外增加的GFAT活性和增加的UDP-Glc-DH活性的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物生产显著更高量的乙酰透明质酸。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明经遗传修饰的植物细胞和经遗传修饰的植物，其中，与(只)具有乙酰透明质酸合成酶活性的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物相比较，或与具有乙酰透明质酸合成酶活性但具有GFAT活性的蛋白没有增加的活性以及具有UDP-Glc-DH活性的蛋白没有增加的活性的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物相比较，能产生增加的乙酰透明质酸的量。优选地，与相应地(只)具有乙酰透明质酸合成酶活性的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物相比较，根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明的经遗传修饰的植物的关于植物材料鲜重的乙酰透明质酸产量高至少1.5倍，优选的至少5倍，特别优选的至少7.5倍以及尤其优选的至少10倍。为检测在根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物中关于植物材料鲜重的乙酰透明质酸含量的增加，优选的将根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物与相应的(只)具有活性乙酰透明质酸合成酶的植物细胞或植物比较，其中应该比较植物细胞或植物相同的材料(例如叶子，块茎)，取得这些材料的植物细胞或植物应该在相同的条件下培养，以及应该比较具有可比较的年龄(发育阶段)的植物材料的乙酰透明质酸含量。例如，不能将植物的幼叶和其它植物的老叶相比较。
在本发明的上下文中，术语“(只)具有乙酰透明质酸合成酶活性的植物细胞或植物”应该理解为经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物，其中遗传修饰在于与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞或没有经遗传修饰的野生型植物相比较，其包含编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子。
特别地，“(只)具有乙酰透明质酸合成酶活性的植物细胞或植物”的特征在于它们合成乙酰透明质酸以及除了将编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子导入到没有经遗传修饰的野生型植物细胞或没有经遗传修饰的野生型植物之外，没有其它额外的遗传修饰。优选地，这类植物具有GFAT活性的蛋白没有增加的活性，具有UDP-Glc-DH活性的蛋白也没有增加的活性。
可以借助于上面已描述过的方法测定植物细胞或植物生产的乙酰透明质酸的量，例如使用商业化测试试剂盒(例如Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明质酸(HA)检测试剂盒，Prod.No.029-001)。在本发明上下文中测定植物细胞或植物中乙酰透明质酸含量的优选的方法描述于一般方法第4项。
在本发明的另一实施方案中，根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物分别是合成乙酰透明质酸的绿色陆生植物的细胞或绿色陆生植物。
在本发明的上下文中，术语“绿色陆生植物(胚生植物)”应理解为如在Strasburger，“Lehrbuch der Botanik”植物学的教科书，34版，Spektrum Akad.Verl.，1999，(ISBN 3-8274-0779-6)中所定义的那样。
本发明的优选实施方案涉及根据本发明遗传修饰的多细胞植物的植物细胞或者根据本发明遗传修饰多细胞生物体的植物。因此，该实施方案涉及不是源自单细胞植物(原生生物)或者不是原生生物的植物细胞或植物。
根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物原则上可以分别是任何植物种类(即，单子叶植物和双子叶植物)的植物细胞和植物。优选的是作物植物，即人们为喂养人类和动物或生产生物量和/或为技术或工业目的制备底物而栽培的植物(例如谷物、稻、小麦、紫花苜蓿、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、番茄、柳枝稷(Panicum virgatum)、西米、绿豆、豆类、高粱、胡萝卜、茄子、萝卜、含油种子油菜、大豆、花生、黄瓜、南瓜、甜瓜、韭、大蒜、卷心菜、菠菜、白薯、芦笋、夏南瓜、莴苣、朝鲜蓟、甜玉米、欧洲防风草、鸦葱、菊芋、香蕉、甜菜、甘蔗、甜菜根、茎椰菜、卷心菜、洋葱、黄色甜菜、蒲公英、草莓、苹果、杏、李子、桃、葡萄藤、花椰菜、芹菜、甜柿子椒类、瑞典芜菁、大黄)。特别优选的是番茄或马铃薯植物。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其中编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的特征在于其编码病毒乙酰透明质酸合成酶。编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子优选地编码感染藻类的病毒的乙酰透明质酸合成酶。
至于感染藻类的病毒，编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子优选地编码感染小球藻的病毒的乙酰透明质酸合成酶，特别优选的是绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合成酶以及尤其优选地绿草履虫小球藻病毒株H1的乙酰透明质酸合成酶。
在进一步优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其中编码乙酰透明质酸的核酸分子的特征在于，与编码乙酰透明质酸合成酶的来源生物体的乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的密码子相比较，编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的密码子被修饰。特别优选地，如此修饰乙酰透明质酸合成酶的密码子，从而它们适应将它们整合到的基因组中的植物细胞或植物的密码子的使用频率。
由于遗传密码的简并性，氨基酸可由一个或多个密码子编码。在不同的生物体中，以不同频率使用编码氨基酸的密码子。使编码核酸序列的密码子适于它们在植物细胞或在植物中(其中将要表达的序列被整合到其基因组中)使用的频率，可有助于在特定的植物细胞或植物中增加所翻译蛋白质的量和/或有助于所讨论mRNA的稳定。对于所讨论植物细胞或植物中密码子使用的频率，可由本领域技术人员在所讨论生物体尽可能多的编码核酸序列中检查用于编码某个氨基酸的某些密码子的频率来确定。本领域技术人员已知某些生物体的密码子的使用频率，并且能使用计算机程序以简单和快速的方式确定。合适的计算机程序是公众可获得的并且特别在因特网上免费提供(例如http://gcua.schoedl.de/；http://www.kazusa.or.jp/codon/；http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html)。
可通过体外诱变或者优选地通过基因序列的从头合成，使编码核酸序列的密码子适于它们在植物细胞或在植物中(其中将要表达的序列被整合到其基因组中)使用的频率。核酸序列从头合成的方法是本领域技术人员已知的。例如，可通过最初合成单个核酸寡核苷酸，将这些与其互补的寡核苷酸杂交，使得它们形成DNA双链，然后连接分别的双链寡核苷酸，获得期望的核酸序列，从而完成从头合成。也可将核酸序列(包括密码子使用频率针对某个靶生物体的调适)的从头合成交给提供该服务的公司(Entelechon GmbH，Regensburg，德国)。
编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子优选的特征是其编码的乙酰透明质酸合成酶的氨基酸序列至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列同一。在一个特别优选的实施方案中，编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的特征是它编码具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的乙酰透明质酸合成酶。
在另一个实施方案中，编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3所示核酸序列同一。在一个特别优选的实施方案中，编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的特征是它具有SEQ ID NO 3所示核酸序列。
根据布达佩斯条约，含有编码绿草履虫小球藻病毒乙酰透明质酸合成酶的合成核酸分子的质粒IC 341-222于2004年8月25日保藏在位于德国，马斯切尔奥德尔韦格1b，38124布劳恩斯魏格的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124Brunswick，Germany)，保藏号为DSM16664。SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列可从整合到质粒IC 341-222中的核酸序列的编码区衍生，并且编码绿草履虫小球藻病毒的乙酰透明质酸合成酶。
因此，本发明也涉及根据本发明经遗传修饰的植物细胞或者根据本发明经遗传修饰的植物，其中编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的特征是，其编码氨基酸序列可从插入到质粒DSM16664中的核酸序列的编码区中衍生的蛋白质，或者它编码的蛋白至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％的氨基酸序列与可从插入到质粒DSM16664中的核酸序列的编码区中衍生的氨基酸序列同一。
本发明也涉及根据本发明经遗传修饰的植物细胞或者根据本发明经遗传修饰的植物，其中编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的特征是，它是整合到质粒DSM16664中的编码乙酰透明质酸合成酶的核酸序列，或至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与整合到质粒DSM16664中的核酸序列同一。
本发明还涉及根据本发明经遗传修饰的植物细胞或者根据本发明经遗传修饰的植物，特征是它们具有稳定整合到它们基因组的一个外源核酸分子或者稳定整合到它们基因组的多个外源核酸分子，与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞或相应的没有经遗传修饰的野生型植物相比较，所述的一个外源核酸分子或所述的多个外源核酸分子增加具有GFAT活性的蛋白的活性以及增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。
它可以是单个的外源核酸分子，通过整合到根据本发明经遗传修饰的植物细胞或者根据本发明经遗传修饰的植物中，与相应的野生型植物细胞或野生型植物相比较，增加具有GFAT活性的蛋白的活性，并同时增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。然而，也可是是多个外源核酸分子，与相应的野生型植物细胞或野生型植物相比较，一个外源核酸分子增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性并且另一个外源核酸分子增加具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。如果多个外源核酸分子整合到根据本发明经遗传修饰的植物细胞或者根据本发明经遗传修饰的植物，两个外源核酸分子可以一起在植物细胞或植物的基因组的同一位置，或者它们也可以位于植物细胞或植物的基因组的不同的位置(例如在不同的染色体上或不同的染色体区)。因此，外源核酸分子可以是根据孟德尔定律以联合基因座或以偶联的基因座遗传，或者它们也可以根据孟德尔定律以彼此独立的分别的基因座遗传。
在本发明的上下文中，术语“外源核酸分子”应该理解为这样的分子，它不在相应的野生型植物细胞中天然存在；或者它也不会在野生型植物细胞中在具体空间重排中天然存在；或者它存在于野生型植物细胞的基因组的位置中，但它不天然存在于这里。优选的，外源核酸分子是包含多个元件的重组分子，这些元件的结合或特定的空间重排不会在植物细胞中自然发生。
在本发明的上下文中，术语“重组的核酸分子”因该理解为指含有多个核酸分子的核酸分子，这些核酸分子不会如同在重组的核酸分子中存在的那样以联合方式天然存在。因此，重组的核酸分子可以是，除编码乙酰透明质酸合成酶和/或具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白质的核酸分子之外，还含有不与所提到的核酸分子天然联合存在的核酸序列。所提到的与编码乙酰透明质酸合成酶或具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子联合存在于重组的核酸分子上的其它核酸序列可以是任何序列。例如，它们可以是植物基因组的核酸序列。所提到的其它核酸序列优选是调控序列(启动子，终止信号，增强子)，特别优选在植物组织中有活性的调控序列，尤其优选组织特异的在植物组织中有活性的调控序列。产生重组核酸分子的方法为所属技术领域的技术人员所知，包含遗传工程方法，例如，诸如，通过连接反应使核酸分子连接，遗传重组或核酸分子的从头合成。(见，例如，Sambrok等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版(2001)Cold SpringHarbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY.ISBN0879695773，Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons；第5版(2002)，ISBN0471250929). 具有稳定地整合入其基因组的一个外源核酸分子或稳定地整合入其基因组的多个外源核酸分子(外源核酸分子编码乙酰透明质酸合成酶，以及与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞或没有经遗传修饰的野生型植物相比较，它们增加具有GFAT活性的蛋白的活性和增加具有UDP-Glc-DH的活性蛋白的活性)的经遗传修饰的植物细胞或经遗传修饰的植物可以分别与所述的野生型植物细胞或野生型植物相区分，尤其是通过这样一个事实，即它们分别含有不天然存在于野生型植物细胞和野生型植物的外源核酸分子，或者该分子整合到根据本发明经遗传修饰的植物或根据本发明经遗传修饰的植物细胞的基因组的位置中，它们分别不会在野生型植物细胞和野生型植物中存在在该位置，即在不同的基因组环境中。此外，这样的根据本发明经遗传修饰的植物细胞和根据本发明遗传修饰植物可以分别与没有经遗传修饰的野生型植物细胞和没有经遗传修饰的野生型植物相区分，因为根据需要，它们除了包含天然存在于野生型植物细胞或野生型植物的分子的拷贝外，还包含至少一个拷贝稳定地整合入其基因组的外源核酸分子。如果引入根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物的外源核酸分子是已经天然存在于野生型植物细胞或野生型植物的分子的附加拷贝，根据本发明经遗传修饰的植物细胞和根据本发明经遗传修饰的植物可以分别与野生型植物细胞和野生型植物相区别，特别通过这样一个事实，即该附加拷贝/这些附加拷贝位于基因组的某一位置，而在野生型植物细胞和野生型植物中它/它们分别不会定位于此。
可以通过遗传学方法和/或分子生物学方法证明核酸分子稳定整合到植物细胞或植物的基因组中。核酸分子稳定整合到植物细胞基因组或植物基因组的特征是，在遗传了所述核酸分子的后代中，稳定整合的核酸分子存在于与亲代相同的基因组环境中。可使用本领域技术人员已知的方法证明植物细胞的基因组内或植物的基因组内存在核酸序列的稳定整合，特别是借助于RFLP分析(限制性片段长度多态性)的Southern印迹分析(Nam等.，1989，The Plant Cell 1，699-705；Leister和Dean，1993，The PlantJournal 4(4)，745-750)，用基于PCR的方法，例如，诸如扩增片段长度差异的分析(扩增片段长度多态性，AFLP)(Castiglioni等，1998，Genetics 149，2039-2056；Meksem等，2001，Molecular Genetics and Genomics 265，207-214；Meyer等，1998，Molecular and General Genetics 259，150-160)或者使用借助于限制性核酸内切酶切割的扩增片段(切割扩增的多态序列，CAPS)(Konieczny和Ausubel，1993，The Plant Journal 4，403-410；Jarvis等.，1994，Plant Molecular Biology 24，685-687；Bachem等，1996，The PlantJournal 9(5)，745-753)。
原则上，外源核酸分子可以是任何在植物细胞或植物中增加具有GFAT活性的蛋白的活性和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性的核酸分子。
在本发明的上下文中，也可以通过插入诱变(综述Thorneycroft等，2001，Journal of experimental Botany 52(361)，1593-1601)制备根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物。在本发明的上下文中，插入诱变应理解为特别是指将转座子或转移DNA(T-DNA)插入到基因或基因附近区域，所述基因编码具有GFAT活性的蛋白和/或编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白，由此在所讨论的细胞中增加具有GFAT活性的蛋白的活性和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。
转座子可以是在细胞中天然存在的转座子(内源转座子)或不在所述细胞中天然存在但通过遗传工程(例如，诸如，细胞转化)引入到细胞中的转座子(异源转座子)。通过转座子修饰基因表达已为本领域技术人员所知。Ramachandran和Sundaresan(2001，Plant Physiology andBiochemistry 39，234-252)给出了在植物生物技术中利用内源或异源转座子作为工具的综述。
T-DNA插入诱变基于这样一个事实，即农杆菌Ti质粒的某些部分(T-DNA)可以整合到植物细胞基因组中。整合到植物基因组的位置是不固定的，可以整合到任何位置。如果T-DNA整合到表现出基因功能的染色体区段或其附近，就可能导致基因表达的增加，由此也可以改变所讨论的基因编码的蛋白的活性。
插入到基因组的序列(特别是转座子或T-DNA)的特征是，它们包含导致激活编码具有GFAT活性的蛋白和/或编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的基因的调控序列的序列(“激活标签”)。优选的，插入到基因组的序列(特别是转座子或T-DNA)的特征是，它们整合到植物细胞或植物基因组中编码具有GFAT活性的蛋白和/或编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的内源核酸分子附近。
例如可以利用激活标签方法(见，例如，Walden等，Plant J.(1991)，281-288；Walden等，Plant MoI.Biol.26(1994)，1521-1528)产生根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物。这一方法基于通过增强子序列对内源启动子的激活，例如，诸如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)35S RNA启动子的增强子或章鱼碱合成酶增强子。
在本发明的上下文中，术语“T-DNA激活标签”因该理解为含有增强子序列的T-DNA片段，并且通过将其整合到植物细胞基因组中，增加具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。
在本发明的上下文中，术语“转座子激活标签”因该理解为指含有增强子序列的转座子，并且通过将其整合到植物细胞基因组中，增加具有GFAT活性的蛋白和/或具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。
本发明优选的实施方案涉及到根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其特征在于至少一个外源核酸分子编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白或至少一个外源核酸分子编码具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白。
本发明特别优选的实施方案涉及到根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其特征在于，第一外源核酸分子编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白，第二外源核酸分子编码具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白。
根据本发明，编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子可以来源于任何生物体；优选地，所述核酸分子来源于细菌、真菌、动物、植物或病毒，特别优选的来源于哺乳动物或细菌，以及尤其优选的来源于小鼠或大肠杆菌(Escherichia coli)。
对于来源于动物生物体的编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子，优选利用编码具有GFAT-2(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子；特别优选的具有GFAT-2(酶的)活性的蛋白来源于小鼠。
对于病毒，编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子优选来源于感染藻类的病毒，优选来源于感染小球藻属藻类的病毒，特别优选的来源于绿草履虫小球藻病毒，以及尤其优选的来源于绿草履虫小球藻病毒H1病毒株。
代替天然存在的编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白的核酸分子，还可以将通过诱变产生的核酸分子整合到根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其中所述的诱变的外源核酸分子的特征在于它编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白，该蛋白具有降低的被代谢物(例如葡糖胺代谢)的抑制。Deng等在制备具有大肠杆菌的GFAT(酶的)活性的蛋白的示范方法中描述了这类诱变的核酸分子的制备(2005，Metabolic Engineering 7，201-214；WO 04 003175)。例如，Hu等描述了具有小鼠的GFAT活性的蛋白的突变体(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)。
根据本发明，编码具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子可以来源于任何生物体；优选地，所述核酸分子来源于细菌、真菌、动物、植物或病毒，特别优选的来源于细菌、植物或病毒，尤其优选的来源于病毒。
对于病毒，编码具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子优选来源于感染藻类的病毒，优选来源于感染小球藻属藻类的病毒，特别优选的来源于绿草履虫小球藻病毒，以及尤其优选的来源于绿草履虫小球藻病毒H1病毒株。
代替天然存在的编码具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子，还可以将通过诱变产生的核酸分子整合到根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其中所述的诱变的外源核酸分子的特征在于它编码具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白，该蛋白具有降低的被代谢物(例如葡糖醛酸代谢)的抑制。
编码具有GFAT活性的蛋白的核酸分子已为本领域技术人员所知并在文献中得以描述。因此，已描述的编码具有GFAT活性的蛋白的核酸分子来自于病毒，例如小球藻病毒k2(EMBL登录号AB107976.l)；来自于细菌，例如大肠杆菌(Dutka-Malen，1988，Biochemie 70(2)，287-290；EMBL登录号L1o328.1)；来自于真菌，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(EMBL登录号AF334737.1，watzele等，1989，J.Biol.Chem.264，8753-8758)、黑曲霉(Aspergillus niger)(EMBL登录号AY594332.1)、白色念珠菌(candida albicans)(EMBL登录号X94753.1)；来自于昆虫，例如埃及伊蚊(Aedes aegyti)(Kato等，2002，Insect.Biol.11(3)，207，216；EMBL登录号AF399922.1)、果蝇(Drosophila melangaster)(GFAT-1:EMBL登录号Y18627.1，GFAT-2:NCBI登录号NM_143360.2)；来自于草菇(Volvariella volvacea)藻类(EMBL登录号AY661466.1)；来自于脊椎动物，例如智人(Homo sapiens)(GFAT-1:EMBL登录号AF334737.1；GFAT-2:NCBI登录号BC0000l2.2，Oki等，1999，Genomics 57(2)，227-34)；小家鼠(Mus mvsculus)(GFAT-1:EMBL登录号AF334736.1；GFAT-2:EMBL登录号AB016780.1)；或来自于植物，例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)(EMBL登录号AP001297.1；cds NCBI登录号BAB03027.1)。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其中编码具有GFAT活性的蛋白的外源核酸分子选自 a)编码具有SEQ ID NO 8所示氨基酸序列的蛋白或具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的蛋白或具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的蛋白的核酸分子； b)编码蛋白的核酸分子，所述蛋白的序列至少60％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与SEQID NO 8、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 12所示氨基酸序列同一； c)包含SEQ ID NO 7所示核苷酸序列或与其互补的序列、SEQ ID NO9所示核苷酸序列或与其互补的序列、SEQ ID NO 11所示核苷酸序列或与其互补的序列或SEQ ID NO 13所示核苷酸序列或与其互补的序列的核酸分子； d)至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与a)或c)中所述核酸序列同一的核酸分子； e)在严格条件下与a)或c)所述核酸序列的至少一条链杂交的核酸分子； f)由于遗传密码子的简并性，其核苷酸序列与a)或c)所提到的核酸分子序列不同的核酸分子；以及 g)核酸分子，其是a)，b)，c)，d)，e)或f)中所提到的核酸分子的片段、等位基因变体和/或衍生物。
编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子在文献中得以描述并已为本领域技术人员所知。因此，已描述的编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子来自于病毒，例如小球藻病毒1(NCBI登录号NC_000852.3)；来自于细菌，例如大肠杆菌(EMBL登录号AF176356.1)；来自于真菌，例如黑曲霉(EMBL登录号AY594332.1)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)(EMBL ace AF405548.1)；来自于昆虫，例如果蝇(EMBL登录号AF001310.1)；来自于脊椎动物，例如智人(EMBL登录号AF061016.1)、小家鼠(EMBL登录号AF061017.1)、普通牛(Bostaurus)(EMBL登录号AF095792.1)、非洲爪蟾(Xenopυs laevis)(EMBL登录号AY762616.1)或来自于植物，例如白杨(EMBL登录号AF053973.1)、芋头(Colocasia esculenta)(EMBL登录号AY222335.1)、杜氏藻(Dunaliella salina)(EMBL登录号AY795899.1)、大豆(Glycinemax)(EMBL登录号U53418.1)。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其中编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的外源核酸分子选自 a)编码具有SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的蛋白的核酸分子； b)编码蛋白的核酸分子，所述该蛋白的序列至少60％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与SEQ ID NO 5所示氨基酸序列同一； c)包含SEQ ID NO 4所示核苷酸序列或与其互补的序列或SEQ IDNO 6所示核苷酸序列或与其互补的序列的核酸分子； d)至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与a)或c)中所述核酸序列同一的核酸分子； e)在严格条件下与a)或c)所述核酸序列的至少一条链杂交的核酸分子； f)由于遗传密码子的简并性，其核苷酸序列与a)或c)所提到的核酸分子序列不同的核酸分子；以及 g)核酸分子，其是a)，b)，c)，d)，e)或f)中所提到的核酸分子的片段、等位基因变体和/或衍生物。
在本发明的上下文中，术语“杂交”意思是在常规杂交条件下的杂交，优选的在严格条件下，例如Sambrook等(Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第二版.(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)描述的那样。特别优选地，“杂交”意思是在以下条件下的杂交 杂交缓冲液 2×SSC；10×登哈特溶液(Denhardt solution)(Fikoll400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mMNa2HPO4；250μg/ml鲱鱼(herring)精子DNA；50μg/ml tRNA；或25M磷酸钠缓冲液pH 7.2；1mM EDTA；7％SDS 杂交温度T＝65至68℃ 洗涤缓冲液0.1×SSC；0.1％SDS 洗涤温度T＝65至68℃ 与编码具有UDP-Glc-DH活性或具有GFAT活性的蛋白的核酸分子杂交的核酸分子可以源自任何生物体；因此，它们可以来源于细菌、真菌、动物、植物或病毒。
与编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子杂交的核酸分子优选的来源于感染藻类的病毒，优选的感染小球藻属藻类的病毒，特别优选的绿草履虫小球藻病毒以及尤其优选的绿草履虫小球藻病毒H1病毒株。
与编码具有GFAT活性的蛋白的核酸分子杂交的核酸分子优选的来源于哺乳动物、植物或细菌，并且尤其优选的来自小鼠或大肠杆菌。
与编码具有GFAT-1或GFAT-2活性的蛋白的核酸分子杂交的核酸分子优选的来源于真核生物，特别优选的它们来源于动物生物体，尤其优选的来源于小鼠。
与所提到的分子杂交的核酸分子可以分离自例如基因组文库或cDNA文库。这些核酸分子可以用所提到的核酸分子或这些分子的一部分或这些分子的反向互补序列来鉴定和分离，例如通过根据标准方法的杂交(见，例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)或用PCR扩增。
可以利用例如具有正好的或基本上的SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6所示核苷酸序列或这些序列的一部分的核酸分子作为用于分离编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸序列的杂交样本。
可以利用例如具有正好的或基本上的SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 13所示核苷酸序列或这些序列的一部分的核酸分子作为用于分离编码具有GFAT活性的蛋白的核酸序列的杂交样本。
用作杂交样本的片段也可以是用通常的合成技术制备的合成片段或寡核苷酸，其序列与本发明上下文描述的核酸分子基本上同一。一旦鉴定和分离了与本发明上下文所述核酸序列杂交的基因，就应该确定其序列并应该分析这一序列编码的蛋白质是否是具有GFAT、GFAT-1或GFAT-2活性或UDP-Glc-DH活性的蛋白。本领域技术人员已知，并且尤其在文献中描述了怎样确定蛋白是否具有GFAT的活性的方法(例如Mayer等，1968，Plant Physiol.43，1097-1107；Deng等，2005，Metabolic Engineering7，201-214)、GFAT-1或GFAT-2的活性的方法(例如Hu等，2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)或UDP-Glc-DH的活性的方法(例如De Luca等，1976，Connective Tissue Research 4，247-254；Bar-Peled等，2004，Biochem.J.381，131-136；Turner和Botha，2002，Archives Biochem.Biophys.407，209-216)。
与本发明上下文描述的核酸分子杂交的分子特别包含所提到的核酸分子的片段、衍生物和等位基因变体。在本发明的上下文中，术语“衍生物”的意思是这些分子的序列在一个或多个位置上与上面描述的核酸分子序列有区别并与这些序列高度同一。与上面所述的核酸分子的区别可以是，例如，因为删除、增加、替换、插入或重组。
与本发明上下文中，术语“同一性”的意思是与核酸分子的编码区全长或编码蛋白的氨基酸序列全长具有至少60％，特别的至少70％同一性，优选的至少80％，特别优选的至少90％以及尤其优选的至少95％的序列同一性。与本发明上下文中，术语“同一性”应理解为与其它蛋白/核酸相同的氨基酸/核苷酸数目，用百分数表示。优选的，借助于计算机程序，将另外的蛋白质/核酸，通过与SEQ ID NO 5所示氨基酸序列相比较确定与具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的同一性；通过与SEQ ID NO 4或SEQ IDNO 6所示核酸序列相比较确定与编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子的同一性；通过与SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 10或SEQ ID NO12所示氨基酸序列相比较确定与具有GFAT活性的蛋白的同一性以及通过与SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 11或SEQ ID NO 13所示核酸序列相比较确定与编码具有GFAT活性的蛋白的核酸分子的同一性。如果相互比较的序列长度不同，通过确定较短序列与较长序列共有的氨基酸数目的百分比来确定同一性。优选的，使用已知并公众可获得的计算机程序ClustalW(Thompson等，Nucleic Acids Research 22(1994)，4673-4680)来确定同一性。ClustalW是由European Molecular BiologyLaboratory，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，Germany的JulieThompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)而让公众可获得的。ClustalW可以在不同的互联网页面上下载，尤其是从IGBMC(Institut de Génétique et deBiologie Moléculaire et Cellulaire，B.P.163，67404 Illkirch Cedex，France；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和从EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)和EBI的所有镜像互联网页面(EuropeanBioinformatics Institute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB101SD，UK)。
优选的，应用1.8版本的ClustalW计算机程序来确定本发明上下文描述的蛋白和其它蛋白之间的同一性。在此，按以下设置参数KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，窗口＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，矩阵＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
优选的，应用1.8版本的ClustalW计算机程序来确定例如本发明上下文描述的核酸分子的核苷酸序列和其它核酸分子的核苷酸序列之间的同一性。在此，按以下设置参数 KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNA矩阵IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS未权重的。
同一性还指所讨论的核酸分子或它们编码的蛋白之间存在功能和/或结构的等同。与上面描述的分子同源并代表这些分子的衍生物的核酸分子一般是是表现出具有相同生物学功能修饰的这些分子的变化。它们可以是天然存在的变化，例如来自于其它物种的序列，或者是突变，其中这些突变可以是以自然方式或通过靶向诱变引入而发生的。此外，变化还可以是合成产生的序列。等位基因变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。衍生物的特殊形式是，例如，由于遗传密码的简并性而与本发明上下文中描述的核酸分子不同的核酸分子。
编码具有GFAT或UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子的不同衍生物具有某些共同的特征。它们可以是，例如，生物学活性或酶的活性、底物特异性、分子量、免疫反应性、构象等，也可以是物理性质，例如，诸如，在凝胶电泳中的运动性质、色谱行为、沉淀系数、溶解度、分光性质、稳定性、最佳pH、最佳温度等。具有GFAT或UDP-Glc-DH活性的蛋白的优选性质已为本领域技术人员所知，已经在上面提到并在此以类似的方式应用。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其中编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白或编码具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子的特征是，所述的核酸分子的密码子不同于编码亲代生物体的所述具有GFAT(酶的)活性的蛋白或编码亲代生物体的所述具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子的密码子。特别优选的，编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白或编码具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子的密码子被改变以适应植物细胞或植物(它们整合或将要整合到该植物的基因组中)的密码子使用频率。
此外，本发明还提供根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其中将稳定整合到植物细胞或植物基因组的编码乙酰透明质酸合成酶和/或编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白和/或编码具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子与在植物细胞中起始转录的调控元件(启动子)连接。它们可以是同源或异源启动子。启动子可以是组成型的、组织特异性的、发育特异性的或由外界因素调控的(例如使用化学物质后，通过非生物因素作用，诸如热和/或冷、干旱、疾病等)。这里，整合到根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物的基因组且编码乙酰透明质酸合成酶或具有GFAT(酶的)活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子可以在每种情况下都与相同的启动子连接，或者分别的序列可以与不同的启动子连接。这里，以任何组合的二或三种不同的启动子可以在每种情况下与相关的在根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物中编码乙酰透明质酸合成酶或具有GFAT(酶的)活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子连接。
本发明优选的实施方案涉及根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物，其中选自编码乙酰透明质酸合成酶或具有GFAT(酶的)活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子的至少一个外源核酸分子，特别优选的至少两个外源核酸分子，尤其优选的至少三个外源核酸分子，与组织特异性启动子连接。优选的组织特异性启动子是在植物的块茎、果实或种子细胞或叶子中特异性起始转录的启动子。
为表达编码乙酰透明质酸合成酶或具有GFAT(酶的)活性的蛋白或具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子，优选地将这些与确保在植物细胞中转录的调控DNA序列连接。这些特别地包括启动子。通常，在植物细胞中有活性的任一启动子都适合于表达。
这里，可以选择启动子使得表达组成型地进行，或仅在某种组织中、在植物发育的某个时间点或者在由外界因素所决定的时间点发生。对于植物和对于核酸分子这两者而言，启动子可以是同源的或异源的。
合适的启动子有，例如，用于组成型表达的花椰菜花叶病毒的35S RNA的启动子或谷物或洋丁香属(Cestrum)YLCV(黄叶卷曲病毒)的遍在蛋白启动子(WO 01 73087；Stavolone等，2003，Plant MoI.Biol.53，703-713)、用于在马铃薯中块茎特异性表达的patatin基因启动子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)或者番茄的果实特异性启动子，例如，诸如番茄多聚半乳糖醛酸酶启动子(Montgomery等，1993，Plant Cell 5，1049-1062)或番茄E8启动子(Metha等，2002，Nature Biotechnol.20(6)，613-618)或桃子ACC氧化酶启动子(Moon和Callahan，2004，J．Experimental Botany 55(402)，1519-1528)，或者确保仅在有光合活性的组织中表达的启动子，例如ST-LS1启动予(stockhaus等，Proc.Natl.Acad．Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-2451)，或者用于胚乳特异性表达的小麦HMWG启动子、USP启动子、菜豆球蛋白启动子、谷物的玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等，Cell 29(1982)，1015-1026；Quatroccio等，Plant MoI.Biol.15(1990)，81-93)、谷蛋白启动子(Leisy等，Plant MoI.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366；Yoshihara等，FEBS Lett．383(1996)，213-218)，或者shrunken-1启动子(Werr等，EMBO J.4(1985)，1373-1380)、球蛋白启动子(Nakase等，1996，Gene 170(2)，223-226)或醇溶蛋白启动子(Qu und Takaiwa，2004，Plant Biotechnology Journal 2(2)，113-125)。然而，也可能使用仅在由外界因素所决定的时间点被活化的启动子(见例如，WO9307279)。这里，对允许简单诱导的热休克蛋白的启动子可能具有特别的兴趣。此外，还可能使用种子特异性启动子，例如，诸如蚕豆(Vicia faba)的USP启动子，其确保在蚕豆和其它植物中的种子特异性表达(Fiedler等，Plant Mol.Biol.22(1993)，669-679；

等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。
也可以使用在感染藻类的病毒的基因组中存在的启动子用于在植物中表达核酸序列(Mitra等，1994，Biochem．Biophys Res Commun 204(1)，187-194；Mitra和Higgins，1994，Plant Mol Biol 26(1)，85-93，Van Etten等，2002，Arch Virol 147，1479-1516)。
在本发明的上下文中，术语“组织特异性”应理解为指表现(例如，转录的起始)基本局限于某种组织。
在本发明的上下文中，术语“块茎、果实或种子细胞”应理解为指分别在块茎、果实和种子中存在的所有细胞。
在本发明的上下文中，术语“同源启动子”应理解为天然存在于用于制备根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物的植物细胞或植物中的启动子(对于植物细胞或植物而言是同源的)或理解为调节在生物体中(从其中分离出该基因序列)基因表达的调控的启动子(对于要表达的核酸分子而言是同源的)。
在本发明的上下文中，术语“异源启动子”应理解为不是天然存在于用于制备根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物的植物细胞或植物中的启动子(对于植物细胞或植物而言是异源的)或理解为在生物体中(从其中分离要表达的基因)不天然存在以调控所述基因序列表达的启动子(对于要表达的核酸分子而言是异源的)。
此外，可存在终止序列(多腺苷酸化信号)，其用于将聚腺苷酸尾添加到转录物上。聚腺苷酸尾被认为具有稳定转录物的功能。这类元件描述于文献中(参考Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)并且可按需求互换。
在启动子和编码区之间也可存在内含子序列。这些内含子序列可导致植物中表达的稳定和提高的表达(Callis等，1987，Genes Devel.1，1183-1200；Luehrsen和Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225，81-93；Rethmeier等，1997；Plant Journal 12(4)，895-899；Rose和Beliakoff，2000，Plant Physiol.122(2)，535-542；Vasil等，1989，Plant Physiol.91，1575-1579；XU等，2003，Science in China Series C Vol.46No.6，561-569)。合适的内含子序列是，例如，玉米sh1基因的第一内含子、玉米多聚遍在蛋白基因1的第一内含子、稻EPSPS基因的第一内含子或者拟南芥(Arabidopsis)PAT1基因的前两个内含子之一。
本发明还涉及包含根据本发明经遗传修饰的植物细胞的植物。可通过从根据本发明经遗传修饰的植物细胞的再生生产这样的植物。
本发明也涉及本发明经遗传修饰的植物的可加工的或可消费的部分，其中所述本发明经遗传修饰的植物包含根据本发明经遗传修饰的植物细胞。
在本发明的上下文中，术语“可加工的部分”应理解为指用于制备食物或饲料的植物部分，其用作工业加工的原料来源，作为制备药物产品的原料来源或者作为制备美容产品的原料来源。
在本发明的上下文中，术语“可消费的部分”应理解为指用作人的食物或者用作动物饲料的植物部分。
本发明也涉及本发明经遗传修饰的植物的繁殖材料，其中所述本发明经遗传修饰的植物包含根据本发明经遗传修饰的植物细胞。
这里，术语“繁殖材料”包括适于以无性或有性方式产生后代的植物的那些成分。适于无性繁殖的是，例如，插枝、愈伤组织培养物、根茎或块茎。其它繁殖材料包括，例如，果实、种子、秧苗、原生质体、细胞培养物，等等。优选的繁殖材料是块茎、果实或种子。
在另一实施方案中，本发明涉及根据本发明经遗传修饰的植物的可收获的植物部分，诸如果实、贮藏根或其它根、花、芽、苗、叶或茎，优选种子、果实或块茎，这些可收获的部分包含根据本发明经遗传修饰的植物细胞。
优选地，本发明涉及包含乙酰透明质酸的根据本发明的繁殖材料或根据本发明的植物可收获部分。特别优选地是合成乙酰透明质酸的根据本发明的繁殖材料或根据本发明的植物可收获部分。
在本发明的上下文中，术语“马铃薯植物”或“马铃薯”应理解为指茄(Solanum)属的植物种，特别是产生块茎的茄属物种以及特别是马铃薯(Solanum tuberosum)。
在本发明的上下文中，术语“番茄植物”或“番茄”应理解为指番茄属(Lycopersicon)属的植物种，特别是番茄(Lycopersicon esculentum)。
本发明的另一个优点在于，与文献中描述的合成乙酰透明质酸的转基因植物相比较，根据本发明经遗传修饰的植物的可收获的部分、繁殖材料、可加工的部分或可消费的部分包括更多的乙酰透明质酸。因此，根据本发明经遗传修饰的植物不仅特别适于作为可分离乙酰透明质酸的原料，而且它们也可直接用作食物/饲料或用于制备具有预防或治疗特性(例如，用于骨关节炎的预防，US 6,607,745)的食物/饲料。由于根据本发明经遗传修饰的植物比文献中描述的植物的乙酰透明质酸含量更高，制备这些食物/饲料时需要较少根据本发明经遗传修饰的植物的可收获的部分、繁殖材料、可加工的部分或可消费的部分的量。如果根据本发明经遗传修饰的植物的可消费部分被消费，例如直接用作“营养品”，可能甚至通过摄取相对小量的物质即能达到阳性效果。这尤其在制备动物饲料时特别显著，因为含有太高含量植物成分的动物饲料不适合于作为多种动物的饲料。
由于乙酰透明质酸的高水结合能力，根据本发明经遗传修饰的植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可消费部分还具有当制备固化食物/饲料时需更少增稠剂的优点。因此，例如，制备果冻时需要较少的糖，其对健康有额外的积极影响。需要从粗植物材料中脱水的食物/伺料制备中，使用根据本发明经遗传修饰的植物的可收获部分、繁殖材料、可加工部分或可消费的部分的优点在于只需从所讨论植物材料中除去较少的水的事实，导致更低的生产成本，以及由于更温和的制备方法(例如，更低的和/或更短的供热)，提高了所讨论食物/饲料的营养价值。因此，例如，当制备番茄酱时，不必引入很多的能量便可获得期望的稠度。
本发明还提供了一种制备合成乙酰透明质酸的植物的方法，其包括 a)遗传修饰植物细胞，其中遗传修饰包括如下步骤i至iii i)将编码乙酰透明质酸合成酶的外源核酸分子引入植物细胞 ii)将这样的遗传修饰引入植物细胞，该遗传修饰导致了与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性增加 iii)将这样的遗传修饰引入植物细胞，该遗传修饰导致与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性增加 其中步骤i至iii可以以任何顺序各自实施，或同时实施步骤i至iii的任何组合。
b)从步骤a)的植物细胞再生植物；和 c)根据需要，用步骤b)的植物产生进一步的植物， 其中，根据需要，从步骤b)或c)的植物分离植物细胞并重复步骤a)至c)的方法直到产生这样的植物，其具有编码乙酰透明质酸合成酶的外源核酸分子，并且与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，具有GFAT(酶的)活性的蛋白具有增加的活性，以及与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白具有增加的活性。
本发明优选地涉及制备合成乙酰透明质酸的植物的方法，其包括 a)遗传修饰植物细胞，其中遗传修饰包括如下以任何顺序的步骤i至iii，或可以个别地或同时地进行步骤i至iii的任何组合 i)将编码乙酰透明质酸合成酶的外源核酸分子引入植物细胞 ii)将遗传修饰引入植物细胞，该遗传修饰导致了与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，具有GFAT(酶的)活性的蛋白活性增加 iii)将遗传修饰引入植物细胞，该遗传修饰导致与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白活性增加 b)从包含根据下列步骤遗传修饰的植物细胞再生植物 i)a)i ii)a)ii iii)a)iii iv)a)i和a)ii， v)a)i和a)iii， vi)a)ii和a)iii，或 vii)a)i和a)ii和a)iii c)根据下列步骤引入植物的植物细胞 i)b)i根据步骤a)ii的遗传修饰， ii)b)i根据步骤a)iii的遗传修饰， iii)b)i根据步骤a)ii的遗传修饰并同时根据步骤a)iii的遗传修饰， iv)b)ii根据步骤a)i的遗传修饰， v)b)ii根据步骤a)iii的遗传修饰， vi)b)ii根据步骤a)i的遗传修饰并同时根据步骤a)iii的遗传修饰， vii)b)iii根据步骤a)i的遗传修饰， viii)b)iii根据步骤a)ii的遗传修饰， ix)b)iii根据步骤a)i的遗传修饰并同时根据步骤a)ii的遗传修饰， x)b)iv根据步骤a)iii的遗传修饰， xi)b)v根据步骤a)ii的遗传修饰，或 xii)b)vi根据步骤a)i的遗传修饰 并再生植物 d)根据下列步骤引入植物的植物细胞 i)c)i根据步骤a)iii的遗传修饰， ii)c)ii根据步骤a)ii的遗传修饰， iii)c)iv根据步骤a)iii的遗传修饰， iv)c)v根据步骤a)ii的遗传修饰， v)c)vii根据步骤a)ii的遗传修饰， vi)c)vii根据步骤a)i的遗传修饰，或 vii)c)ix根据步骤a)ii的遗传修饰 并再生植物 e)根据需要，借助于根据b)vii、c)iii、c)vi、c)x、c)xi、c)xii的任何步骤或根据d)i至d)vii的任何步骤的植物产生进一步的植物。
根据步骤a)引入植物细胞的遗传修饰原则上可以是导致具有GFAT(酶的)活性的蛋白活性增加和具有UDP-葡萄糖脱氢酶(酶的)活性的蛋白活性增加的任何类型的修饰。
可使用本领域技术人员已知的方法进行根据步骤b)，以及根据需要，根据步骤c)和d)的植物的再生(例如，描述于“Plant Cell CultureProtocols”，1999，由R.D.Hall编辑，Humana Press，ISBN 0-89603-549-2)。
例如，可通过无性繁殖(例如，通过插枝、块茎或通过愈伤组织培养以及整个植物的再生)或通过有性繁殖产生根据本发明方法的进一步的植物(取决于根据步骤c)或步骤e)的方法)。这里，有性繁殖一般以可控方式，即，将所选的具有特定特性的植物彼此杂交并繁殖。优选的以这样的方式进行选择，使得进一步的植物(取决于根据步骤c)或步骤e)产生的方法)包含在之前步骤中引入的修饰。
在根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法中，产生根据本定明经遗传修饰的植物细胞的遗传修饰可以同时进行或以连续步骤进行并可以任何组合。野生型植物和野生型植物细胞都可以作为起始点，编码乙酰透明质酸合成酶的外源核酸分子还没有引入其中以及与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比增加具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性的遗传修饰没有引入其中，以及与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比增加具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性的遗传修饰没有引入其中；或者已经经遗传修饰的植物细胞或植物，编码乙酰透明质酸合成酶的外源核酸分子已引入其中和/或与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比增加具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性的遗传修饰已引入其中和/或与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比增加具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性的遗传修饰已引入其中。这里，作为导致具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白活性增加的遗传修饰的相同方法是否用作导致具有GFAT(酶的)活性的蛋白活性增加的遗传修饰无关紧要，只要两个遗传修饰一起导致在同一细胞中具有GFAT(酶的)活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白活性的增加。用何种方法将编码乙酰透明质酸合成酶的外源核酸分子引入植物细胞中也无关紧要。
在根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法的另一个实施方案中，遗传修饰在于将至少一个外源核酸分子引入植物细胞的基因组中，其中外源核酸分子的存在或表达导致在同一个植物细胞中具有GFAT(酶的)活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白活性的增加。
在根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法的另一个实施方案中，遗传修饰在于将至少一个外源核酸分子或多个外源核酸分子引入植物细胞的基因组中，其中一个或多个外源核酸分子包含乙酰透明质酸合成酶的编码序列和具有GFAT(酶的)活性的蛋白的编码序列和具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的编码序列。
如同上面描述的为了遗传修饰而引入植物细胞或植物中的外源核酸分子那样，根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法中步骤a)引入的可以是单个的核酸分子或多个核酸分子。因此，编码乙酰透明质酸合成酶和/或编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白和/或编码具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的外源核酸分子可以一起存在于单个核酸分子中；或所提到的外源核酸分子中的两个一起存在于单个核酸分子中，且第三个外源核酸分子可以存在于另一个核酸分子中，以任何可能的组合方式；或者所提到的所有三个外源核酸分子在每一种情况下存在于单个独立的核酸分子中。
此外，在根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法的实施中，对于引入外源核酸分子，除了野生型植物细胞或野生型植物，还可以利用突变细胞或突变体，其区别在于它们已经具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性增加和/或具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性增加。如果与相应的野生型植物细胞或野生型植物相比较，突变细胞或突变体已经具有GFAT(酶的)活性的蛋白具有增加的活性或增加的具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性，这足以实施根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法，即将编码乙酰透明质酸合成酶的外源核酸分子和导致具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性的增加或具有GFAT(酶的)活性的蛋白的活性的增加(与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比)的遗传修饰引入到所述的突变细胞或突变体。如果与相应的野生型植物细胞或相应的野生型植物相比较，突变细胞或突变体已经具有GFAT(酶的)活性的蛋白具有增加的活性和增加的具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的活性，可将编码乙酰透明质酸合成酶的外源核酸分子引入到所述的突变细胞或突变体中以实施根据本发明的制备合成乙酰透明质酸植物的方法。
所有上面所述的其它关于为制备根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物的突变体的应用在此以类似的方式应用。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法，其中在步骤a)中编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子选自 a)核酸分子，特征在于它们编码病毒的乙酰透明质酸合成酶， b)核酸分子，特征在于它们编码感染小球藻的病毒的乙酰透明质酸合成酶， c)核酸分子，特征在于它们编码绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合成酶， d)核酸分子，特征在于它们编码绿草履虫小球藻病毒1H1病毒株的乙酰透明质酸合成酶， e)核酸分子，特征在于，与编码乙酰透明质酸合成酶的亲本生物体的乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的密码子相比较，编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的密码子被修饰了， f)核酸分子，特征在于，编码乙酰透明质酸合成酶的密码子已经被修饰，从而它们适应它们被整合到或将要整合到的基因组的植物细胞或植物的密码子的使用频率， g)核酸分子，特征在于，它们编码具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的乙酰透明质酸合成酶，或者它们编码其序列至少70％，优选的至少80％，特别优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列同一的乙酰透明质酸合成酶。
h)核酸分子，特征在于，它们编码其氨基酸序列可衍生自插入到质粒DSM16664中的核酸序列的编码区的蛋白质，或者它们编码的蛋白的氨基酸序列至少70％，优选的至少80％，特别优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与可衍生自插入到质粒DSM16664中的核酸序列的编码区的氨基酸序列同一。
i)核酸分子，其包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3所示的核酸序列，或者其至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3所示核酸序列同一， j)核酸分子，其包含插入到质粒DSM16664中的核酸序列，或者其至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与插入到质粒DSM16664中的核酸序列同一。
k)编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子，其中编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子与在植物细胞中起始转录的调控元件(启动子)相连，或 l)根据k)的核酸分子，其中启动子是组织特异性启动子，特别优选的是特异起始在植物块茎、果实或种子细胞中转录的启动子。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法，其中编码具有GFAT活性的蛋白的核酸分子选自 a)核酸分子，特征在于它们编码具有来源于细菌、动物或植物，优选的来源于大肠杆菌或小鼠的GFAT活性的蛋白， b)核酸分子，特征在于它们编码具有感染小球藻的病毒的GFAT活性的蛋白， c)核酸分子，特征在于它们编码具有绿草履虫小球藻病毒的GFAT活性的蛋白， d)核酸分子，特征在于，与编码具有亲本生物体的具有GFAT活性的相应蛋白的核酸分子的密码子相比较，编码具有GFAT活性的蛋白的核酸分子的密码子被修饰了， e)核酸分子，特征在于，如此修饰编码具有GFAT活性的蛋白的密码子，使得它们适应它们将要整合到或被整合到的基因组的植物细胞或植物的密码子的使用频率， f)核酸分子，其编码具有SEQ ID NO 8所示氨基酸序列的蛋白或具有SEQ ID NO 10所示氨基酸序列的蛋白或具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的蛋白， g)核酸分子，其编码的蛋白序列至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与SEQ IDNO 8或SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 12所示氨基酸序列同一。
h)核酸分子，其包含SEQ ID NO 7所示的核酸序列或与其互补的序列，或SEQ ID NO 9所示的核酸序列或与其互补的序列，或SEQ ID NO11所示的核酸序列或与其互补的序列，或SEQ ID NO 13所示的核酸序列或与其互补的序列， i)核酸分子，其至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与h)中所描述的核酸序列同一， j)在严格条件下与f)或h)中所述核酸序列的至少一条链杂交的核酸分子， k)核酸分子，由于遗传密码子的简并性，其核苷酸序列与f)或h)描述的核酸分子的序列不同，以及 l)核酸分子，其是a)，b)，c)，d)，e)，f)或h)所提到的核酸分子的片段、等位基因变体和/或衍生物， m)编码具有GFAT活性的蛋白的核酸分子，其中编码具有GFAT活性的蛋白的核酸分子与在植物细胞中起始转录的调控元件(启动子)相连，或 n)根据m)的核酸分子，其中启动子是组织特异性启动子，特别优选的是特异起始在植物块茎、叶、果实或种子细胞中转录的启动子。
在优选的实施方案中，本发明涉及根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法，其中编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子选自 a)核酸分子，特征在于它们编码具有来源于病毒、细菌、动物或植物的UDP-Glc-DH活性的蛋白， b)核酸分子，特征在于它们编码具有感染小球藻的病毒的UDP-Glc-DH活性的蛋白， c)核酸分子，特征在于它们编码具有绿草履虫小球藻病毒的UDP-Glc-DH活性的蛋白， d)核酸分子，特征在于，与编码具有亲本生物体的具有UDP-Glc-DH活性的相应蛋白的核酸分子的密码子相比较，编码UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子的密码子被修饰了， e)核酸分子，特征在于，如此修饰编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的密码子，使得它们适应它们将要整合到或被整合到的基因组的植物细胞或植物的密码子的使用频率， f)核酸分子，其编码具有SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的蛋白， g)核酸分子，其编码的蛋白的序列至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与SEQ IDNO 5所示氨基酸序列同一， h)核酸分子，其包含SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列或与其互补的序列，或SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列或与其互补的序列， i)核酸分子，其至少70％，优选的至少80％，优选的至少90％，尤其优选的至少95％以及最优选的至少98％与h)中所描述的核酸序列同一， j)在严格条件下与f)或h)中所述核酸分子的至少一条链杂交的核酸分子， k)核酸分子，由于遗传密码子的简并性，其核苷酸序列与f)或h)描述的核酸分子的序列不同，以及 l)核酸分子，其是a)，b)，c)，d)，e)，f)或h)所提到的核酸分子的片段、等位基因变体和/或衍生物， m)编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子，其中编码具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子与在植物细胞中起始转录的调控元件(启动子)相连，或 n)根据m)的核酸分子，其中启动子是组织特异性启动子，特别优选的是特异起始在植物块茎、叶、果实或种子细胞中转录的启动子。
在本发明优选的实施方案中，制备合成乙酰透明质酸的植物的方法涉及制备其每克植物材料鲜重合成至少100μg，优选至少600μg，特别优选的至少1000μg，尤其优选的至少1500μg乙酰透明质酸的植物的方法。
在另一个优选的实施方案中，应用根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法制备根据本发明的经遗传修饰的植物。
本发明也提供通过根据本发明的制备合成乙酰透明质酸的植物的方法得到的植物。
本发明另外还涉及制备乙酰透明质酸的方法，包括从根据本发明经遗传修饰的植物细胞，从根据本发明遗传的植物，从根据本发明的繁殖材料，从根据本发明的可收获的植物部分或从可通过根据本发明制备合成乙酰透明质酸的植物的方法获得的植物或这些植物的一部分提取乙酰透明质酸的步骤。
优选地，该方法也包括在提取乙酰透明质酸前收获所培养的根据本发明经遗传修饰的植物细胞、根据本发明经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分、根据本发明的可加工的植物部分的步骤，并且特别优选地还包括在收获前培养根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物的步骤。
与细菌或动物组织相反，植物组织没有透明质酸酶并且不含有任何透明质酸粘素。因此，如上面已经描述的那样，从植物组织中提取乙酰透明质酸可用相对简单的方法。如果需要，可使用本领域技术人员已知的方法进一步纯化含有乙酰透明质酸的植物细胞或组织的上述水提物，例如，诸如用乙醇反复沉淀。在一般方法第3项中描述了纯化乙酰透明质酸的优选方法。
已经描述的用于从根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物中提取乙酰透明质酸的方法也适用于从根据本发明的繁殖材料、从根据本发明的可收获的植物部分或从可通过根据本发明用于制备合成乙酰透明质酸的植物的方法获得的植物或这些植物的一部分分离乙酰透明质酸。
本发明也提供根据本发明经遗传修饰的植物细胞、根据本发明经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分、根据本发明的可加工的植物部分或可通过根据本发明的用于制备乙酰透明质酸的方法所获得的植物的应用。
本发明还涉及包含根据本发明经遗传修饰的植物细胞的组合物。这里，细胞是否完整或因为已被破碎(例如，通过加工)而不再完整都无关紧要。优选的组合物是食物、饲料、药品或美容产品。
本发明优选地提供了这样的组合物，其包含根据本发明经遗传修饰的植物细胞、根据本发明经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分或可通过根据本发明的方法获得的植物的组分，并包含重组核酸分子，其中重组核酸分子的特征是，它们包含编码乙酰透明质酸合成酶和具有GFAT(酶的)活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子。
将外源核酸分子稳定整合到植物细胞或植物的基因组中导致外源核酸分子在被整合到植物细胞或植物的基因组后，其侧翼为植物基因组的核酸序列。因此，在优选的实施方案中，根据本发明的组合物的特征在于，存在于根据本发明的组合物中的重组核酸分子侧翼为植物基因组的核酸序列。这里，植物基因组的核酸序列可以是天然存在于用于制备组合物的植物细胞或植物的基因组中的任何序列。
存在于根据本发明的组合物中的重组核酸分子可以是单个的或多个的重组核酸分子，其中编码乙酰透明质酸合成酶和具有GFAT(酶的)活性的蛋白和有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子存在于一个核酸分子中，或所提到的核酸分子可以存在于分别的重组核酸分子中。编码乙酰透明质酸合成酶或编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白或编码有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子可以一起存在于单个重组核酸分子中；或者所提到的核酸分子的两个可以一起存在于单个重组核酸分子中而第三个核酸分子可以存在于另一个重组核酸分子中，以任何可能的组合；或者所有三个所提到的核酸在每种情况下存在于单独分离的重组核酸分子中。取决于编码乙酰透明质酸合成酶或编码具有GFAT(酶的)活性的蛋白或编码有UDP-Glc-DH(酶的)活性的蛋白的核酸分子以何种方式存在于根据本发明的组合物中，它们可以在侧翼与相同的或不同的植物基因组的核酸序列相连。
可以用本领域技术人员所知的方法来证实根据本发明的组合物包含重组核酸分子，例如，诸如，基于杂交的方法，或优选的利用基于PCR(聚合酶链式反应)的方法。
优选的，根据本发明的组合物包含至少0.005％，优选的至少0.01％，特别优选的至少0.05％，以及尤其优选的至少0.1％的乙酰透明质酸。
优选的，根据本发明的组合物包含至多5％，优选的至多2％，特别优选的至多1％，以及尤其优选的至少0.5％的乙酰透明质酸。
如上述已提及，可使用根据本发明经遗传修饰的植物细胞、根据本发明经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分、根据本发明的可加工的植物部分、根据本发明的可消费的植物部分或者可通过根据本发明的方法获得的植物以制备食物或饲料。然而，也可用作工业应用的原料，而不必分离乙酰透明质酸。因此，例如，可将根据本发明经遗传修饰的植物或根据本发明经遗传修饰的植物部分应用到在农业耕作的地区以达到增加土壤的水结合。此外，可使用根据本发明经遗传修饰的植物或根据本发明经遗传修饰的植物细胞制备干燥剂(例如，用于运输易于受潮的产品)或者用作液体的吸收剂(例如在尿布中或者用于吸收溢出的水性液体)。对于这种应用，根据需要，可使用根据本发明遗传修饰的整个植物、根据本发明经遗传修饰的植物的一部分或者根据本发明的粉碎(例如，碾磨)的经遗传修饰的植物或者根据本发明经遗传修饰的植物部分。适于在这些领域应用的地上植物或植物部分是含乙酰透明质酸但是仅含低比例的水的植物部分。这些优选为谷类植物(谷物、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、西米或高梁)的谷粒。因为根据本发明经遗传修饰的植物细胞和根据本发明经遗传修饰的植物比文献中描述的转基因植物具有更高的乙酰透明质酸含量，与这些相比较，当将根据本发明经遗传修饰的植物细胞或根据本发明经遗传修饰的植物用于工业应用时，会用到更少的材料。
本发明也提供用于制备根据本发明的组合物的方法，其中使用根据本发明经遗传修饰的植物细胞、根据的本发明经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分、根据本发明的可加工的植物部分、根据本发明的可消费的植物部分或者可通过根据本发明用于制备合成乙酰透明质酸的植物的方法获得的植物。用于制备根据本发明的组合物的方法优选地是用于制备食物或饲料的方法，用于制备药品的方法或者用于制备美容产品的方法。
用于制备食物或饲料的方法是本领域技术人员公知的。在工业领域使用根据本发明遗传修饰的植物或根据本发明的植物部分的方法也是本领域技术人员公知的，并且尤其包括根据本发明遗传修饰的植物或者根据本发明植物部分的粉碎或碾磨；然而，它们并不仅限于此。上面已经描述了由于使用根据本发明的用于制备食物/饲料的主题或用于工业领域的主题所带来的一些优点。
根据本发明制备组合物的方法特别优选的是制备含有乙酰透明质酸的组合物的方法。
本发明同样也提供通过用于制备根据本发明的组合物的方法获得的组合物。
本发明也涉及根据本发明经遗传修饰的植物细胞、根据本发明经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分、根据本发明的可加工的植物部分、根据本发明的可消费的植物部分或者可通过根据本发明的用于制备合成乙酰透明质酸的植物的方法获得的植物用于制备根据本发明的组合物的用途。优选的是根据本发明经遗传修饰的植物细胞、根据本发明经遗传修饰的植物、根据本发明的繁殖材料、根据本发明的可收获的植物部分、根据本发明的可加工的植物部分、根据本发明的可消费的植物部分或者可通过根据本发明的用于制备合成乙酰透明质酸的植物的方法获得的植物用于制备食物或饲料、用于制备药品或者用于制备美容产品的用途。
序列说明 SEQ ID NO 1核酸序列，编码绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合成酶。
SEQ ID NO 2绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合成酶的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 1。
SEQ ID NO 3合成的核酸序列，编码绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合成酶。如此合成所示序列的密码子使得其适应植物细胞中的密码子的使用。所示的核酸序列编码具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白质。
SEQ ID NO 4核酸序列，编码具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白。
SEQ ID NO 5具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 4。
SEQ ID No 6合成的核酸序列，编码具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白。如此合成所示序列的密码子使得其适应植物细胞中的密码子的使用。所示的核酸序列编码具有SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的蛋白质。
SEQ ID NO 7核酸序列，编码具有小鼠的GFAT-1活性的蛋白。
SEQ ID NO 8具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 7。
SEQ ID NO 9核酸序列，编码具有小鼠GFAT-2活性的蛋白。
SEQ ID NO 10具有小鼠GFAT-2活性的蛋白的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 9。
SEQ ID NO 11核酸序列，编码具有大肠杆菌的GFAT活性的蛋白。
SEQ ID NO 12具有大肠杆菌的GFAT活性的蛋白的氨基酸序列。所示的氨基酸序列可衍生自SEQ ID NO 11。
SEQ ID NO 13合成的核酸序列，编码具有大肠杆菌的GFAT活性的蛋白。如此合成所示序列的密码子使得其适应植物细胞中的密码子的使用。所示的核酸序列编码具有SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的蛋白质。
SEQ ID NO 14在实施例1中用作引物的合成的寡核苷酸。
SEQ ID NO 15在实施例1中用作引物的合成的寡核苷酸。



图1显示校正曲线和用于计算植物组织中乙酰透明质酸含量的回归线的相应方程式。校正曲线使用商业检验试剂盒(Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明质酸(HA)检验试剂盒，Prod.No.029-001)和其中所提供的标准溶液绘制。
所有引用的文献，包括但不限于核酸或氨基酸序列的登录号以参考文献的方式结合到说明书中。
一般方法 下面描述可使用的与本发明有关的方法。这些方法为具体实施方案；然而，本发明不限于这些方法。本领域技术人员知晓，通过改变所述方法和/或通过可选方法或方法的可选部分替换单个方法或方法的一部分，可以相同方式实现本发明。
1、马铃薯植物的转化 如Rocha-Sosa等(EMBO J.8，(1989)，23-29)所述，借助于农杆菌转化马铃薯植物。
2、从植物组织中分离乙酰透明质酸 为了检测植物组织中乙酰透明质酸的存在并测定乙酰透明质酸含量，如下加工植物材料向约0.3g块茎材料中添加200μl水(去矿质的，电导率＝18MΩ)，并在实验室振荡球磨机(MM200，购自Retsch，德国)中将混合物粉碎(30Hz，30秒钟)。然后再添加800μl水(去矿质的，电导率＝18MΩ)，并将混合物充分混合(例如，使用Vortex混合机)。在16000xg离心5分钟从上清液中分离细胞碎片和不溶成分。
3、乙酰透明质酸的纯化 约100克块茎削皮，切成约1cm3大小的块，添加100ml水(去矿质的，电导率＝18MΩ)后在Warring搅拌机中以最大速度粉碎约30秒钟。然后使用茶滤网移除细胞碎片。将已移除的细胞碎片在300ml水(去矿质的，电导率＝18MΩ)中重悬，使用茶筛网再次移除。混合所获得的两次悬液(100ml+300ml)并以13000xg离心15分钟。向所获得的离心上清液中添加NaCl直至1％的终浓度。在NaCl溶解到溶液内后，通过添加2倍体积的乙醇接着彻底混合并保持在-20℃过夜进行沉淀。然后将混合物在13000xg离心15分钟。将这次离心后所获得的沉积的沉淀物溶于100ml缓冲液(50mM TrisHCI，pH 8，1mM CaCl2)中，然后添加蛋白酶K至终浓度100μg/ml，并将溶液在42℃温育2小时。这之后在95℃温育10分钟。再一次向该溶液中添加NaCl直至1％的终浓度。在NaCl溶解到溶液内后，通过添加2倍体积的乙醇、彻底混合并保持在-20℃约96小时进行另一次沉淀。这之后在13000xg离心15分钟。将该离心后所获得的沉积的沉淀物溶于30ml水(去矿质的，电导率＝18MΩ)中，再一次添加NaCl至1％的终浓度。通过添加2倍体积的乙醇、彻底混合并保持在-20℃过夜，进行另一次沉淀。将随后在13000xg离心15分钟所获得的沉淀溶于20ml水(去矿质的，电导率＝18MΩ)中。
通过离心过滤进行进一步的纯化。为此，在每种情况下将5ml溶解的沉淀施加到膜滤器(CentriconAmicon，孔宽10 000NMWL，Prod.No.UCF8 010 96)上，并将样品在2200xg离心分离直到滤器上仅剩余3ml溶液。再进行两次，每次然后向膜上的溶液中添加3ml水(去矿质的，电导率＝18MΩ)，并每次在相同的条件下再次离心分离，直到结束时滤器上仅剩余约3ml溶液。去掉离心过滤后仍然存在于膜上的溶液，并将膜用约1.5ml水(去矿质的，电导率＝18MΩ)反复漂洗(3到5次)。将仍存在于膜上的所有溶液和从漂洗中所获得的溶液混合，添加NaCl至终浓度为1％，NaCl溶解到溶液中后，添加两倍体积的乙醇，将样品混合并通过在-20℃过夜贮藏获得沉淀。将随后在13000xg离心15分钟获得的沉淀溶解在4ml水(去矿质的，电导率＝18MΩ)中，然后冷冻干燥(24小时，压力0.37mbar，Christ，Osterode，Germany的冷冻干燥设备Christ Alpha 1-4)。
4、乙酰透明质酸的检测和乙酰透明质酸含量的测定 根据制造商的说明(其因此作为参考的方式并入说明书中)，利用商业检验(Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明质酸(HA)检验试剂盒，Prod.No.029-001)检测乙酰透明质酸。检验原理是基于特异性结合乙酰透明质酸的蛋白质(HABP)的可获得性并类似ELISA进行，其中颜色反应指示所检查样品中的乙酰透明质酸含量。因此，对于乙酰透明质酸的定量测定，应当以这样的浓度使用待测样品，从而使其在所述限度内(例如取决于是否超过或未达到限度，稀释所讨论样品或使用较少的水从植物组织中提取乙酰透明质酸)。
在平行批次中，最初使将要测定的样品的等分试样进行透明质酸酶消化，然后使用商业检验(Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明质酸(HA)检验试剂盒，Prod.No.029-001)进行测定。使用400μl马铃薯块茎提取物在透明质酸酶缓冲液(0.1M磷酸钾缓冲液，pH 5.3；150mM NaCl)中通过添加5μg(～3单位)透明质酸酶(Sigma的III型透明质酸酶，Prod.No.H2251)并在37℃温育30分钟，进行透明质酸酶消化。
在每种情况下以1∶10稀释，然后使用所有样品用于测定乙酰透明质酸含量。
5、标准差的计算 根据下列公式计算所述的标准差 平方根[n∑x2-(∑x)2/n(n-1)] 其中，X是单个测定值的值，n是用于确定所讨论的标准差的所有测定值的总和。
6、GFAT活性的测定 如Rachel等(1996，J.Bacteriol.178(8)，2320-2327)所描述的那样测定具有GFAT活性的蛋白的活性。
用Hu等(2004，J.Biol.Chem.279(29)，29988-29993)描述的方法以区别蛋白是否具有GFAT-1或GFAT-2活性。
7、UDP-Glc-DH活性的测定 如Spicerl等(1998，J.Bacteriol.273(39)，25117-25124)所描述的那样测定具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的活性。
8、番茄植物的转化 利用US 5,565,347中所述的方法，借助于农杆菌转化番茄植物。
实施例 1、植物表达载体IR 47-71的制备 质粒pBinAR是双元载体质粒pBin19(Bevan，1984，Nucl Acids Res128711-8721)的衍生物，其构建如下 从质粒pDH51(Pietrzak等，1986 Nucleic Acids Res.14，5858)中分离529bp长的片段(其包含花椰菜花叶病毒35S启动子的核苷酸6909-7437)作为EcoR I/Kpn I片段，并连接在pUC18的多聚接头的EcoR I和Kpn I限制性位点之间。由此产生质粒pUC18-35S。使用限制性内切酶Hind III和Pvu II，从质粒pAGV40(Herrera-Estrella等，1983Nature，303，209-213)中分离192bp长的片段，其包括Ti质粒pTiACH5(Gielen等，1984，EMBOJournal 3，835-846)T-DNA章鱼碱合成酶基因(基因3)的多腺苷酸化信号(3’端)(核苷酸11749-11939)。向Pvu II限制性位点添加Sph I接头后，将片段连接在pUC18-35S的Sph I和Hind III限制性位点之间。这产生质粒pA7。这里，使用EcoR I和Hind III移除包括35S启动子和OCS终止子的整个多聚接头，并连接到适当切割的载体pBin19中。这产生了植物表达载体pBinAR(

和Willmitzer，1990，Plant Science 66，221-230)。
将马铃薯(Solanum tuberosum)patatin基因B33的启动子(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)作为Dra I片段(核苷酸-1512-+14)连接到其末端已用T4-DNA聚合酶钝端化的Sst I切割的载体pUC19中。这产生质粒pUC19-B33。使用EcoR I和Sma I从该质粒中移除B33启动子并连到适当限制性切割的载体pBinAR中。这产生植物表达载体pBinB33。
为了便于其它的克隆步骤，将MCS(多克隆位点)延长。为此，合成两个互补的寡核苷酸，在95℃加热5分钟，缓慢冷却到室温以允许良好固定(退火)，并克隆到pBinB33的Sal I和Kpn I限制性位点。用于此目的的寡核苷酸具有下列序列 5’-TCg ACA ggC CTg gAT CCT TAA TTA AAC TAg TCT CgA ggAgCT Cgg TAC-3’ 5’-CgA gCT CCT CgA gAC TAg TTT AAT TAA ggA TCC Agg CCTg-3’ 将所获得的质粒命名为IR 47-71。
2、植物表达载体pBinARHyg的制备 包含35S启动子、Ocs终止子和整个多克隆位点的片段用限制性内切酶EcoR I和Hind III从pA7移除并克隆到用相同的限制性内切酶酶切的载体pBIBHyg(Becker，1990，Nucleic Acids Res.18，203)中。所得到的质粒命名为pBinARHyg。
3、克隆载体IC 317-204的制备 用限制性内切酶Xho I和Hind III从质粒IR 47-71中分离包含OCS终止子的核酸片段并克隆到用相同的限制性内切酶酶切的载体pBlueScript KS(Stratagene，Prod.No.212207)中。所得到的质粒命名为IC306-204。
用限制性内切酶Bam HI和Eco Rl从质粒IR 47-71中分离包含B33启动子的核酸片段并克隆到用相同的限制性内切酶酶切的载体pBlueScript KS(Stratagene，Prod.No.212207)中。所得到的质粒命名为IC314-204。
用限制性内切酶Bam HI从IC 306-204中分离OCS终止子并克隆到用相同的限制性内切酶酶切的质粒IC 314-204中。所得到的质粒命名为IC317-204。
4、核酸分子的合成 a)编码绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的合成 编码绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合成酶(HAS)的核酸序列由Medigenomix GmbH(Munich，德国)合成并克隆到来自Invitrogen的载体pCR2.1(Prod.No.K2000-01)中。所得到的载体命名为IC 323-215。合成的编码绿草履虫小球藻病毒1HAS蛋白的核酸序列如SEQ ID NO 3所示。原始的从绿草履虫小球藻病毒1中分离的相应的核酸序列如SEQ IDNO 1所示。
b)编码具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子的合成 编码具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的核酸分子由Entelechon GmbH合成并克隆到来自Invitrogen的载体pCR4Topo(Prod.No.K4510-20)。所得到的载体命名为IC 339-222。合成的编码绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH蛋白的核酸序列如SEQ ID NO 6所示。原始的从绿草履虫小球藻病毒1中分离的相应的核酸序列如SEQ ID NO 4所示。
c)编码具有大肠杆菌GFAT活性的蛋白的核酸分子的合成 编码具有大肠杆菌GFAT活性的蛋白的核酸序列由EntelechonGmbH合成并克隆到来自Invitrogen的载体pCR4Topo(Prod.No.K4510-20)。所得到的载体命名为IC 373-256。合成的编码具有大肠杆菌GFAT活性的蛋白的核酸分子序列如SEQ ID NO 13所示。原始的从大肠杆菌分离的相应的核酸序列如SEQ ID NO 11所示。
5、其它核酸分子的来源 a)编码具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的核酸分子 编码具有GFAT-1活性的蛋白的核酸序列购自BioCat GmbH，Heidelberg(Art.No.MMM1013-65346，cDNA克隆MGC58262，IMAGE6742987)。这是一个由I.M.A.G.E.Konsortium(http://image.llnl.gov)生产并由BioCat GmbH分销的克隆。这里，将编码具有GFAT-1活性的蛋白的cDNA克隆到来自Invitrogen的载体pCMVSport 6。所得到的载体命名为IC 365-256。与SEQ ID NO 7所示的核酸序列相比较，插入到IC 365-256并编码具有小家鼠的GFAT-1活性的蛋白的核酸序列有在1090位的从T到C的碱基交换以及在2027位的从G到A的碱基交换。这些碱基交换没有导致由这两个不同的核酸分子编码的氨基酸序列的氨基酸交换。
具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的编码核酸序列如SEQ ID NO 8所示。为便于随后的克隆步骤，用限制性内切酶Xho I和Eco RV从IC 365-256中分离编码具有GFAT-1活性的蛋白的序列并克隆到用相同的限制性内切酶酶切的载体pME9(pBlueSkript载体，来自Stratagene，Prod.No.212207)中，该载体具有修饰过的多克隆位点，其两端具有附加的Pac I限制性位点。所得到的质粒命名为IC 367-256。. b)编码具有小鼠的GFAT-2活性的蛋白的核酸分子 编码具有小鼠的GFAT-2活性的蛋白的核酸分子购自Invitrogen(Clone ID 4167189，cDNA克隆MGC18324，IMAGE4167189)。这是一个由I.M.A.G.E.Konsortium(http://image.llnl.gov)生产并由Invitrogen分销的克隆。这里，将编码具有GFAT-2活性的蛋白的cDNA克隆到来自Invitrogen的载体pCMV Sport 6中。所得到的载体命名为IC 369-256。编码具有小家鼠的GFAT-2活性的蛋白的核酸序列如SEQ ID NO 9所示。
6、包含绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合成酶的编码核酸序列的植物表达载体IC 341-222的制备 利用BamH I和Xho I限制性消化，从质粒IC 323-215中分离包含乙酰透明质酸合成酶编码序列的核酸分子并克隆到质粒IR 47-71的BamH I和Xho I限制性位点中。所得到的植物表达载体命名为IC 341-222。
7、植物表达载体IC 370-256和IC 376-256的制备，其包含具有小鼠GFAT-1活性的蛋白和具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的编码核酸序列。
利用BamH I和Kpn I限制性消化，从质粒IC 339-222中分离包含具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的编码序列的核酸分子并克隆到用相同的限制性内切酶酶切的质粒pA7中。所得到的植物表达载体命名为IC 342-222。
通过Xba I和Kpn I限制性消化，从质粒IC 342-222中分离包含具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的编码序列的核酸分子并克隆到用Xba I和Kpn I限定的表达载体pBinAR Hyg中。所得到的植物表达载体命名为IC 349-222。
在下一个步骤中，将通过用Eco IR限制性消化从IC 317-204中分离的包含B33启动子和OCS终止子的核酸片段克隆到IC 349-222的Eco IR限制性位点。这里，确保启动子(35S和B33)是头对头的定向。所得的载体命名为IC 354-222。
在进一步的克隆步骤中，通过利用Xho I和Eco RV限制性消化，从IC 367-256中分离包含具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的编码序列的核酸片段，并克隆到用Xho I和Ecl136 II限制的质粒IC 354-222中。所得到的植物表达载体命名为IC 370-256。
在测序分析质粒IC 370-256后，发现与插入到质粒IC 365-256的核酸序列相比较，具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的编码核酸序列在两个位点上有改变。与SEQ ID NO 7所示核酸序列相比较，质粒IC 370-256包含的具有编码小鼠GFAT-1活性的蛋白的核酸序列具有在1160位上的由G到A的碱基交换、1190位上的由T到C的碱基交换、1245位上的由T到C和2027位上的由G到A的碱基交换。该改变的核酸分子编码的蛋白，相对于SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列来说，具有在304位由R到Q和在366位由C到R的氨基酸改变。
为得到包含正确的编码具有小鼠的GFAT-1活性的蛋白的核酸序列的植物表达载体，再次通过用Xho I和Eco RV的限制性消化从IC 365-256分离具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的编码序列，并将其克隆到用Xho I和Ecl136 II限制的质粒IC 354-222中。所得到的植物表达载体命名为IC376-256。
质粒IC 376-256包含的编码具有小鼠的GFAT-1活性的蛋白的核酸序列与插入到质粒365-256的具有小鼠GFAT-1活性的蛋白的编码序列完全相同。由该核酸分子编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示。
8、植物表达载体IC 372-256的制备，其包含具有小鼠GFAT-2活性的蛋白和具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的编码核酸序列 通过用Xho I和Eco RV的限制性消化从IC 369-256分离包含具有小鼠GFAT-2活性的蛋白的编码序列的核酸片段，并克隆到用Xho I和Ecl136 II限制的质粒IC 354-222中。所得到的植物表达载体命名为IC372-256。
9、植物表达载体IC 375-271的制备，其包含具有大肠杆菌的GFAT活性的蛋白和具有绿草履虫小球藻病毒1的UDP-Glc-DH活性的蛋白的编码核酸序列 通过用Xho I和Eco RV的限制性消化从IC 373-256分离包含具有大肠杆菌的GFAT活性的蛋白的编码序列的核酸片段，并克隆到用Xho I和Ecl136 II限制的质粒IC 354-222中。所得到的植物表达载体命名为IC375-271。
10、用包含编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的植物表达载体转化马铃薯植物 用一般方法第1项的方法，用植物表达载体IC 341-222转化马铃薯植物，该载体包含在马铃薯patatin基因B33启动子(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)控制下的绿草履虫小球藻病毒1的乙酰透明质酸合成酶的编码核酸序列。所得到的用质粒IC 341-222转化的转基因马铃薯植物被命名为365ES。
11、用包含编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的植物表达载体转化的转基因植物的分析 a)构建校正曲线 根据制造商所描述的方法，使用在商业化检验试剂盒(Corgenix，Inc.，Colorado，USA的透明质酸(HA)检验试剂盒，Prod.No.029-001)中提供的标准溶液建立校正曲线。为了测定1600ng/ml乙酰透明质酸的消光，基于制造商所指出的提供的标准量，使用包含800ng/ml乙酰透明质酸的双倍量。在每种情况下，进行三个独立的测定系列，并且确定对应的均值。这产生了如下校正曲线
表1用于构建定量测定植物组织中乙酰透明质酸含量的校正曲线的测定值。借助于软件(Microsoft Office Excel 2002，SP2)，将所获得的测定值输入到图表中，并确定趋势线函数的方程式(见图1)。E450nm指450nm波长处的消光，s.d.是单个数值计算均值的标准差。
b)365ES品系的马铃薯块茎的分析 在温室中，在6cm罐的土壤中培养365ES品系的个体植物。在每种情况下，根据在一般方法第2项所描述的方法加工个体植物的约0.3g马铃薯块茎材料。使用在一般方法第4项所描述的方法，借助于实施例10a)和图1中所示的校正曲线，测定各个植物提取物中存在的乙酰透明质酸的量。这里，使用离心后所获得的上清液以1∶10稀释用于测定乙酰透明质酸含量。
对于所选植物获得下列结果 表2独立选择的365 ES品系转基因植物所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列指从中收获块茎材料的植物(这里，“野生型”指未转化的植物，然而其具有用作转化起始材料的基因型)。第2列显示用于测定乙酰透明质酸含量的所讨论的植物块茎材料的量。第3列包含各个植物提取物1∶10稀释液的所测定的消光。借助于回归线方程式(见图1)，考虑到稀释因子，如下计算第4列((第3列值-0.149)/0.00185)x10。第5列显示基于所用鲜重的乙酰透明质酸的量，并如下计算(第4列值/第2列值)/1000。“n.d.”意思是检测不到。
12.用包含具有GFAT活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的编码核酸序列的植物表达载体转化合成乙酰透明质酸的植物 用一般方法第1项给出的方法，用植物表达载体IC 370-256，IC376-256，IC 372-256和IC 375-271在每种情况下转化365 ES 13和365 ES74品系马铃薯植物。
将用质粒IC 370-256转化的365 ES 13品系转基因马铃薯植物命名为393 ES。
将用质粒IC 370-256转化的365 ES 74品系转基因马铃薯植物命名为394 ES。
将用质粒IC 372-256转化的365 ES 13品系转基因马铃薯植物命名为395 ES。
将用质粒IC 372-256转化的365 ES 74品系转基因马铃薯植物命名为396 ES。
将用质粒IC 375-271转化的365 ES 13品系转基因马铃薯植物命名为403 ES。
将用质粒IC 375-271转化的365 ES 74品系转基因马铃薯植物命名为404 ES。
将用质粒IC 376-256转化的365 ES 13品系转基因马铃薯植物命名为408 ES。
将用质粒IC 376-256转化的365 ES 74品系转基因马铃薯植物命名为409 ES。
13、分析用包含具有GFAT活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的编码核酸序列的植物表达载体额外转化的合成乙酰透明质酸的转基因马铃薯植物 在温室中，在6cm罐的土壤中培养393 ES，394 ES，395 ES，396 ES，403 ES，404 ES和409 ES品系的个体植物。在每种情况下，根据在一般方法第2项所描述的方法加工个体植物的约0.3g马铃薯块茎或叶子材料。使用在一般方法第4项所描述的方法，借助于根据实施例10a)产生的校正曲线(为每一个单独的测定系列新产生校正曲线)，测定各个植物提取物中所含的乙酰透明质酸的量。这里，为测定乙酰透明质酸含量，在每种情况下用水(去矿质，电导率＝18MΩ)稀释离心后获得的上清液，使得单个样本所测得的消光值在校正曲线的线性范围内。源自用不同质粒原始转化的植物的结果如下 a)393 ES品系块茎的分析 对名为393 ES品系的单个转基因植物的每个块茎取两个独立的样本，并且在每种情况下分别测定乙酰透明质酸含量。然后用一般方法第5项给出的公式计算每个块茎的单个测定获得的值的均值和标准差。通过计算每种情况下在十个不同植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的无性后代)的块茎中的乙酰透明质酸的量计算名为野生型的植物和名为365 ES 13的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表3独立地选择的393 ES品系转基因植物的块茎中产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获块茎材料的植物的名称(这里，“野生型”指未转化的植物；365 ES 13指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 370-256转化产生393 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了对所讨论的块茎所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。
b)394 ES品系块茎的分析 对命名为394 ES品系的单个转基因植物的每个块茎取两个独立的样本，并且在每种情况下分别测定乙酰透明质酸含量。然后用一般方法第5项给出的公式计算每个块茎的单独测定获得的值的均值和标准差。通过计算每种情况下在18株不同的野生型植物和26株不同的365 ES 74品系植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的无性后代)的块茎中的乙酰透明质酸的量，计算名为野生型的植物和名为365ES的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表4独立地选择的394 ES品系转基因植物的块茎所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获块茎材料的植物的名称(这里，“野生型”指未转化的植物；365 ES 74指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 370-256转化产生394 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了对所讨论的块茎所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。
c)395 ES品系块茎的分析 如果可能的话，对名为395 ES品系的各转基因植物的每个块茎取两个独立的样本，并且在每种情况下分别测定乙酰透明质酸含量。然后用一般方法第5项给出的公式计算每个块茎单独测定获得的值的均值和标准差。通过计算每种情况下在10株不同的野生型植物和18株不同的365 ES 13品系植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的无性后代)的块茎中的乙酰透明质酸的量，计算名为野生型的植物和名为365 ES的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表5独立地选择的395 ES品系转基因植物的块茎所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获块茎材料的植物的名称(这里，“野生型”指未转化的植物；365 ES 13指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 372-256转化产生395 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了对所讨论的块茎所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。至于没有标出标准差的植物，只测定了一个块茎的乙酰透明质酸含量。
d)395 ES品系叶子的分析 测定了具有395 ES名称的植物品系的个体的叶子的乙酰透明质酸含量。通过在每种情况下计算在4株不同的野生型植物和9株不同的365 ES13品系植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的无性后代)的叶子中的乙酰透明质酸的量，计算具有野生型名称的植物和具有365 ES名称的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表6独立地选择的395ES品系转基因植物的叶子所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获块茎材料的植物的名称(在此，“野生型”指未转化的植物；365 ES 13指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 372-256转化产生395 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了对所讨论的块茎所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。至于没有标出标准差的植物，只测定了一个叶子样本的乙酰透明质酸含量。
e)396 ES品系块茎的分析 为名为396品系的各转基因植物的每个块茎取两个独立的样本，并且在每种情况下分别测定乙酰透明质酸含量。然后用一般方法第5项给出的公式计算每个块茎的单独测定获得的值的均值和标准差。通过计算每种情况下在12株不同的野生型植物和14株不同的365 ES 74品系植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的无性后代)的块茎中的乙酰透明质酸的量，计算名为野生型的植物和名为365 ES的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表7独立地选择的396 ES品系转基因植物的块茎所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获块茎材料的植物的名称(这里，“野生型”指未转化的植物；365 ES 74指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 372-256转化产生396 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了对所讨论的块茎所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。
f)396 ES品系叶子的分析 测定了具有396 ES名字的植物品系的个体的叶子的乙酰透明质酸含量。通过在每种情况下计算在4株不同的野生型植物和6株不同的365 ES13品系植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的无性后代)的叶子中的乙酰透明质酸的量，计算具有野生型名字的植物和具有365 ES名字的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表8独立地选择的396 ES品系转基因植物的叶子所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获叶子材料的植物的名称(这里，“野生型”指未转化的植物；365 ES 74指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 372-256转化产生396 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了为所讨论的块茎所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。至于没有标出标准差的植物，只测定了一个叶子样本的乙酰透明质酸含量。
g)403 ES品系块茎的分析 为名为403 ES品系的各转基因植物的每个块茎取两个独立的样本(如果可能的话)，并且在每种情况下分别测定乙酰透明质酸含量。然后用一般方法第5项给出的公式计算每个块茎的单个测定获得的值的均值和标准差。通过计算每种情况下在10株不同的野生型植物和10株不同的365ES13品系植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的无性后代)的块茎中的乙酰透明质酸的量，计算名为野生型的植物和名为365 ES的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表9独立地选择的403 ES品系转基因植物的块茎所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获块茎材料的植物的名称(这里，“野生型”指未转化的植物；365 ES 13指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 375-271转化产生403 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了为所讨论的块茎所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。“n.d.”意思在块茎中不可能检测到乙酰透明质酸。至于没有标出标准差的植物，只测定了一个块茎样本的乙酰透明质酸含量。
h)403 ES品系叶子的分析 测定了具有403 ES名字的植物品系的个体的叶子的乙酰透明质酸含量。通过在每种情况下计算在5株不同的野生型植物和5株不同的365 ES13品系植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 13品系的无性后代)的叶子中的乙酰透明质酸的量，计算具有野生型名字的植物和具有365 ES名字的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表10独立地选择的403 ES品系转基因植物的叶子所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获叶子材料的植物的名称(这里，“野生型”指未转化的植物；365 ES 13指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 375-271转化产生403 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了对所讨论的块茎所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。至于没有标出标准差的植物，只测定了一个叶子样本的乙酰透明质酸含量。
i)404 ES品系块茎的分析 为名为404 ES品系的各转基因植物的每个块茎取两个独立的样本(如果可能的话)，并且在每种情况下分别测定乙酰透明质酸含量。然后用一般方法第5项给出的公式计算每个块茎的单个测定获得的值的均值和标准差。通过计算在每种情况下在10株不同的野生型植物和12株不同的365 ES74品系植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的无性后代)的块茎中的乙酰透明质酸的量，计算名为野生型的植物和名为365 ES的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表11独立地选择的404 ES品系转基因植物的块茎所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获块茎材料的植物的名称(在此，“野生型”指未转化的植物；365 ES 74指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 375-271转化产生404 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了对所讨论的块茎所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。“n.d.”意思在块茎中不可能检测到乙酰透明质酸。至于没有标出标准差的植物，只测定了一个块茎样本的乙酰透明质酸含量。
j)404 ES品系叶子的分析 测定了具有404 ES名字的植物品系的个体的叶子的乙酰透明质酸含量。通过在每种情况下计算在7株不同的野生型植物和9株不同的365 ES74品系植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的无性后代)的叶子中的乙酰透明质酸的量，计算具有野生型名字的植物和具有365 ES名字的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表12独立地选择的404 ES品系转基因植物的叶子所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获叶子材料的植物的名称(在此，“野生型”指未转化的植物；365 ES 74指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 375-271转化产生404 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了对所讨论的叶子所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。至于没有标出标准差的植物，只测定了一个叶子样本的乙酰透明质酸含量。
k)409 ES品系块茎的分析 对名为409 ES品系的各转基因植物的每个块茎取得样本，并且在每种情况下测定乙酰透明质酸含量。通过计算在每种情况下在4株不同的野生型植物和6株不同的365 ES 74品系植物(分别是野生型(Solanumtuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的无性后代)的块茎中的乙酰透明质酸的量，计算名为野生型的植物和名为365 ES的植物的所述均值和标准差。用一般方法第5项给出的公式计算每个块茎的单独测定获得的值的均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表13独立地选择的409 ES品系转基因植物的块茎所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获块茎材料的植物的名称(在此，“野生型”指未转化的植物；365 ES 74指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 375-271转化产生409 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了对所讨论的块茎所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。“n.d.”意思在块茎中不可能检测到乙酰透明质酸。至于没有标出标准差的植物，只测定了一个块茎样本的乙酰透明质酸含量。
l)409 ES品系叶子的分析 测定了具有409 ES名字的植物品系的个体的叶子的乙酰透明质酸含量。通过在每种情况下计算在4株不同的野生型植物和6株不同的365 ES74品系植物(分别是野生型(Solanum tuberosum cv.Désirée)和365 ES 74品系的无性后代)的叶子中的乙酰透明质酸的量，计算具有野生型名字的植物和具有365 ES名字的植物的所述均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果 表14独立地选择的409 ES品系转基因植物的叶子所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列包含从中收获叶子材料的植物的名称(“野生型”指未转化的植物；365 ES 74指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 376-256转化产生409 ES品系的起始材料的植物)。第2列显示了对所讨论的叶子所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列显示了所测定的均值的标准差。“n.d.”意思在块茎中没有能检测到的乙酰透明质酸。至于没有标出标准差的植物，只测定了一个叶子样本的乙酰透明质酸含量。
m)关于鲜重和关于干重的乙酰透明质酸含量的测定 在收获所讨论的植物的块茎之前，从植物中移除395 ES和396 ES品系植物的个体叶子并在中间分开。在每种情况下在液氮中冰冻每一个体叶子的一半，冷冻干燥过夜相应的另一半叶子。
用实验室振荡珠磨机(MM200，Retsch，德国)(30HZ，30秒)中粉碎约0.3g冰冻的叶子材料或约0.02g冷冻干燥的叶子样本。然后在每个个体的粉碎样本中添加300μl水(去矿质，电导率＝18MΩ)，然后用蜗旋搅拌器将其完全混合，然后通过离心(16000xg，5分钟)从上清液中分离细胞碎片和不溶成分。移除上清液，用水(去矿质，电导率＝18MΩ)使得每个样品至500μl。用这种方法制备的样品的等分试样用于用一般方法第4项描述的方法测定乙酰透明质酸的含量。用一般方法第5项给出的公式计算均值和标准差。得到了所选择的植物的下列结果
表15独立地选择的395 ES和396 ES品系转基因植物的叶子所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列命名了从中收获叶子材料的植物的名称。365 ES 13指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 372-256转化产生395 ES品系的起始材料的植物。365 ES 74指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 372-256转化产生396 ES品系的起始材料的植物。第2列示出了对所讨论的植物的不同叶子所测定的乙酰透明质酸量。第3列示出了植物不同叶子中测定的乙酰透明质酸含量的均值。第4列示出了测定的均值的标准差。

表16独立地选择的395 ES和396 ES品系转基因植物的叶子所产生的乙酰透明质酸的量(每克干重的乙酰透明质酸μg数)。第1列命名了从中收获叶子材料的植物的名称。365 ES 13指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 372-256转化产生395 ES品系的起始材料的植物。365 ES 74指表达乙酰透明质酸合成酶并用作用植物表达载体IC 372-256转化产生396 ES品系的起始材料的植物。第2列标记了对所讨论的植物的不同叶子所测定的乙酰透明质酸量。第3列标记了植物不同叶子中测定的乙酰透明质酸含量的均值。第4列标记了测定的均值的标准差。
14、用包含编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的植物表达载体转化番茄植物 用一般方法第8项给出的方法，用植物表达载体IC 341-222起始转化番茄植物，该载体包含在马铃薯patatin基因B33启动子(Rocha-Sosa等，1989，EMBO J.8，23-29)控制下的绿草履虫小球藻病毒1HAS蛋白的编码核酸序列。将所得到的用质粒IC 341-222转化的转基因番茄植物命名为367ES。
用一般方法第8项给出的方法用植物表达载体IC 341-222转化367 ES25和367 ES 42品系番茄植物。将用质粒IC 341-222转化367ES 25品系所得到的番茄植物命名为399 ES。将用质粒IC 341-222转化367 ES 42品系所得到的番茄植物命名为400 ES。
然后用一般方法第8项给出的方法用植物表达载体IC 375-271转化367 ES 25品系番茄植物。将用质粒IC 375-271转化367 ES 25品系所得到的转基因番茄植物命名为405 ES。
15、分析用包含具有GFAT活性的蛋白和具有UDP-Glc-DH活性的蛋白的编码核酸序列的植物表达载体额外转化的合成乙酰透明质酸的转基因番茄植物 a)399 ES和400 ES品系番茄植物的叶子 在每种情况下，从不同的所选择的已在温室土壤中培养的399 ES和400 ES品系番茄植物中收获1片叶子并在液氮中冰冻。用在实施例11b)中所描述的对马铃薯植物叶子一样的方法进行进一步处理并测定乙酰透明质酸含量。得到以下结果 表17独立地选择的399 ES和400 ES品系转基因植物的叶子所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列表示从中收获叶子材料的植物的名称。367 ES 25和367 ES 42指表达乙酰透明质酸合成酶并分别用作用植物表达载体IC 372-256转化产生399 ES和400ES品系的起始材料的不同植物。第2列标记了在所讨论植物的叶子中所测定的乙酰透明质酸量的值。野生型指未转化的植物。
b)399 ES和400 ES品系番茄植物的果实 在每种情况下，收获不同的所选的已在温室土壤中培养的399 ES和400 ES品系番茄植物的成熟的果实，粉碎、离心、并且在离心后过滤上清。用在实施例11b)中所描述的对马铃薯叶子一样的方法进一步处理滤出液并测定乙酰透明质酸含量。得到了以下结果 表18独立地选择的399 ES和400 ES品系转基因植物的成熟果实所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列表示从中收获叶子材料的植物的名称。367 ES 25-1和267 ES-2指367 ES 25植物的不同的克隆后代，以及367 ES 42-1和267 ES 42-2指367 ES 42植物的不同的克隆后代。第2列标记了在所讨论植物的果实中所测定的乙酰透明质酸量的均值。为此，在每种情况下，测定了3个(399 ES-1,400 ES 3品系)，5个(367 ES-25-1,325 ES-2,367 ES 42-1,367 ES 42-2品系)或6个(399 ES-11品系)不同的所讨论品系的果实中的乙酰透明质酸含量。第3列标出了所测定的均值的标准差。
c)405 ES品系番茄植物的果实 在每种情况下，收获不同的所选的已在温室土壤中培养的405 ES品系番茄植物的成熟的果实，粉碎、离心、并且在离心后过滤上清。用在实施例11b)中所描述的对马铃薯叶子一样的方法进一步处理滤出液并测定乙酰透明质酸含量。得到了以下结果
表19独立地选择的405 ES品系转基因植物的成熟果实所产生的乙酰透明质酸的量(每克鲜重的乙酰透明质酸μg数)。第1列表示从中收获叶子材料的植物的名称。367 ES 25-8和367 ES 25-9指367 ES 25植物的不同的克隆后代。通过拉丁数字的扩展表示各植物的不同果实。(“wt”表示未转化的植物)。第2列标记了在所讨论植物的不同果实中所测定的乙酰透明质酸量的均值。第3列标记了所测定的均值的标准差。
16)结束语 当测定植物的不同叶子的乙酰透明质酸含量时，发现同一植物的较老的叶子比同一植物的较年轻的叶子含有更多的乙酰透明质酸。因此，叶子中乙酰透明质酸的含量看起来随着叶子年龄的增长而增长，因此可以推测乙酰透明质酸随着时间而积累。这一现象可能可以解释在相同品系的后代的独立测定中发现的乙酰透明质酸的不同量。
序列表
<110>拜尔作物科学股份公司
<120>用于产生乙酰透明质酸的改良的方法和手段
<130>BCS 05-5010PCT
<150>EP05090277.4
<151>2005-10-05
<150>EP06090053.7
<151>2006-04-07
<150>US60/725,530
<151>2005-10-11
<160>15
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>1707
<212>DNA
<213>绿草履虫小球藻病毒1(Paramecium bursaria Chlorella Virus 1)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1707)
<300>
<308>PB42580
<309>1995-12-24
<313>(50903)..(52609)
<400>1
atg ggt aaa aat ata atc ata atg gtt tcg tgg tac acc atc ata act48
Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr
1 5 10 15
tca aat cta atc gcg gtt gga gga gcc tct cta atc ttg gct ccg gca96
Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala
20 25 30
att act ggg tat gtt cta cat tgg aat att gct ctc tcg aca atc tgg144
Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp
35 40 45
gga gta tca gct tat ggt att ttc gtt ttt ggg ttt ttc ctt gca caa192
Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln
50 55 60
gtt tta ttt tca gaa ctg aac agg aaa cgt ctt cgc aag tgg att tct240
Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser
65 70 75 80
ctc aga cct aag ggt tgg aat gat gtt cgt ttg gct gtg atc att gct288
Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala
85 90 95
gga tat cgc gag gat cct tat atg ttc cag aag tgc ctc gag tct gta336
Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val
100 105 110
cgt gac tct gat tat ggc aac gtt gcc cgt ctg att tgt gtg att gac384
Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp
115 120 125
ggt gat gag gac gat gat atg agg atg gct gcc gtt tac aag gcg atc432
Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile
130 135 140
tac aat gat aat atc aag aag ccc gag ttt gtt ctg tgt gag tca gac480
Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp
145 150 155 160
gac aag gaa ggt gaa cgc atc gac tct gat ttc tct cgc gac att tgt528
Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys
165 170 175
gtc ctc cag cct cat cgt gga aaa cgg gag tgt ctt tat act ggg ttt576
Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe
180 185 190
caa ctt gca aag atg gac ccc agt gtc aat gct gtc gtt ctg att gac624
Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp
195 200 205
agc gat acc gtt ctc gag aag gat gct att ctg gaa gtt gta tac cca672
Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro
210 215 220
ctt gca tgc gat ccc gag atc caa gcc gtt gca ggt gag tgt aag att720
Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile
225 230 235 240
tgg aac aca gac act ctt ttg agt ctt ctc gtc gct tgg cgg tac tat768
Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr
245 250 255
tct gcg ttt tgt gtg gag agg agt gcc cag tct ttt ttc agg act gtt816
Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val
260 265 270
cag tgc gtt ggg ggg cca ctg ggt gcc tac aag att gat atc att aag864
Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys
275 280 285
gag att aag gac ccc tgg att tcc cag cgc ttt ctt ggt cag aag tgt912
Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys
290 295 300
act tac ggt gac gac cgc cgg cta acc aac gag atc ttg atg cgt ggt960
Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly
305 310 315 320
aaa aag gtt gtg ttc act cca ttt gct gtt ggt tgg tct gac agt ccg1008
Lys Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro
325 330 335
acc aat gtg ttt cgg tac atc gtt cag cag acc cgc tgg agt aag tcg1056
Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser
340 345 350
tgg tgc cgc gaa att tgg tac acc ctc ttc gcc gcg tgg aag cac ggt1104
Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly
355 360 365
ttg tct gga att tgg ctg gcc ttt gaa tgt ttg tat caa att aca tac1152
Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr
370 375 380
ttc ttc ctc gtg att tac ctc ttt tct cgc cta gcc gtt gag gcc gac1200
Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp
385 390 395 400
cct cgc gcc cag aca gcc acg gtg att gtg agc acc acg gtt gca ttg1248
Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu
405 410 415
att aag tgt ggg tat ttt tca ttc cga gcc aag gat att cgg gcg ttt1296
Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe
420 425 430
tac ttt gtg ctt tat aca ttt gtt tac ttt ttc tgt atg att ccg gcc1344
Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala
435 440 445
agg att act gca atg atg acg ctt tgg gac att ggc tgg ggt act cgc1392
Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg
450 455 460
ggt gga aac gag aag cct tcc gtt ggc acc cgg gtc gct ctg tgg gca1440
Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala
465 470 475 480
aag caa tat ctc att gca tat atg tgg tgg gcc gcg gtt gtt ggc gct1488
Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala
485 490 495
gga gtt tac agc atc gtc cat aac tgg atg ttc gat tgg aat tct ctt1536
Gly Val Tyr Ser Ile Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu
500 505 510
tct tat cgt ttt gct ttg gtt ggt att tgt tct tac att gtt ttt att1584
Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile
515 520 525
gtt att gtg ctg gtg gtt tat ttc acc ggc aaa att acg act tgg aat1632
Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn
530 535 540
ttc acg aag ctt cag aag gag cta atc gag gat cgc gtt ctg tac gat1680
Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp
545 550 555 560
gca act acc aat gct cag tct gtg tga1707
Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val
565
<210>2
<211>568
<212>PRT
<213>绿草履虫小球藻病毒1
<400>2
Met Gly Lys Asn Ile Ile Ile Met Val Ser Trp Tyr Thr Ile Ile Thr
1 5 10 15
Ser Asn Leu Ile Ala Val Gly Gly Ala Ser Leu Ile Leu Ala Pro Ala
20 25 30
Ile Thr Gly Tyr Val Leu His Trp Asn Ile Ala Leu Ser Thr Ile Trp
35 40 45
Gly Val Ser Ala Tyr Gly Ile Phe Val Phe Gly Phe Phe Leu Ala Gln
50 55 60
Val Leu Phe Ser Glu Leu Asn Arg Lys Arg Leu Arg Lys Trp Ile Ser
65 70 75 80
Leu Arg Pro Lys Gly Trp Asn Asp Val Arg Leu Ala Val Ile Ile Ala
85 90 95
Gly Tyr Arg Glu Asp Pro Tyr Met Phe Gln Lys Cys Leu Glu Ser Val
100 105 110
Arg Asp Ser Asp Tyr Gly Asn Val Ala Arg Leu Ile Cys Val Ile Asp
115 120 125
Gly Asp Glu Asp Asp Asp Met Arg Met Ala Ala Val Tyr Lys Ala Ile
130 135 140
Tyr Asn Asp Asn Ile Lys Lys Pro Glu Phe Val Leu Cys Glu Ser Asp
145 150 155 160
Asp Lys Glu Gly Glu Arg Ile Asp Ser Asp Phe Ser Arg Asp Ile Cys
165 170 175
Val Leu Gln Pro His Arg Gly Lys Arg Glu Cys Leu Tyr Thr Gly Phe
180 185 190
Gln Leu Ala Lys Met Asp Pro Ser Val Asn Ala Val Val Leu Ile Asp
195 200 205
Ser Asp Thr Val Leu Glu Lys Asp Ala Ile Leu Glu Val Val Tyr Pro
210 215 220
Leu Ala Cys Asp Pro Glu Ile Gln Ala Val Ala Gly Glu Cys Lys Ile
225 230 235 240
Trp Asn Thr Asp Thr Leu Leu Ser Leu Leu Val Ala Trp Arg Tyr Tyr
245 250 255
Ser Ala Phe Cys Val Glu Arg Ser Ala Gln Ser Phe Phe Arg Thr Val
260 265 270
Gln Cys Val Gly Gly Pro Leu Gly Ala Tyr Lys Ile Asp Ile Ile Lys
275 280 285
Glu Ile Lys Asp Pro Trp Ile Ser Gln Arg Phe Leu Gly Gln Lys Cys
290 295 300
Thr Tyr Gly Asp Asp Arg Arg Leu Thr Asn Glu Ile Leu Met Arg Gly
305 310 315 320
Lys Lys Val Val Phe Thr Pro Phe Ala Val Gly Trp Ser Asp Ser Pro
325 330 335
Thr Asn Val Phe Arg Tyr Ile Val Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser
340 345 350
Trp Cys Arg Glu Ile Trp Tyr Thr Leu Phe Ala Ala Trp Lys His Gly
355 360 365
Leu Ser Gly Ile Trp Leu Ala Phe Glu Cys Leu Tyr Gln Ile Thr Tyr
370 375 380
Phe Phe Leu Val Ile Tyr Leu Phe Ser Arg Leu Ala Val Glu Ala Asp
385 390 395 400
Pro Arg Ala Gln Thr Ala Thr Val Ile Val Ser Thr Thr Val Ala Leu
405 410 415
Ile Lys Cys Gly Tyr Phe Ser Phe Arg Ala Lys Asp Ile Arg Ala Phe
420 425 430
Tyr Phe Val Leu Tyr Thr Phe Val Tyr Phe Phe Cys Met Ile Pro Ala
435 440 445
Arg Ile Thr Ala Met Met Thr Leu Trp Asp Ile Gly Trp Gly Thr Arg
450 455 460
Gly Gly Asn Glu Lys Pro Ser Val Gly Thr Arg Val Ala Leu Trp Ala
465 470 475 480
Lys Gln Tyr Leu Ile Ala Tyr Met Trp Trp Ala Ala Val Val Gly Ala
485 490 495
Gly Val Tyr Ser Ile Val His Asn Trp Met Phe Asp Trp Asn Ser Leu
500 505 510
Ser Tyr Arg Phe Ala Leu Val Gly Ile Cys Ser Tyr Ile Val Phe Ile
515 520 525
Val Ile Val Leu Val Val Tyr Phe Thr Gly Lys Ile Thr Thr Trp Asn
530 535 540
Phe Thr Lys Leu Gln Lys Glu Leu Ile Glu Asp Arg Val Leu Tyr Asp
545 550 555 560
Ala Thr Thr Asn Ala Gln Ser Val
565
<210>3
<211>1707
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码绿草履虫小球藻病毒乙酰透明质酸合成酶蛋白的合成序列
<400>3
atgggtaaga acattatcat tatggtgtcc tggtacacaa ttattacaag taatctcatc60
gcagttggtg gtgcatctct tattctcgct ccagctatca ctggatatgt tcttcactgg120
aacatcgccc tctcaactat ttggggagtt tccgcatatg gtatttttgt tttcgggttc180
tttttggctc aggttctgtt ctcagagctc aatcgtaaga gactcaggaa gtggattagc240
cttagaccaa aggggtggaa tgacgttcgt ctcgctgtca ttatcgctgg ctaccgtgaa300
gatccttaca tgtttcaaaa gtgcttggaa tcagttaggg atagtgatta tggcaacgtc360
gctagactga tctgtgtgat tgatggagat gaggacgacg atatgaggat ggcagctgtt420
tataaggcta tctataatga taacattaag aagcctgaat ttgttctttg cgagtctgat480
gacaaggaag gagaacggat tgattcagat ttctcacgtg atatctgcgt tctccaacct540
catcgtggga agcgtgaatg tctttataca ggtttccaac tcgccaaaat ggacccatca600
gtgaacgctg tggttcttat cgatagtgat actgtgctgg agaaagatgc tatcttggag660
gttgtttacc ctcttgcctg tgatcctgaa attcaagctg tggctggaga gtgcaagatc720
tggaacacag atactcttct ttctctgctt gtcgcatgga gatattactc cgcattctgt780
gtggagagga gcgctcaatc ctttttccgt accgttcaat gcgttggtgg tcctttggga840
gcttacaaaa ttgatatcat caaggagatt aaggacccat ggattagtca aaggtttctt900
ggtcagaagt gcacttatgg cgatgatcgt agattgacta acgaaatcct tatgaggggc960
aagaaagtcg tttttactcc atttgctgtc ggatggtctg attcacctac aaatgttttc1020
cgttatattg tgcaacaaac acgttggagt aagagctggt gtagggagat ctggtacact1080
ttgttcgctg cttggaagca cgggcttagc ggaatttggc ttgcttttga atgcctttac1140
cagattacat actttttctt ggtgatctat ttgttttcac gtcttgccgt cgaggctgac1200
cctagagcac agactgcaac tgtgattgtt tctactacag tcgcacttat taagtgtggc1260
tatttcagtt ttagagcaaa agatattaga gccttctatt ttgttttgta cacatttgtt1320
tatttctttt gcatgattcc agctcgtatt accgctatga tgaccttgtg ggacatcgga1380
tggggaacta gaggtggtaa cgaaaagcct tctgtgggaa caagggtggc cctttgggca1440
aaacaatatc tcatcgccta catgtggtgg gccgctgtcg ttggtgccgg agtgtactca1500
atcgttcata actggatgtt tgactggaac tctttgagct atcgtttcgc tcttgtgggt1560
atttgttctt acattgtttt catcgtgatt gtgctcgttg tgtatttcac tggtaaaatc1620
acaacctgga atttcactaa acttcaaaag gaattgattg aagacagggt tctgtatgat1680
gctactacca acgcccagtc agtttaa1707
<210>4
<211>1260
<212>DNA
<213>绿草履虫小球藻病毒1
<220>
<221>CDS
<222>(62)..(1228)
<300>
<308>U42580.4
<309>2004-09-20
<313>(291749.)..(292918)
<400>4
atcaacgtga tttatatttt aaacaaagac cattcacatc tttagtactt aattaattat60
a atg tca cga atc gca gtc gtt ggt tgt ggt tac gtc gga acc gct tgt109
Met Ser Arg Ile Ala Val Val Gly Cys Gly Tyr Val Gly Thr Ala Cys
1 5 10 15
gca gta ctt ctt gct caa aaa aac gaa gtc atc gtg ctt gat att agc 157
Ala Val Leu Leu Ala Gln Lys Asn Glu Val Ile Val Leu Asp Ile Ser
20 25 30
gaa gac cgt gtt caa cta atc aag aac aag aag agt cca atc gag gac 205
Glu Asp Arg Val Gln Leu Ile Lys Asn Lys Lys Ser Pro Ile Glu Asp
35 40 45
aag gaa atc gaa gag ttt ctc gaa acg aaa gac ctg aac ctg acc gcg 253
Lys Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Thr Lys Asp Leu Asn Leu Thr Ala
50 55 60
acg act gac aag gtt ctt gca tac gaa aac gcc gaa ttt gtc atc atc 301
Thr Thr Asp Lys Val Leu Ala Tyr Glu Asn Ala Glu Phe Val Ile Ile
65 70 75 80
gca acc ccg act gac tat gac gtg gtt act agg tat ttt aac acg aaa 349
Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asp Val Val Thr Arg Tyr Phe Asn Thr Lys
85 90 95
tct gtg gaa aac gtc att ggg gac gtg atc aaa aat aca cag acc cat 397
Ser Val Glu Asn Val Ile Gly Asp Val Ile Lys Asn Thr Gln Thr His
100 105 110
cca act atc gtg att aaa tct acc atc ccc att gga ttt gtt gat aag 445
Pro Thr Ile Val Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Val Asp Lys
115 120 125
gtt cgt gag caa ttc gac tac caa aat atc att ttc tcc cca gaa ttt493
Val Arg Glu Gln Phe Asp Tyr Gln Asn Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe
130 135 140
ctg cgt gaa ggt aga gcc ttg tat gat aat ctc tac cca tcc cgt atc541
Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile
145 150 155 160
atc gta gga gat gat tcc ccc att gcg ctt aag ttc gca aac ctt ctc589
Ile Val Gly Asp Asp Ser Pro Ile Ala Leu Lys Phe Ala Asn Leu Leu
165 170 175
gtt gaa ggt tct aaa act ccg ctt gcc cct gtc ctg acg atg gga act637
Val Glu Gly Ser Lys Thr Pro Leu Ala Pro Val Leu Thr Met Gly Thr
180 185 190
cgc gaa gcc gag gcc gtc aaa cta ttc tct aac acg tat ctt gca atg685
Arg Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Met
195 200 205
cga gtt gca tac ttc aac gaa cta gat aca ttc gca atg tct cac ggt733
Arg Val Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Phe Ala Met Ser His Gly
210 215 220
atg aat gcg aaa gaa atc att gat ggt gtg act ctg gag cct cgc att781
Met Asn Ala Lys Glu Ile Ile Asp Gly Val Thr Leu Glu Pro Arg Ile
225 230 235 240
ggt cag ggg tac tca aac cct tcg ttc ggt tat gga gct tat tgc ttt829
Gly Gln Gly Tyr Ser Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Ala Tyr Cys Phe
245 250 255
cca aag gat acg aag caa ctg ctg gct aat ttc gag gga gtg cct caa877
Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Phe Glu Gly Val Pro Gln
260265 270
gat atc atc gga gca att gta gaa tca aat gag act cgc aag gaa gtg925
Asp Ile Ile Gly Ala Ile Val Glu Ser Asn Glu Thr Arg Lys Glu Val
275 280 285
att gtg agt gaa gta gaa aat cgt ttc ccc acg act gtt ggt gtg tat973
Ile Val Ser Glu Val Glu Asn Arg Phe Pro Thr Thr Val Gly Val Tyr
290 295 300
aag ctc gcc gct aaa gcg ggt tct gat aat ttt cgg agt tct gca att1021
Lys Leu Ala Ala Lys Ala Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ser Ser Ala Ile
305 310 315 320
gta gac ata atg gag cga ctt gca aac aag ggt tat cac att aag att1069
Val Asp Ile Met Glu Arg Leu Ala Asn Lys Gly Tyr His Ile Lys Ile
325 330 335
ttc gaa cca act gtg gaa caa ttc gaa aac ttt gaa gtt gat aac aac1117
Phe Glu Pro Thr Val Glu Gln Phe Glu Asn Phe Glu Val Asp Asn Asn
340 345 350
ctg aca aca ttt gcg act gag agc gat gta att atc gca aac aga gtt1165
Leu Thr Thr Phe Ala Thr Glu Ser Asp Val Ile Ile Ala Asn Arg Val
355 360 365
ccc gtt gaa cat cgc att ctc ttt ggt aaa aaa tta atc aca cgt gat1213
Pro Val Glu His Arg Ile Leu Phe Gly Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asp
370 375 380
gta tat ggc gat aac taaaatgttt tcaatatgat gttgttaatg at1260
Val Tyr Gly Asp Asn
385
<210>5
<211>389
<212>PRT
<213>绿草履虫小球藻病毒1
<400>5
Met Ser Arg Ile Ala Val Val Gly Cys Gly Tyr Val Gly Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ala Val Leu Leu Ala Gln Lys Asn Glu Val Ile Val Leu Asp Ile Ser
20 25 30
Glu Asp Arg Val Gln Leu Ile Lys Asn Lys Lys Ser Pro Ile Glu Asp
35 40 45
Lys Glu Ile Glu Glu Phe Leu Glu Thr Lys Asp Leu Asn Leu Thr Ala
50 55 60
Thr Thr Asp Lys Val Leu Ala Tyr Glu Asn Ala Glu Phe Val Ile Ile
65 70 75 80
Ala Thr Pro Thr Asp Tyr Asp Val Val Thr Arg Tyr Phe Asn Thr Lys
85 90 95
Ser Val Glu Asn Val Ile Gly Asp Val Ile Lys Asn Thr Gln Thr His
100 105 110
Pro Thr Ile Val Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Val Asp Lys
115 120 125
Val Arg Glu Gln Phe Asp Tyr Gln Asn Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe
130 135 140
Leu Arg Glu Gly Arg Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile
145 150 155 160
Ile Val Gly Asp Asp Ser Pro Ile Ala Leu Lys Phe Ala Asn Leu Leu
165 170 175
Val Glu Gly Ser Lys Thr Pro Leu Ala Pro Val Leu Thr Met Gly Thr
180 185 190
Arg Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ser Asn Thr Tyr Leu Ala Met
195 200 205
Arg Val Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Phe Ala Met Ser His Gly
210 215 220
Met Asn Ala Lys Glu Ile Ile Asp Gly Val Thr Leu Glu Pro Arg Ile
225 230 235 240
Gly Gln Gly Tyr Ser Asn Pro Ser Phe Gly Tyr Gly Ala Tyr Cys Phe
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Phe Glu Gly Val Pro Gln
260 265 270
Asp Ile Ile Gly Ala Ile Val Glu Ser Asn Glu Thr Arg Lys Glu Val
275 280 285
Ile Val Ser Glu Val Glu Asn Arg Phe Pro Thr Thr Val Gly Val Tyr
290 295 300
Lys Leu Ala Ala Lys Ala Gly Ser Asp Asn Phe Arg Ser Ser Ala Ile
305 310 315 320
Val Asp Ile Met Glu Arg Leu Ala Asn Lys Gly Tyr His Ile Lys Ile
325 330 335
Phe Glu Pro Thr Val Glu Gln Phe Glu Asn Phe Glu Val Asp Asn Asn
340 345 350
Leu Thr Thr Phe Ala Thr Glu Ser Asp Val Ile Ile Ala Asn Arg Val
355 360 365
Pro Val Glu His Arg Ile Leu Phe Gly Lys Lys Leu Ile Thr Arg Asp
370 375 380
Val Tyr Gly Asp Asn
385
<210>6
<211>1170
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码具有UDP-Glc-DH活性的绿草履虫小球藻病毒蛋白的合成的序列
<400>6
atgtctcgca tagctgttgt aggatgtggc tatgtgggaa ctgcatgtgc ggttctactt 60
gctcaaaaga acgaagttat tgtgcttgat attagtgaag accgtgttca acttattaag 120
aacaagaagt ctcctattga ggataaggaa atcgaagagt tcttggaaac aaaggatctt 180
aatcttactg cgactacaga taaggttctt gcctacgaga acgctgagtt tgtgataatc 240
gctacaccaa ccgattacga cgttgtgact cgatatttca ataccaaatc cgtggaaaac 300
gttataggag atgttatcaa gaacactcaa acccacccta ctatcgtcat caagtccaca 360
attcccatcg gtttcgttga taaggtcaga gagcagtttg attatcaaaa cattatcttc 420
tcacctgagt tcttaaggga gggtcgtgct ctctacgata atttgtatcc gtcccgtatt 480
atcgttggcg acgattctcc tatcgctctc aagttcgcaa atctcttagt tgagggtagt 540
aagacccctt tggctcctgt tttgacaatg ggaaccagag aagcagaagc tgtcaagcta 600
ttctctaata cctaccttgc catgagggta gcatacttta acgaacttga tacatttgct 660
atgtcgcatg gtatgaatgc caaggagatt atagatggtg tcactttaga gcccaggatc 720
ggtcaaggat attctaaccc atcattcggc tatggagctt actgctttcc taaggacact 780
aagcagttgc tggcaaactt cgagggagtt cctcaagaca tcataggcgc tattgtggag 840
tcaaacgaaa caaggaaaga ggtgatagtt agtgaggtag agaatcgttt cccaacgaca 900
gtcggtgttt acaaactggc agctaaagct ggtagcgata acttcaggtc aagtgctatt 960
gtcgacatca tggaacgcct ggctaacaaa ggttaccaca ttaagatctt tgagccaact 1020
gtagagcagt tcgaaaattt cgaagttgac aataacttga caacgtttgc tactgagtca 1080
gacgttatta tcgcaaatcg tgtccctgtg gaacatagaa tcctatttgg aaagaagctc 1140
attaccagag atgtttacgg tgataattaa 1170
<210>7
<211>2298
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(150)..(2192)
<220>
<221>突变
<222>(1060)..(1060)
<223>插入质粒IC 370-256中的序列含有在位置1060处由G到A的交换
<220>
<221>等位基因
<222>(1190)..(1190)
<223>插入质粒IC 365-256中的序列含有在位置1190处由T到C的碱基交换
<220>
<221>突变
<222>(1245)..(1245)
<223>插入质粒IC 370-256中的序列含有在位置1245处由T到C的交换
<220>
<221>等位基因
<222>(2027)..(2027)
<223>插入质粒IC 365-256中的序列含有在位置2027处由G到A的碱基交换
<300>
<308>BC050762.1
<309>2005-03-08
<313>(150)..(2195)
<400>7
gagagcgaag cgagcgctga gtcggactgt cgggtctgag ctgtcgcatc ccagagtcct 60
ctcattgcca ccaccccggc ccgagctcac cctcgcttct gaagctctcc gcgcgcccga 120
cagctcagcc ctcgcccgtg accaacatc atg tgc ggt ata ttt gct tat tta173
Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu
1 5
aat tac cat gtt cct cga aca aga cga gaa atc ttg gag aca cta atc221
Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile
10 15 20
aaa ggc ctt cag aga ctg gaa tac aga gga tat gat tct gct ggt gtg269
Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val
25 30 35 40
gga ctt gac gga ggc aat gac aaa gac tgg gaa gcc aac gcc tgc aaa317
Gly Leu Asp Gly Gly Asn Asp Lys Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys
45 50 55
atc cag ctc att aag aag aaa gga aaa gtt aag gca ctg gat gaa gaa365
Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val Lys Ala Leu Asp Glu Glu
60 65 70
gtt cac aaa caa caa gat atg gac ttg gat ata gaa ttt gat gtg cat413
Val His Lys Gln Gln Asp Met Asp Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His
75 80 85
ctt gga ata gct cat acc cgt tgg gcg aca cat gga gaa ccc aat cct461
Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu Pro Asn Pro
90 95 100
gtc aat agt cac ccc cag cgc tct gat aaa aat aat gaa ttc att gtt509
Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val
105 110 115 120
att cat aat gga atc atc acc aac tac aaa gac ttg aaa aag ttt ctg557
Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu
125 130 135
gaa agc aaa ggc tat gac ttt gaa tct gaa aca gac aca gaa acc att605
Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile
140 145 150
gcc aag ctc gtc aag tac atg tat gac aac tgg gag agc cag gac gtc653
Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr Asp Asn Trp Glu Ser Gln Asp Val
155 160 165
agt ttt acc acc ttg gtg gag aga gtt atc caa caa ttg gaa ggc gcc701
Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala
170 175 180
ttt gct ctt gtg ttt aaa agt gtc cat ttt ccc ggg caa gca gtt ggc749
Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly
185 190 195 200
aca agg cga ggt agc cct ctc ttg att ggt gtg cgg agt gaa cat aag797
Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys
205 210 215
ctt tct aca gat cac att ccg att ctg tac aga aca ggc aaa gac aag845
Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Asp Lys
220 225 230
aaa gga agc tgc ggt ctt tcc cgt gtg gac agc acg aca tgc ctg ttc893
Lys Gly Ser Cys Gly Leu Ser Arg Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe
235 240 245
cct gtt gag gaa aag gca gtt gaa tat tac ttt gct tct gat gca agt941
Pro Val Glu Glu Lys Ala Val Glu Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser
250 255 260
gcc gtg ata gag cac acc aat cgt gtc atc ttt ctg gaa gat gat gat989
Ala Val Ile Glu His Thr Asn Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp
265 270 275 280
gtt gca gca gtg gtg gat ggc cgt ctc tct atc cac cga att aaa cga1037
Val Ala Ala Val Val Asp Gly Arg Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg
285 290 295
act gca gga gac cat cct ggc cga gct gtg caa act ctc cag atg gag1085
Thr Ala Gly Asp His Pro Gly Arg Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu
300 305 310
ctc cag cag atc atg aag ggc aac ttt agt tca ttt atg cag aag gaa1133
Leu Gln Gln Ile Met Lys Gly Asn Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu
315 320 325
att ttt gag cag cca gaa tct gtt gtg aac aca atg aga gga aga gtc1181
Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser Val Val Asn Thr Met Arg Gly Arg Val
330 335 340
aat ttt gat gac tac act gtg aat ttg gga ggt ttg aaa gat cac att1229
Asn Phe Asp Asp Tyr Thr Val Asn Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Ile
345 350 355 360
aag gag atc cag cgg tgt cgg cgg ttg att ctt att gct tgt ggc aca1277
Lys Glu Ile Gln Arg Cys Arg Arg Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr
365 370 375
agt tac cac gct ggt gtg gca acc cgt cag gtc ctg gag gag ctg acc1325
Ser Tyr His Ala Gly Val Ala Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr
380 385 390
gag ctg ccc gtg atg gtg gag ctt gcc agt gac ttc ttg gat aga aac1373
Glu Leu Pro Val Met Val Glu Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn
395 400 405
act cca gtc ttt cga gat gat gtt tgc ttt ttc att agt caa tca ggc1421
Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp Val Cys Phe Phe Ile Ser Gln Ser Gly
410 415 420
gag aca gct gac acc ctg atg gga ctt cgt tac tgt aag gag aga gga1469
Glu Thr Ala Asp Thr Leu Met Gly Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly
425 430 435 440
gcc tta act gtg ggg atc aca aat aca gtc ggc agt tct ata tca agg1517
Ala Leu Thr Val Gly Ile Thr Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg
445 450 455
gag aca gat tgc ggg gtt cat att aat gct ggt cct gag att ggc gtg1565
Glu Thr Asp Cys Gly Val His Ile Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val
460 465 470
gcc agt aca aag gca tac acc agc cag ttt gtg tcc ctc gtg atg ttt1613
Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser Gln Phe Val Ser Leu Val Met Phe
475 480 485
gct ctc atg atg tgt gat gac agg atc tcc atg caa gag aga cgc aaa1661
Ala Leu Met Met Cys Asp Asp Arg Ile Ser Met Gln Glu Arg Arg Lys
490 495 500
gag atc atg ctc gga ctg aag cga ctg ccg gac ttg att aag gaa gtg1709
Glu Ile Met Leu Gly Leu Lys Arg Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu Val
505 510 515 520
ctg agc atg gat gat gaa atc cag aag ctg gcg acg gag ctt tac cac1757
Leu Ser Met Asp Asp Glu Ile Gln Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His
525 530 535
cag aag tcg gtc ctg ata atg ggg cgg ggc tac cat tat gct aca tgc1805
Gln Lys Ser Val Leu Ile Met Gly Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys
540 545 550
ctt gaa ggg gct ctg aaa atc aag gag att act tat atg cat tcg gaa1853
Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu
555 560 565
ggc atc ctt gct ggt gag ctc aag cac ggc cct ctg gcc ttg gtg gac1901
Gly Ile Leu Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp
570 575 580
aag ttg atg cct gtc atc atg atc atc atg cga gac cac act tat gcc1949
Lys Leu Met Pro Val Ile Met Ile Ile Met Arg Asp His Thr Tyr Ala
585 590 595 600
aag tgc cag aac gct ctt cag cag gtg gtt gca cgg cag ggg cgt cca1997
Lys Cys Gln Asn Ala Leu Gln Gln Val Val Ala Arg Gln Gly Arg Pro
605 610 615
gtc gtg atc tgt gat aag gag gat act gag acc att aag aat aca aaa2045
Val Val Ile Cys Asp Lys Glu Asp Thr Glu Thr Ile Lys Asn Thr Lys
620 625 630
agg aca atc aag gtg ccc cac tca gtg gac tgc ttg cag ggc att ctc2093
Arg Thr Ile Lys Val Pro His Ser Val Asp Cys Leu Gln Gly Ile Leu
635 640 645
agt gtg att ccc ctg cag ctg ctg gct ttc cac ctg gct gtg ctg aga2141
Ser Val Ile Pro Leu Gln Leu Leu Ala Phe His Leu Ala Val Leu Arg
650 655 660
ggc tac gat gtt gat ttt cca cgg aat ctt gcc aaa tct gta aca gta2189
Gly Tyr Asp Val Asp Phe Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
665 670 675 680
gag taacagacac ctgaaactta agacagttaa gcaacacgag ataccttttg 2242
Glu
tatttaaatt tttgatttaa actatcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2298
<210>8
<211>681
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>8
Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Leu Asn Tyr His Val Pro Arg Thr Arg
1 5 10 15
Arg Glu Ile Leu Glu Thr Leu Ile Lys Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr
20 25 30
Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val Gly Leu Asp Gly Gly Asn Asp Lys
35 40 45
Asp Trp Glu Ala Asn Ala Cys Lys Ile Gln Leu Ile Lys Lys Lys Gly
50 55 60
Lys Val Lys Ala Leu Asp Glu Glu Val His Lys Gln Gln Asp Met Asp
65 70 75 80
Leu Asp Ile Glu Phe Asp Val His Leu Gly Ile Ala His Thr Arg Trp
85 90 95
Ala Thr His Gly Glu Pro Asn Pro Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser
100 105 110
Asp Lys Asn Asn Glu Phe Ile Val Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn
115 120 125
Tyr Lys Asp Leu Lys Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Asp Phe Glu
130 135 140
Ser Glu Thr Asp Thr Glu Thr Ile Ala Lys Leu Val Lys Tyr Met Tyr
145 150 155 160
Asp Asn Trp Glu Ser Gln Asp Val Ser Phe Thr Thr Leu Val Glu Arg
165 170 175
Val Ile Gln Gln Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Val
180 185 190
His Phe Pro Gly Gln Ala Val Gly Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu
195 200 205
Ile Gly Val Arg Ser Glu His Lys Leu Ser Thr Asp His Ile Pro Ile
210 215 220
Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Asp Lys Lys Gly Ser Cys Gly Leu Ser Arg
225 230 235 240
Val Asp Ser Thr Thr Cys Leu Phe Pro Val Glu Glu Lys Ala Val Glu
245 250 255
Tyr Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Val Ile Glu His Thr Asn Arg
260 265 270
Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp Val Ala Ala Val Val Asp Gly Arg
275 280 285
Leu Ser Ile His Arg Ile Lys Arg Thr Ala Gly Asp His Pro Gly Arg
290 295 300
Ala Val Gln Thr Leu Gln Met Glu Leu Gln Gln Ile Met Lys Gly Asn
305 310 315 320
Phe Ser Ser Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser Val
325 330 335
Val Asn Thr Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Asp Asp Tyr Thr Val Asn
340 345 350
Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Ile Lys Glu Ile Gln Arg Cys Arg Arg
355 360 365
Leu Ile Leu Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Gly Val Ala Thr
370 375 380
Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val Glu Leu
385 390 395 400
Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp Val
405 410 415
Cys Phe Phe Ile Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu Met Gly
420 425 430
Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile Thr Asn
435 440 445
Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly Val His Ile
450 455 460
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500 505 510
Leu Pro Asp Leu Ile Lys Glu Val Leu Ser Met Asp Asp Glu Ile Gln
515 520 525
Lys Leu Ala Thr Glu Leu Tyr His Gln Lys Ser Val Leu Ile Met Gly
530 535 540
Arg Gly Tyr His Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys
545 550 555 560
Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu Gly Ile Leu Ala Gly Glu Leu Lys
565 570 575
His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp Lys Leu Met Pro Val Ile Met Ile
580 585 590
Ile Met Arg Asp His Thr Tyr Ala Lys Cys Gln Asn Ala Leu Gln Gln
595 600 605
Val Val Ala Arg Gln Gly Arg Pro Val Val Ile Cys Asp Lys Glu Asp
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Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu
675 680
<210>9
<211>2049
<212>DNA
<213>小家鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2046)
<300>
<308>BC031928.1
<309>2003-10-07
<313>(51)..(299)
<400>9
atg tgc gga atc ttt gcc tac atg aat tac aga gtt ccc aag aca agg48
Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Met Asn Tyr Arg Val Pro Lys Thr Arg
1 5 10 15
aaa gag att ttc gaa acc ctt atc agg ggt ctg cag cgg ctg gag tac96
Lys Glu Ile Phe Glu Thr Leu Ile Arg Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr
20 25 30
cgg ggc tat gac tct gcg ggg gtt gcc att gat ggg aat aac cac gaa144
Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val Ala Ile Asp Gly Asn Asn His Glu
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gtc aaa gaa aga cac atc cat ctt gtg aag aaa agg ggg aaa gta aag192
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50 55 60
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gag ttt gag aca cac ttc ggc att gcc cac aca cgt tgg gcc acc cac288
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Gly Val Pro Asn Ala Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser Asp Lys Asp
100 105 110
aat gaa ttt gtt gtc atc cac aac ggg atc atc act aat tac aag gat384
Asn Glu Phe Val Val Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn Tyr Lys Asp
115 120 125
cta agg aag ttt ctg gaa agc aaa ggc tac gag ttt gag tca gaa aca432
Leu Arg Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Phe Glu Ser Glu Thr
130 135 140
gac acg gag acc atc gcc aag ctg att aaa tat gta ttt gac aac aga480
Asp Thr Glu Thr Ile Ala Lys Leu Ile Lys Tyr Val Phe Asp Asn Arg
145 150 155 160
gag act gag gac ata acg ttt tcc aca ttg gtc gaa aga gtc att cag528
Glu Thr Glu Asp Ile Thr Phe Ser Thr Leu Val Glu Arg Val Ile Gln
165 170 175
cag ttg gaa ggc gcc ttt gca ctg gtt ttc aag agt att cac tac ccg576
Gln Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Ile His Tyr Pro
180 185 190
gga gaa gct gtc gcc acg agg aga ggc agc ccc ttg ctc atc ggg gta624
Gly Glu Ala Val Ala Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu Ile Gly Val
195 200 205
cga agc aaa tac aaa ctc tcc aca gag cag atc ccc gtc tta tat ccg672
Arg Ser Lys Tyr Lys Leu Ser Thr Glu Gln Ile Pro Val Leu Tyr Pro
210 215 220
aca tgc aat atc gag aat gtg aag aat atc tgc aag act agg atg aag720
Thr Cys Asn Ile Glu Asn Val Lys Asn Ile Cys Lys Thr Arg Met Lys
225 230 235 240
aga ctg gac agc tcc acc tgc ctg cac gct gtg ggc gat aaa gct gtg768
Arg Leu Asp Ser Ser Thr Cys Leu His Ala Val Gly Asp Lys Ala Val
245 250 255
gaa ttc ttc ttt gct tct gat gca agt gcc atc ata gaa cac acc aac816
Glu Phe Phe Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Ile Ile Glu His Thr Asn
260 265 270
cgg gtc atc ttc tta gaa gat gat gat atc gct gca gtg gct gat ggg864
Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp Ile Ala Ala Val Ala Asp Gly
275 280 285
aaa ctc tcc att cac cga gtc aag cgc tca gct act gat gac ccc tcc912
Lys Leu Ser Ile His Arg Val Lys Arg Ser Ala Thr Asp Asp Pro Ser
290 295 300
cga gcc atc cag acc ttg cag atg gaa ctg cag caa ata atg aaa ggt960
Arg Ala Ile Gln Thr Leu Gln Met Glu Leu Gln Gln Ile Met Lys Gly
305 310 315 320
aac ttc agc gca ttt atg cag aag gag atc ttc gag cag cca gaa tca1008
Asn Phe Ser Ala Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser
325 330 335
gtt ttt aat acc atg aga ggt cgg gtg aat ttt gag acc aac aca gtg1056
Val Phe Asn Thr Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Glu Thr Asn Thr Val
340 345 350
ctc ctg ggt ggc ttg aag gac cat ttg aaa gag atc cga cga tgc cga1104
Leu Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Leu Lys Glu Ile Arg Arg Cys Arg
355 360 365
agg ctc att gtg att ggc tgt gga acc agc tac cat gcc gct gtg gct1152
Arg Leu Ile Val Ile Gly Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Ala Val Ala
370 375 380
aca cgg caa gtc tta gag gaa ctg acc gag ctg cct gtg atg gtt gaa1200
Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val Glu
385 390 395 400
ctt gcc agt gac ttt ctg gac agg aac aca cct gtg ttc agg gat gac1248
Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp
405 410 415
gtt tgc ttt ttc ata agc caa tca ggt gag act gca gac acg ctc ctg1296
Val Cys Phe Phe Ile Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu Leu
420 425 430
gcg ctg cga tac tgt aag gat cga ggt gcg ctg acc gtg ggc atc acc1344
Ala Leu Arg Tyr Cys Lys Asp Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile Thr
435 440 445
aac acc gtg ggt agc tcc atc tcc cgg gag act gac tgt ggc gtc cac1392
Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly Val His
450 455 460
atc aac gca ggg ccc gag att ggg gtg gcc agc acc aag gcg tac acc1440
Ile Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr
465 470 475 480
agc cag ttc atc tct ctg gtg atg ttt ggt ttg atg atg tct gaa gat1488
Ser Gln Phe Ile Ser Leu Val Met Phe Gly Leu Met Met Ser Glu Asp
485 490 495
cga att tct cta cag aac agg aga caa gag atc atc cgt ggc ctc aga1536
Arg Ile Ser Leu Gln Asn Arg Arg Gln Glu Ile Ile Arg Gly Leu Arg
500 505 510
tct tta ccg gag ctg atc aaa gaa gtg ctg tcc ctg gat gag aag atc1584
Ser Leu Pro Glu Leu Ile Lys Glu Val Leu Ser Leu Asp Glu Lys Ile
515 520 525
cat gac ttg gcc ctg gag ctc tac aca caa agg tct ctc ctc gtg atg1632
His Asp Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Ser Leu Leu Val Met
530 535 540
gga cgg gga tat aac tat gcc aca tgt ctg gaa ggt gcc ttg aaa att1680
Gly Arg Gly Tyr Asn Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile
545 550 555 560
aag gag ata acc tac atg cat tca gaa ggt atc cta gcc gga gag ctg1728
Lys Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu Gly Ile Leu Ala Gly Glu Leu
565 570 575
aag cac ggg ccc ctt gct ctc gtc gac aag cag atg cca gtc atc atg1776
Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp Lys Gln Met Pro Val Ile Met
580 585 590
gtc atc atg aag gat cct tgc ttt gcc aag tgc cag aat gcc ctg cag1824
Val Ile Met Lys Asp Pro Cys Phe Ala Lys Cys Gln Asn Ala Leu Gln
595 600 605
cag gtc act gcc cgc cag ggt cgc cca atc ata ctg tgt tcc aag gat1872
Gln Val Thr Ala Arg Gln Gly Arg Pro Ile Ile Leu Cys Ser Lys Asp
610 615 620
gac acc gag agc tcc aag ttt gca tat aaa acc att gaa ctt ccc cac1920
Asp Thr Glu Ser Ser Lys Phe Ala Tyr Lys Thr Ile Glu Leu Pro His
625 630 635 640
aca gtg gac tgt ctc cag ggt atc ctg agc gtg att cca ctc cag ctt1968
Thr Val Asp Cys Leu Gln Gly Ile Leu Ser Val Ile Pro Leu Gln Leu
645 650 655
ctg tcc ttc cac ctg gct gtc ctc cga ggt tat gat gtt gac ttc ccc2016
Leu Ser Phe His Leu Ala Val Leu Arg Gly Tyr Asp Val Asp Phe Pro
660 665 670
aga aac cta gcc aag tct gtc act gtg gaa tga2049
Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu
675 680
<210>10
<211>682
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>10
Met Cys Gly Ile Phe Ala Tyr Met Asn Tyr Arg Val Pro Lys Thr Arg
1 5 10 15
Lys Glu Ile Phe Glu Thr Leu Ile Arg Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr
20 25 30
Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Val Ala Ile Asp Gly Asn Asn His Glu
35 40 45
Val Lys Glu Arg His Ile His Leu Val Lys Lys Arg Gly Lys Val Lys
50 55 60
Ala Leu Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Gln Asp Ser Met Asp Leu Lys Val
65 70 75 80
Glu Phe Glu Thr His Phe Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His
85 90 95
Gly Val Pro Asn Ala Val Asn Ser His Pro Gln Arg Ser Asp Lys Asp
100 105 110
Asn Glu Phe Val Val Ile His Asn Gly Ile Ile Thr Asn Tyr Lys Asp
115 120 125
Leu Arg Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Phe Glu Ser Glu Thr
130 135 140
Asp Thr Glu Thr Ile Ala Lys Leu Ile Lys Tyr Val Phe Asp Asn Arg
145 150 155 160
Glu Thr Glu Asp Ile Thr Phe Ser Thr Leu Val Glu Arg Val Ile Gln
165 170 175
Gln Leu Glu Gly Ala Phe Ala Leu Val Phe Lys Ser Ile His Tyr Pro
180 185 190
Gly Glu Ala Val Ala Thr Arg Arg Gly Ser Pro Leu Leu Ile Gly Val
195 200 205
Arg Ser Lys Tyr Lys Leu Ser Thr Glu Gln Ile Pro Val Leu Tyr Pro
210 215 220
Thr Cys Asn Ile Glu Asn Val Lys Asn Ile Cys Lys Thr Arg Met Lys
225 230 235 240
Arg Leu Asp Ser Ser Thr Cys Leu His Ala Val Gly Asp Lys Ala Val
245 250 255
Glu Phe Phe Phe Ala Ser Asp Ala Ser Ala Ile Ile Glu His Thr Asn
260 265 270
Arg Val Ile Phe Leu Glu Asp Asp Asp Ile Ala Ala Val Ala Asp Gly
275 280 285
Lys Leu Ser Ile His Arg Val Lys Arg Ser Ala Thr Asp Asp Pro Ser
290 295 300
Arg Ala Ile Gln Thr Leu Gln Met Glu Leu Gln Gln Ile Met Lys Gly
305 310 315 320
Asn Phe Ser Ala Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Glu Ser
325 330 335
Val Phe Asn Thr Met Arg Gly Arg Val Asn Phe Glu Thr Asn Thr Val
340 345 350
Leu Leu Gly Gly Leu Lys Asp His Leu Lys Glu Ile Arg Arg Cys Arg
355 360 365
Arg Leu Ile Val Ile Gly Cys Gly Thr Ser Tyr His Ala Ala Val Ala
370 375 380
Thr Arg Gln Val Leu Glu Glu Leu Thr Glu Leu Pro Val Met Val Glu
385 390 395 400
Leu Ala Ser Asp Phe Leu Asp Arg Asn Thr Pro Val Phe Arg Asp Asp
405 410 415
Val Cys Phe Phe Ile Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Leu Leu
420 425 430
Ala Leu Arg Tyr Cys Lys Asp Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile Thr
435 440 445
Asn Thr Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg Glu Thr Asp Cys Gly Val His
450 455 460
Ile Asn Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr
465 470 475 480
Ser Gln Phe Ile Ser Leu Val Met Phe Gly Leu Met Met Ser Glu Asp
485 490 495
Arg Ile Ser Leu Gln Asn Arg Arg Gln Glu Ile Ile Arg Gly Leu Arg
500 505 510
Ser Leu Pro Glu Leu Ile Lys Glu Val Leu Ser Leu Asp Glu Lys Ile
515 520 525
His Asp Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Thr Gln Arg Ser Leu Leu Val Met
530 535 540
Gly Arg Gly Tyr Asn Tyr Ala Thr Cys Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile
545 550 555 560
Lys Glu Ile Thr Tyr Met His Ser Glu Gly Ile Leu Ala Gly Glu Leu
565 570 575
Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Val Asp Lys Gln Met Pro Val Ile Met
580 585 590
Val Ile Met Lys Asp Pro Cys Phe Ala Lys Cys Gln Asn Ala Leu Gln
595 600 605
Gln Val Thr Ala Arg Gln Gly Arg Pro Ile Ile Leu Cys Ser Lys Asp
610 615 620
Asp Thr Glu Ser Ser Lys Phe Ala Tyr Lys Thr Ile Glu Leu Pro His
625 630 635 640
Thr Val Asp Cys Leu Gln Gly Ile Leu Ser Val Ile Pro Leu Gln Leu
645 650 655
Leu Ser Phe His Leu Ala Val Leu Arg Gly Tyr Asp Val Asp Phe Pro
660 665 670
Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu
675 680
<210>11
<211>1830
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1827)
<300>
<308>U00096.2
<309>2005-09-08
<313>(3909862)..(3911691)
<400>11
atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc48
Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile
1 5 10 15
ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc96
Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
20 25 30
ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc144
Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
35 40 45
ctc ggt aaa gtc cag atg ctg gca cag gca gcg gaa gaa cat cct ctg192
Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
50 55 60
cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa240
His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu
65 70 75 80
cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg288
Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
85 90 95
gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta336
Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
100 105 110
aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att384
Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
115 120 125
gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag432
Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130 135 140
gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg480
Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val
145 150 155 160
atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt528
Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
165 170 175
agt ccg ctg gtg att ggc ctg ggg atg ggc gaa aac ttt atc gct tct576
Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
180 185 190
gac cag ctg gcg ctg ttg ccg gtg acc cgt cgc ttt atc ttc ctt gaa624
Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
195 200 205
gag ggc gat att gcg gaa atc act cgc cgt tcg gta aac atc ttc gat672
Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210 215 220
aaa act ggc gcg gaa gta aaa cgt cag gat atc gaa tcc aat ctg caa720
Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln
225 230 235 240
tat gac gcg ggc gat aaa ggc att tac cgt cac tac atg cag aaa gag768
Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
245 250 255
atc tac gaa cag ccg aac gcg atc aaa aac acc ctt acc gga cgc atc816
Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
260 265 270
agc cac ggt cag gtt gat tta agc gag ctg gga ccg aac gcc gac gaa864
Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
275 280 285
ctg ctg tcg aag gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct912
Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290 295 300
tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt960
Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly
305 310 315 320
att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct1008
Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
325 330 335
gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa1056
Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
340 345 350
acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac1104
Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
355 360 365
ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc1152
Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370 375 380
gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg1200
Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val
385 390 395 400
gca tcc act aaa gca ttc acc act cag tta act gtg ctg ttg atg ctg1248
Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
405 410 415
gtg gcg aag ctg tct cgc ctg aaa ggt ctg gat gcc tcc att gaa cat1296
Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
420 425 430
gac atc gtg cat ggt ctg cag gcg ctg ccg agc cgt att gag cag atg1344
Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
435 440 445
ctg tct cag gac aaa cgc att gaa gcg ctg gca gaa gat ttc tct gac1392
Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450 455 460
aaa cat cac gcg ctg ttc ctg ggc cgt ggc gat cag tac cca atc gcg1440
Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala
465 470 475 480
ctg gaa ggc gca ttg aag ttg aaa gag atc tct tac att cac gct gaa1488
Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
485 490 495
gcc tac gct gct ggc gaa ctg aaa cac ggt ccg ctg gcg cta att gat1536
Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
500 505 510
gcc gat atg ccg gtt att gtt gtt gca ccg aac aac gaa ttg ctg gaa1584
Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
515 520 525
aaa ctg aaa tcc aac att gaa gaa gtt cgc gcg cgt ggc ggt cag ttg1632
Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530 535 540
tat gtc ttc gcc gat cag gat gcg ggt ttt gta agt agc gat aac atg1680
Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met
545 550 555 560
cac atc atc gag atg ccg cat gtg gaa gag gtg att gca ccg atc ttc1728
His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
565 570 575
tac acc gtt ccg ctg cag ctg ctg gct tac cat gtc gcg ctg atc aaa1776
Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
580 585 590
ggc acc gac gtt gac cag ccg cgt aac ctg gca aaa tcg gtt acg gtt1824
Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
595 600 605
gag taa1830
Glu
<210>12
<211>609
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>12
Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
20 25 30
Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
35 40 45
Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
50 55 60
His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu
65 70 75 80
Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
85 90 95
Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
100 105 110
Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
115 120 125
Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130 135 140
Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val
145 150 155 160
Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
165 170 175
Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
195 200 205
Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210 215 220
Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln
225 230 235 240
Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
245 250 255
Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
260 265 270
Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
275 280 285
Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290 295 300
Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly
305 310 315 320
Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
325 330 335
Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
340 345 350
Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
355 360 365
Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370 375 380
Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val
385 390 395 400
Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
405 410 415
Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
420 425 430
Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
435 440 445
Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450 455 460
Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala
465 470 475 480
Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
485 490 495
Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
500 505 510
Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
515 520 525
Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530 535 540
Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met
545 550 555 560
His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
565 570 575
Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
580 585 590
Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
595 600 605
Glu
<210>13
<211>1830
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码具有GFAT活性的大肠杆菌蛋白的合成的序列
<400>13
atgtgcggaa ttgttggtgc tatcgcccaa agagacgttg ctgagatttt gttagagggt60
ctgcgaaggc tagagtatag aggatatgac tccgctggtc tggctgtcgt tgatgctgag120
ggtcatatga caaggctaag aaggttagga aaggttcaga tgcttgctca ggcagctgag180
gaacatccat tgcatggagg tactggtatt gcacatacca ggtgggctac tcatggggag240
ccatcagaag ttaatgctca tccacatgtg agtgagcata tcgttgtagt tcacaatggg300
ataattgaaa accacgaacc attgagggaa gagttaaagg caagaggata tacttttgtg360
agtgagactg acactgaggt tattgcacat ttagtgaact gggaactcaa acaggggggc420
acattgcgtg aggctgtgtt aagagctatt cctcaactta gaggtgcata cggtactgtt480
attatggatt caagacaccc agatactctc cttgcagcta gatcaggtag tcccttggtc540
ataggacttg gaatgggtga aaattttatc gctagcgacc aattggcctt attgccagtt600
acaagacgat ttattttcct tgaagagggc gatattgctg agattactag aaggtctgtg660
aacatctttg ataagactgg cgctgaggtt aaacgtcagg atatcgagtc taaccttcaa720
tacgatgctg gtgataaagg aatttacagg cattatatgc aaaaggaaat ttatgaacaa780
ccaaatgcta tcaaaaacac acttactggc cgtatttctc atggacaggt cgatttaagc840
gagcttggtc ctaatgcaga cgaactgcta tcaaaagttg agcacataca gatactggca900
tgcggaacta gttataattc aggaatggtc tctagatact ggttcgaaag cttggcaggt960
ataccttgtg atgtagagat cgcttctgag tttaggtata gaaagtctgc tgtgcgtaga1020
aattcattaa tgattacatt atctcaatcc ggagaaacag cagatacact ggctggattg 1080
aggctttcta aggaactcgg atatctgggt tcacttgcta tttgtaatgt accaggttcc1140
tcattggttc gtgaatcaga tctagcactt atgacaaatg caggaactga aataggtgtg1200
gcaagtacca aggctttcac aacccaactg accgtacttt taatgttggt agcaaaactc1260
agtcgattaa aggggctaga tgcatctatc gaacatgata ttgttcacgg gcttcaagct1320
ctcccttcaa gaattgaaca aatgctttca caagataaga gaatagaggc attggctgaa1380
gatttttccg acaaacatca cgcattgttt cttggacgtg gcgatcaata tccaattgca1440
ttggaaggag ctttgaagtt gaaagaaata agttacattc acgcagaagc atatgcagct1500
ggagaactca agcatggtcc tttggcactc atcgacgctg acatgcccgt gatcgtagtg1560
gctcctaata acgaactgct cgaaaagctt aaatcaaata tcgaagaggt tcgagctaga1620
ggaggtcagc tttacgtttt cgctgaacaa gatgctggat tcgtgtcaag cgataatatg1680
catataattg aaatgcctca cgttgaagaa gtgattgcac ctatatttta tacagtccca1740
ttgcaacttc tagcttacca tgttgcactt attaaaggaa ctgatgttga tcagcctaga1800
aacctagcaa aatctgtaac agtcgaataa 1830
<210>14
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>14
tcgacaggcc tggatcctta attaaactag tctcgaggag ctcggtac 48
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡核苷酸
<400>15
cgagctcctc gagactagtt taattaagga tccaggcctg 40
权利要求
1. 具有稳定整合入其基因组的编码乙酰透明质酸合成酶的核酸分子的经遗传修饰的植物细胞，其中所述植物细胞与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，额外地具有增加的具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性的蛋白的活性和增加的具有UDP-葡萄糖脱氢酶(UDP-Glc-DH)活性的蛋白的活性。
2. 权利要求1所述的经遗传修饰的植物细胞，其具有稳定地整合入其基因组的一个外源核酸分子或稳定地整合入其基因组的多个外源核酸分子，其中，与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，所述的一个外源核酸分子或所述的多个外源核酸分子增加了具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性的蛋白的活性和增加了具有UDP-葡萄糖脱氢酶(UDP-Glc-DH)活性的蛋白的活性。
3. 权利要求2所述的经遗传修饰的植物细胞，其中第一外源核酸分子编码具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性的蛋白且第二外源核酸分子编码具有UDP-葡萄糖脱氢酶(UDP-Glc-DH)活性的蛋白。
4. 权利要求1、2或3任一项所述的经遗传修饰的植物细胞，其与具有乙酰透明质酸合成酶的活性但没有增加的谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)的活性和没有增加的UDP-葡萄糖脱氢酶活性的植物细胞相比较，合成增加的乙酰透明质酸的量。
5. 包含权利要求1至4任一项所述的经遗传修饰的植物细胞的植物。
6. 权利要求5所述的植物的繁殖材料，其包含权利要求1至4任一项所述的经遗传修饰的植物细胞。
7. 权利要求5所述的植物的可收获的植物部分，其包含权利要求1至4任一项所述的经遗传修饰的植物细胞。
8. 制备合成乙酰透明质酸的植物的方法，其包括
a)遗传修饰植物细胞，其中遗传修饰包括如下步骤i至iii
i)将编码乙酰透明质酸合成酶的外源核酸分子引入植物细胞
ii)将这样的遗传修饰引入植物细胞，该遗传修饰导致了与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性的蛋白的活性增加；
iii)将这样的遗传修饰引入植物细胞，该遗传修饰导致与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，具有谷氨酰胺果糖6-磷酸UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白的活性增加；
其中步骤i至iii可以以任何顺序各自实施，或可以同时实施步骤i至iii的任何组合；
b)从步骤a)的植物细胞再生植物；和
c)根据需要，用根据步骤b)的植物产生进一步的植物，
其中，根据需要，从根据步骤b)或c)的植物分离植物细胞并重复步骤a)至c)的方法直到产生这样的植物，其具有编码乙酰透明质酸合成酶的外源核酸分子，并且与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，具有增加的具有谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性的蛋白的活性，以及与相应的没有经遗传修饰的野生型植物细胞相比较，具有增加的具有谷氨酰胺果糖6-磷酸UDP-葡萄糖脱氢酶活性的蛋白的活性。
9. 制备乙酰透明质酸的方法，其包括从权利要求1至4任一项所述的经遗传修饰的植物细胞、从权利要求5所述的植物、从权利要求6所述的繁殖材料、从权利要求7所述的可收获的植物部分或从通过权利要求8所述的方法可获得的植物提取乙酰透明质酸的步骤。
10. 权利要求1至4任一项所述的经遗传修饰的植物细胞、权利要求5所述的植物、权利要求6所述的繁殖材料、权利要求7所述的可收获的植物部分或通过权利要求8所述的方法可获得的植物用于制备乙酰透明质酸的用途。
11. 组合物，其包含权利要求1至4任一项所述的经遗传修饰的植物细胞。
12. 制备包含乙酰透明质酸的组合物的方法，其中使用了权利要求1至4任一项所述的经遗传修饰的植物细胞、权利要求5所述的植物、权利要求6所述的繁殖材料、权利要求7所述的可收获的植物部分或通过权利要求8所述的方法可获得的植物。
13. 权利要求1至4任一项所述的经遗传修饰的植物细胞、权利要求5所述的植物、权利要求6所述的繁殖材料、权利要求7所述的可收获的植物部分或通过权利要求8所述的方法可获得的植物用于制备权利要求11所述的组合物的用途。
全文摘要
本发明涉及合成增加的乙酰透明质酸的量的植物细胞和植物，并涉及用于制备这类植物的方法，也涉及借助于这些植物细胞或植物制备乙酰透明质酸的方法。在此，与野生型植物细胞或野生型植物相比较，根据本发明的植物细胞或经遗传修饰的植物具有乙酰透明质酸合成酶活性和额外地增加的谷氨酰胺果糖6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)活性和增加的UDP葡萄糖脱氢酶(UDP-Glc-DH)活性。本发明还涉及具有增加的乙酰透明质酸合成的植物用于制备乙酰透明质酸和含有乙酰透明质酸的食物或饲料中的用途。
文档编号C12N9/06GK101277610SQ200680036866
公开日2008年10月1日 申请日期2006年10月5日 优先权日2005年10月5日
发明者C·弗罗贝格, B·埃西格曼 申请人:拜尔作物科学股份公司