双酶梭菌及其用途及纳米金属硫化物的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及双酶梭菌，本发明涉及该双酶梭菌在制备纳米金属硫化物中的应用， 本发明还涉及该双酶梭菌在处理重金属污染物中的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，新兴的生物制备纳米粒子的方法即众多的生物大分子在合适的生理条件 (pH、温度、盐度）下都是天然的纳米反应器。利用微生物体来合成纳米材料的主力军是细 菌，当然利用真菌和病毒等其它微生物体也已制备出许多性能优良、形貌精美的纳米材料。 相对于传统的物理、化学制备的方法，生物法具有其独特的优点，如制备程序简单、细菌易 于控制、条件温和、设备简单、操作方便和成本较低、收率高等。
[0003] 但是，现有技术中，细菌对重金属的耐受浓度普遍不高，这限制了微生物体在制备 纳米材料方面的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种双酶梭菌，本发明还提供了该双酶梭菌在制备纳米金属硫化物中 的应用，本发明还提供了该双酶梭菌在处理重金属污染物中的应用。
[0005] -种双酶梭菌（Clostridiumbifermentans)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo. 9294,保藏日期2014年6月12日。保藏地址为北 京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006] 该双酶梭囷在制备纳米金属硫化物中的应用。
[0007] 制备纳米金属硫化物的方法，包括以下步骤： S10.在培养基中加入含0. 01_5g/L金属盐溶液，调节pH值至4-9,灭菌后冷却至室温， 加入含有双酶梭菌的菌液，获得接种溶液； S20.将接种溶液放置于15-45°C下厌氧培养6~76小时； S30.获得纳米金属硫化物。
[0008] 所述的金属盐溶液中的金属元素为镍、钴、锌、镉、铁、锰、汞、铅、金、银、铜中的一 种或几种。
[0009] 所述的金属盐溶液为硝酸盐溶液、盐酸盐溶液和硫酸盐溶液中的一种或几种。
[0010] 所述的金属盐溶液和/或培养基中还包括镍、钴、锌、镉、铁、锰、汞、铅、金、银、铜 等元素离子的络合物。
[0011] 所述的培养基中包括含硫有机质。
[0012] 该双酶梭菌在处理重金属污染物中的应用。
[0013] 本发明的双酶梭菌具有高的金属离子耐受浓度、在高重金属浓度的环境下，能够 保持良好的活性。能够以原位的方法，应用于制备纳米粒子和处理重金属污染物。
[0014] 说明书附图 图1为实施例1获得的黑色沉淀TEM图。
[0015] 图2为实施例2获得的黑色沉淀TEM图。
[0016] 图3为实施例3获得的黑色沉淀TEM图。
[0017] 图4为实施例4获得的黑色沉淀TEM图。
[0018] 图5为实施例5获得的黑色沉淀TEM图。
[0019] 图6为不同Cd2+浓度对去除情况的影响图（t= 37°C，ρΗ=6· 5)。
[0020] 图7为不同Cu2+浓度对去除情况的影响图（t= 37°C，ρΗ=6. 5)。
[0021] 图8为pH对Cd2+去除率的影响图（t= 37°C，Cd2+为40mg/L)。
[0022] 图9为pH对Cu2+去除率的影响图（t= 37°C，Cu2+为40mg/L)。
[0023] 图10为温度对Cd2+去除率的影响图（ρΗ=6· 5,Cd2+为40mg/L)。
[0024] 图11为温度对Cu2+去除率的影响图（ρΗ=6· 5,Cu2+为40mg/L)。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0026] -株双酶梭菌（Clostridiumbifermentans)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo. 9294,保藏日期2014年6月12日。
[0027] 细菌的获取： 1、采集与富集天然菌株 从浙江某地一家电镀公司废水排放口处采取液样和固样，放入装有30mL己灭菌的生 理盐水的锥形瓶中，放摇床振荡30min，连续稀释至10 - 6倍，然后用移液枪吸取lmL所需 浓度的菌悬液，注入富集培养基内并置于35°C电子恒温培养箱中，培养2-4天。用肉眼观察 培养基内是否有菌生长。
[0028] 2、菌的驯化 取富集样品lmL，接种于驯化培养基中，在35°C、200r/min的摇床上培养72h，再取培 养液lmL进行传代驯化。每72h接种传代1次。经过若干代重金属离子驯化后，选择生长 代谢旺盛、菌丝球丰富、分布均匀者供平板分离初筛。
[0029] 3、初筛方法 蘸取驯化菌液于分离平板上划线，35°C培养48h-72h，观察菌体生长情况，挑选生长优 良的单菌落接种于斜面试管中。
[0030] 4、复筛方法 将初筛得到的菌株分别接种于复筛培养基中进行摇瓶培养，在35 °C、200r/min的摇床 上培养72h，每12h测1次培养基中剩余的重金属离子浓度，淘汰去除重金属离子能力较低 的菌株，将能力较高的菌株接种于扩大培养基中，35°C下进行增殖培养。
[0031] 5、菌种的纯化 菌种的纯化实验采用改良的Brewer皿厌氧琼脂平板进行操作。复筛培养液中取10ml 菌液，放入事先充满氮气并带有数粒玻璃珠的无氧灭菌的培养瓶中，在振荡器中振荡1小 时后将污泥中菌胶团彻底打碎，然后用充满氮气的脱氧无菌水或脱氧无菌生理盐水进行 10倍为基准的梯度稀释，将梯度稀释后的菌液分别接种于固体培养基之中制成滚管，培养 3天。挑取单菌落转接入液体培养基中。重复以上操作若干次，直至管内菌落和显微镜下 的细胞形态一致认为是纯菌株，再进一步用电镜确认。将分离纯化的发酵细菌转接于液体 培养基中，35°C、200r/min振荡培养3天，再次检测培养液中重金属离子剩余浓度，确定获 取对重金属离子去除能力较高的功能菌。
[0032] 6、菌的鉴定 首先在商品哥伦比亚血琼脂培养基厌氧平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司）， 用无菌接种环挑取获得的功能菌种接种于平板，放置于37°C恒温培养箱中培养，观察平板 上菌种的生长状况和细胞形态，直至平板上菌落和显微镜下的细胞形态一致认为是纯菌 株；其次通过对菌株菌落、液体培养特征、细胞形态观察、生理生化特征实验基础上，对其 16SrDNA序列分析研究，最后确定为一株双酶梭菌（Clostridiumbifermentans)，保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo. 9294,保藏日期2014年6 月12日。
[0033] 在1L培养基中加入0. 5g硫酸亚铁，灭菌冷却后再接种5%已经培养好的菌液进行 培养，然后通过不断增加硫酸亚铁的浓度对菌株进行驯化，最终获得对亚铁离子具有耐受 性的优势菌株，最大耐受浓度为5g/L硫酸亚铁。
[0034]双酶梭菌细菌形态：细小菌落、干燥；革兰阳性、芽孢杆菌。基本生化反应：触酶-、氧化酶-、吲哚+、克氏双糖-/_ (生长不良)。
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