一种灵芝酸高产工程菌株Kmust-LS的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和代谢工程领域，通过基因工程对灵芝酸代谢途径中的羊毛 甾醇合酶（LS)基因过表达的方法，构建了一个灵芝酸的高产工程菌株。
【背景技术】
[0002] 灵芝（Ganodermalucidum)是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌。灵芝真菌在 我国有20多种，包括赤芝，黄芝，紫芝，黑芝，薄盖灵芝，树舌等。我国应用灵芝作为药物已有 两千多年的历史。灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护 肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。由于其特殊的要用价值，灵芝的有效成分分析和药理 学研究已经引起了国际上的广泛关注，尤其在日本，美国，韩国等国家。目前，灵芝的研究已 经深入到了分子水平，一些专著相继出版，从不同的角度介绍了灵芝的生物学特性、栽培技 术、药理学作用及临床应用等情况。
[0003]灵芝酸是一类分子结构中含有羧基的三萜类物质，从结构来看它属于高度氧化的 羊毛留烷衍生物。自1982年KubotaT等人首次分离得到灵芝酸以来，目前已有130多种灵芝 酸被分离出来。它们多为四环三萜类化合物，含有30个碳原子，结构中一般都有羟基，在红 外光谱中有较强的羟基吸收峰。在紫外光谱中也呈现多个波长的特征吸收，多数是在250 nm、237nm、365nm处有吸收峰。灵芝酸具有许多重要的药理活性如:抗癌，抑制小鼠肝肉瘤 (HTC)细胞的增殖;护肝，灵芝中的灵芝酸提取物能加强其解毒作用;抗HIV;降血压;抗 氧化;抑制血小板凝集，抑制组胺释放，镇痛，抑制真核细胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋 白转移酶活性和促进体液免疫功能等作用。
[0004]羊毛留醇合酶（LS)基因是灵芝酸合成途径中的一个较为重要的基因。它主要 催化鲨烯2，3-氧化物转化为羊毛留醇，进而合成灵芝酸。灵芝酸是通过甲羟戊酸途径合成 的。这条途径普遍存在于动物，植物，真菌。首先是由乙酰辅酶A(AcetylCoA)在硫解酶 (AcetoacetylCoAthiolase)催化下缩合形成乙酰乙酰辅酶A(AcetoacetylCoA)， 乙酰乙酰辅酶A经HMG-CoA合成酶（HMG-CoAsynthase)催化与另一分子乙酰CoA缩合生 成3-羟基-3甲基-戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)，然后HMG-CoA还原酶（HMG-CoA reductase,HMGR)催化HMG-CoA转化为甲羟戊酸。甲羟戊酸经甲羟戊酸激酶（MVK)、甲 羟戊酸5-磷酸激酶（PMK)和MDD三步酶促反应转化为IPPJPP进一步转化成法呢酯焦磷 酸FPPJPP在鲨烯合酶（SQS)的催化下合成鲨烯SQS后经过鲨烯单加氧酶的作用产生 藍稀2，3-氧化物，再经过羊毛留醇合酶lanosterolsynthasee(LS)的作用产生羊毛 甾醇。最后通过不同酶的修饰作用产生不同结构的灵芝三萜。灵芝酸的合成途径如下所示：
由于野生灵芝生长周期长，受环境因素影响大且野生灵芝资源有限，灵芝菌丝培养成 为生产活性物质的重要方法。随着对灵芝活性物质需求的不断增加，如何提高灵芝酸的产 量和增加灵芝的有效成分越来越引起人们的关注。液体深层发酵技术是进行快速工业化生 产的重要手段。现在市售的灵芝酸主要是从灵芝子实体和液体深层发酵得到的菌丝体中获 得。由于野生灵芝液体深层发酵时灵芝酸在灵芝细胞中的含量较低，分离纯化也较难，限制 了对灵芝酸的活性、作用机理的研究及其广泛应用。近年来，基因工程与代谢工程迅速发 展，成为了现代分子育种的重要手段。通过分子克隆和基因拼接等分子生物学方法来改造 菌株的基因组，从而提高活性成分的含量越来越受学者们的青睐。如何从分子水平上提高 灵芝酸的产量是目前急需解决的技术问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是解决野生型灵芝菌株自身产灵芝酸较低的问题，提供一种灵芝酸 高产菌株，该菌株为高产灵芝酸的灵芝（Ganodermalucidum)工程菌Kmust-LS，已于 2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCN0.11603。
[0006] 本发明灵芝酸高产工程菌株的构建方法如下： 以PMD19-T为起始载体并使用灵芝本身的强启动子P-gpd、终止子T-sdhB、cbx基因，cbx基因（具有carboxin抗性）是来自灵芝本身的抗性基因，其特点是在蘑菇类担子菌的转 化体系中同源标记基因的转化效率更高，能够稳定遗传，抗性强。
[0007] 1、将灵芝启动子p-gpd与终止子T-sdhB与PMD19-T连接，将灵芝cbx抗性基因插入 至IJPstI酶切位点，从而构建成pJW-EXP载体;其具有灵芝的强启动子和终止子，并具有灵芝 本身的抗性。
[0008] 其中扩增灵芝强启动子P-gpd的引物序列为： P-gpd-F:5，-TCCAAAGCCGCTCTCATGGCATGGCAC- 3,， P-gpd-R:5 '-GCTAGCGTTGAGAGGGGATGAAGAGTGAGTAAGAAG- 3 '； 扩增灵芝sdhB基因终止子的引物序列为： T-sdhB-F: 5，-ATGAGCGGGTCAGAGAGT- 3，， T-sdhB-R: 5'-TGCTCTATGTCTTGCCTTGT- 3'； 扩增灵芝cbx抗性基因的引物为： cbx-F:5 '-TCTGCTCTTCCCGATTGCTGCATTTGT-3 '， cbx-R:5 '-CTATGTCTTGCCTTGTCTCGCGTCAACC-3 '； 2、灵芝酸合成途径中关键酶羊毛留醇合酶（LS)从灵芝基因组中克隆（所用的引 物为LS-Nhe-F和LS-Sma-R)，并插入到pJW-EXP载体中，得到pJW-EXP-tLS载体；引物序列 为： LS-Nhe-F:5，-GCTAGCATGGCAGCGTACGCCCCG- 3， LS-Sma-R:5 '-CCCGGGCTACTTCTTGGCGTGCAACTCCTTG- 3 '； LS基因核苷酸序列在GenBank上，其登录号为KJ155729。
[0009] 3、通过PEG介导原生质体融合的方法，将PJW-EXP-LS转化到野生型灵芝细胞中，以carboxin作为抗性来筛选灵芝转化子，在含有carboxin抗性的CYM平板上筛选出转化子。
[0010] 4、将转化子在carboxin抗性的CYM平板中进行传代培养。
[0011] 5、灵芝细胞的液体培养： PDA培养基（g/L):葡萄糖10,琼脂20，硫酸镁1.5，磷酸二氢钾3,维生素B1 0.05 和制备好的土豆汁。
[0012] 土豆汁的制备方法:将200g去皮新鲜土豆切成小块，加入去离子水1.0L煮沸30min，用八层纱布过滤，取滤液，用于PDA培养基的配制。
[0013]种子培养基（g/L):葡萄糖35、蛋白胨5、酵母膏2.5、磷酸二氢钾1、硫酸镁0.5和 维生素B1 0.05。
[0014]发酵培养基（g/L):蛋白胨5、酵母膏5、磷酸二氢钾1.0、硫酸镁0.5、维生素B1 0.05,乳糖35,起始pH5.5。
[0015]CYM培养基（g/L):葡萄糖20、麦芽糖10、酵母粉2、蛋白胨2、MgS〇4 0·5、ΚΗ2Ρ〇4 4.6、琼脂 10。
[0016]斜面培养:接种菌丝于土豆汁-葡萄糖-琼脂（PDA)斜面中28 °C培养5-7天。 [0017] 一级种子培养:在250mL摇瓶中添加40mL培养基和10mL菌丝体悬液（从一支 斜面中获得），并在30 °C，120rpm下培养5天。
[0018] 二级种子培养:在250mL摇瓶中加入45mL培养基和5mL-级种子培养液（大约 500mgDW/L，一级培养物用玻璃珠打碎后接种），在30 °C，120rpm下培养2天。
[0019] 发酵培养:在250mL摇瓶中加入45mL发酵培养基和5mL二级种子发酵液（大约 500~600mgDW/L，二级培养物用玻璃珠打碎后接种），在30 °C，120rpm下培养。
[0020] 6、单体灵芝酸的分离和提取 准确称取干细胞粉末100mg，加入3mL70%(v/v)乙醇浸泡过夜，超声处理3次，每次30mirulOOOOrpm离心5min后获得上清液。在50 °C烘箱中烘干。用200yL色谱级甲醇彻底溶 解，用0.22μπι滤膜过滤。用HPLC检测灵芝酸单体。HPLC检测条件为:HPLC色谱柱为C18柱(Agilent1200series，5μπιAgilentZorbaxSB-C18column，250X4.6mm);进样量 20 yL;流速1mL/min;流动相A为甲醇/乙酸（100:0.5(v/v))，流动相B为超纯水，0-20min:A 相为80%-100%等梯度洗脱;20 11^11-30 11^114相为100%洗脱;30 11^11-35 11^114相为80 %洗脱；紫外检测波长为245nm;洗脱时间35min。记录相应的峰面积和出峰时间。按照标 准曲线计算出各个灵芝酸单体的浓度和含量。
[0021]本发明的优点和技术效果：通过摇瓶发酵实验表明，LS转化子菌株产单体灵芝酸GA-Me，GA-T，GA-Mk，GA-S的含量分别是WT菌株的2.1，1. 6，2.35，1.3倍。在同等情况下，使 用本发明构建的工程菌株可以节约劳动力，缩短生产周期，降低成产成本。因此，本高产菌 株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，适用于工业化生产，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0022]图1为本发明中灵芝基因组，图中:G为灵芝基因组，Μ为DNAMarker; 图2为本发明中pJW-EXP载体结构示意图； 图3为本发明中扩增LS基因的电泳图；图中:Μ为500bpDNA Ladder(DyePlus)的核酸 标准品（Takara );L为LS基因； 图4为本发明中pJW-EXP-LS载体结构示意图； 图5为本发明中验证LS阳性转化子的电泳图；图中：Μ为500bpDNALadder(DyePlus) 的核酸标准品（Takara)，P为阳性对照，L为转LS基因的阳性转化子，WT为野生型菌株，N 为阴性对照。
【具体实施方式】
[0023]下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本 实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂 或按常规方法配置的试剂。
[0024] 实施例1:pJW-EXP载体的构建 1、灵芝基因组DNA的提取 称取约0.2g冻干野生型灵芝（CCGMC5.0616 )的菌丝体在液氮中研磨成粉末，将 粉末转入1.5mL经65 °C预热的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵）抽取缓冲液中，