专利名称：Dna修复蛋白rad51在制备治疗骨肉瘤表达方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及临床常见恶性骨肿瘤的治疗方法，更具体的 说DNA是修复蛋白RAD51在治疗骨肉瘤表达方面的应用。
背景技术：
骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，是骨骼系统最常见的恶性肿瘤，好发 于青少年。对骨肉瘤的治疗主要是手术联合化疗，然而化疗耐药的出现对对骨肉瘤治疗提 出了严峻的挑战；骨肉瘤对放疗不敏感，放疗一般仅可以用作辅助治疗和姑息性治疗；骨 肉瘤的放化疗耐受，其主要原因可能是骨肉瘤细胞其DNA损伤修复功能增强。哺乳动物细胞针对DNA双链断裂有多种修复方式。其中最主要的是HR和NHEJ。 HR的正常进行需要有姐妹染色单体的存在，而催化断裂的DNA双链与完整的同源DNA姐妹 链进行链间转移置换时，需要一种关键酶即RAD51蛋白。实验表明当Rad51蛋白水平异常升高时，可严重干扰通过效应性半胱天冬酶 Caspase-3所介导的细胞凋亡途径，使肿瘤细胞在出现DNA损伤后，能够在抗凋亡BCL-2家 族蛋白共同作用下避免细胞凋亡的产生。同时，Rad51的升高还可以不直接经过同源重组 途径，而通过其他方式干扰正常的细胞周期。肿瘤细胞内Rad51蛋白水平的异常升高，可造 成肿瘤对放疗及化疗的抵抗，包括射线、顺钼、氮芥、苯丁酸氮芥、丝裂霉素C、羟基脲、吉西 他滨等。Rad51蛋白表达水平的失调也可促进肿瘤的发生和发展，并影响肿瘤的治疗效果和 患者的生存率。研究者发现，RAD51的在肿瘤中的表达显著高于正常细胞质，提示靶向作用 于该修复蛋白可作用增强放射敏感性的一个潜在的靶点。目前对于Rad51在骨肉瘤细胞系中的表达及放化疗敏感性的影响，国内外的报道 还很少，因此如能对Rad51在骨肉瘤细胞增殖及放化疗抵抗中的作用进行深入的探讨，将 可能为骨肉瘤的治疗及增强放化疗敏感性提供一个新思路。RNAi是一种新的基因沉寂技术，它通过双链RNA引起序列同源的mRNA的降解，降 低目标基因的表达，是一项理想阻断特异基因表达技术，如将其应用于肿瘤细胞DNA修复 途径关键调控基因Rad51的阻断，将收到比特异性阻断剂更理想的肿瘤放射治疗效果。
发明内容
本发明公开了一种DNA修复蛋白RAD51 pGCsi3. 0_shRAD51的干扰载体，其特征 在于分别将一对正义和反义的DNA寡核苷酸退火后连接哺乳动物表达载体pGCsi-U6/ne0/ GFP上，得到真核细胞RNA干扰质粒，见图1。本发明根据GenBank中的RAD51 cDNA设计了靶序列，分别将一对正义和反义的 DNA寡核苷酸退火后连接哺乳动物表达载体pGCsi3.0上，得到真核细胞RNA干扰质粒，见图 1，其有效靶序列shRNA-2，见NOl。本发明进一步公开了 DNA修复蛋白RAD51在制备抑制骨肉瘤增殖及增强放、化疗 敏感性表达方面的应用。
本发明所述的放、化疗敏感性药物包括射线、顺钼、氮芥、苯丁酸氮芥、阿霉素、丝 裂霉素C、羟基脲或吉西他滨等，典型的优选射线、顺钼、阿霉素。本发明所述的应用，包括DNA修复蛋白RAD51在制备抑制骨肉瘤增殖表达方面的 应用，以及DNA修复蛋白RAD51在制备治疗骨肉瘤放化疗耐受力方面的应用。本发明经过大量的药理学实验证明(1)免疫组织化学法分析骨肉瘤组织及癌旁 标本，发现RAD51蛋白在骨肉瘤组织中呈高表达，且表达水平同临床分期及病理分型无关。 (2)western blotting和RT_PCR法检测骨肉瘤细胞系和人胚皮肤成纤维细胞系中RAD51 蛋白表达，发现肿瘤细胞系中RAD51也呈高表达。(3)western blotting和RT_PCR法检 测、射线和顺钼、阿霉素对RAD51表达的影响，结果提示RAD51的表达同、射线及化疗 药物间有时间和剂量依赖关系。(4)检测不同RAD51表达水平的骨肉瘤细胞系的射线及化 疗药物敏感性，发现RAD51表达水平同γ射线和药物敏感性均呈负相关。( 成功构建 pGCshRNA-RAD51干扰载体，并挑选出有效的靶序列。(6)经蛋白和RNA水平鉴定，成功建立 了稳定的RAD51基因沉默的骨肉瘤细胞系(7)RAD51基因沉默抑制体外骨肉瘤细胞增殖， 在体内抑制裸鼠移植瘤的生长。(8)RAD51基因沉默提高γ射线和顺钼、阿霉素的敏感性。 RAD51基因沉默促进γ射线和药物诱导骨肉瘤细胞凋亡。
图1为pGCsi3. 0-shRAD51真核细胞RNA干扰质粒结构图。图2免疫组织化学检测RAD51在骨肉瘤组织中的表达。其中A骨肉瘤组织(强阳 性)B骨肉瘤组织(阳性)C骨肉瘤组织(弱阳性)D癌旁组织(阴性)。图3RAD51在骨肉瘤细胞系中的表达。其中A为western blotting结果B为RT-PCR结果。图4 γ射线与RAD51表达的时间剂量依赖关系。其中A为8gy γ射线与RAD51蛋 白表达的时间依赖关系；B为RAD51蛋白与Y射线的剂量依赖关系。图5阿霉素与RAD51表达的时间剂量依赖关系.其中A为阿霉素与RAD51蛋白表 达的时间依赖关系；B为RAD51蛋白与阿霉素的剂量依赖关系。图6顺钼与RAD51表达的时间剂量依赖关系。其中A为顺钼与RAD51蛋白表达的 时间依赖关系；B为RAD51蛋白与顺钼的剂量依赖关系。图7为荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况。图8为RNA干扰抑制RAD51蛋白表达和RAD5 ImRNA水平。图9shRNA沉默RAD51在体外抑制骨肉瘤细胞的生长。图10RAD51基因沉默在体内抑制裸鼠移植瘤生长。图11RAD51对骨肉瘤射线敏感性影响。图12RAD51对阿霉素和顺钼敏感性的影响。其中A为RAD51基因沉默提高骨肉瘤 对阿霉素敏感性；B为RAD51基因沉默提高骨肉瘤对顺钼敏感性；C为三种细胞系对阿霉素 敏感性变化；D为三种细胞系对顺钼敏感性变化。图13为Armexin V-PITC/PI双染法显示RAD51基因沉默促进细胞凋亡；其中A射 线照射组B阿霉素作用组C顺钼作用组。图14为DNA ladder显示RAD51沉默促进细胞凋亡.其中1. HOS 2. control3.H0S-shA2。
具体实施例方式为了更充分的解释本发明的实施，提供详细的制备实施实例。这些实施实例仅仅 是解释、而不是限制本发明的范围。实施例1实验材料1.菌种、质粒及细胞株1. 1菌种大肠杆菌T0P10本实验室保存(有市售)。1. 2质粒pGCsi3. 0_shRAD51，真核细胞RNA干扰质粒，委托上海吉凯有限公司构 建。质粒结构图见图1。1. 3细胞株入骨肉瘤细胞系!105、8&08-2、]\^-63、化2OS。人胚皮肤成纤维细胞系CCC-eSf-l。均购自中国医学科学院基础所细胞中心2实 验动物裸鼠品系Balb/c-Nu，4周龄，雌性，体重16_20g(中国医学科学院放射所动物中心 提供并饲养)3临床标本骨肉瘤及癌旁组织均取自天津骨科医院1992-2008年间病例，所有患者术前均未 经放疗及化疗。患者年龄13-53岁。标本相关临床资料如下
ρ ΒΠ
4主要试剂
4.1细胞培养用品(有市售)
细胞培养基McCoy，s 5a, MEM, 0 pti-MEM (GIBCO)
胎牛血清(Invitrogen)
胰蛋白酶Gnvitrogen)
4. 2酶类(有市售)
RNA 酶(Promega)
蛋白酶抑制剂=PMSF(Sigma)
TaKaRa Ex Taq HS DNA 聚合酶(TaKaRa)
AMV逆转录酶(TaKaRa)
4. 3分子量Marker
Wide Range DNA Ladder Maker北京鼎国生物技术有限公司产
Prestained Protein Molecular Weight Marker Fermentas
DNA marker朋远生物技术有限公司
4. 4试剂盒
Takara RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0大连 TAKARA 公司产品
质粒小量中提取试剂盒天根生化科技有限公司
质粒无内毒素大提试剂盒天根生化科技有限公司
PCR产物纯化试剂盒北京赛百盛基因技术有限公司
凝胶回收试剂盒北京赛百盛基因技术有限公司
BCA蛋白浓度测定试剂盒子碧云天生物技术有限公司
DNA抽提试剂盒(离心柱式)碧云天生物技术有限公司
Annexin V—PITC kitBeckman
Enhanced Chemi luminescent Detection System boster
4．5主要分子生物学试剂
／riZOl(Invitrogen)
Lip。feCtamine2000，月旨质体2000(Invitrogen)
PI(Sigma)
4．6抗体
抗体名称公司产品号
兔抗人Rad5l单克隆抗体(H一92)SAN／A CRUZSC一8349
兔抗人p—actinBosterBA0410
HRP标记羊抗兔IgGBosterEKl002
4．7其它主要试剂及耗材
胰蛋白胨、酵母提取物OXID公司产品
琼脂糖、DMSO、考马斯亮蓝R一250 Sigma公司产品
SDS、TriS，甘氨酸北京鼎国生物技术有限公司产品
氨苄青霉素、DEPCGenview分装
丙烯酰胺、N—N’甲叉双丙烯酰胺、Genview分装
过硫酸胺(AP)Genview分装
TEMED北京鼎国生物技术有限公司产品
溴酚蓝Sigma
PVDF膜北京鼎国生物技术有限公司产品
Whatman 3MM滤纸B i o—Rad
X光胶片KODAK
／ween 20AMERSCO
M／／Sigma
G418GIBCO
其他各种试剂甲醛、甲醇、无水乙醇、异丙醇、氯仿、氢氧化钠、氯化钠、碳酸氢钠、冰醋酸、甘油、显影液、定影液均为国产分析纯试剂。
5引物
5．1人RAD5l基因扩增引物
上游引物5 CGGGA／CC／GGGGCAAGCGAG／AGAG 3
下游引物5 CG／C／AGAAAG／CA／／CC／AAGGCACC 3
产物长度1456bp
5．2人GADPH基因扩增引物
上游引物5 CGGGGAAGC／／G／GA／CAA／GG 3
下游引物5 GGCAGTGATGGCATGGACTG 3产物长度5. 3 shRNA-Rad51shRNA-2 :aatgtacatggcctttccttcttcaagacggaaggaaaggccatgtacattshRNA-3 :aaggcggtcagagatcatacattcaagacgtgtatgatctctgaccgccttcontrol :ttctccgaacgtgtcacgt6主要试剂、缓冲液和凝胶5 X TBE 缓冲液双蒸水700mlTris 54. Og硼酸27. 5g0. 5mol/L (pH)8. 0 的 EDTA 溶液 20ml调pH值至8. 3左右，用双蒸水定容至1000ml，备用。常温密封保存，工作液浓度为 0.5XTBE05 X Tris-甘氨酸缓冲液Tris 碱15. Ig甘氨酸(电泳级)94g10% SDS 溶液 50ml加双蒸水定容至1000ml，备用。常温密封保存，工作液浓度为IXTris-甘氨酸缓冲 液。SDS-PAGE凝胶染色液按体积比为甲醇乙酸水=5 4 1配制500ml三者的混合液，然后将1. 25g 考马斯亮蓝R-250溶入其中，采用Whatmanl号滤纸过滤，滤液避光、密封、常温保存。此染 色液可回收重复利用。SDS-PAGE凝胶脱色液按体积比为甲醇乙酸水=3 1 6配制IOOOml三者的混合液即为脱色液。
常温保存，最好现用现配。氨苄青霉素溶液用双蒸水配制终浓度为50mg/ml的氨苄青霉素溶液，0. 22um的滤膜过滤后分 装，-20°C保存。使用时按试剂所需的浓度添加。琼脂糖凝胶将0. 2g电泳级琼脂糖溶于20ml双蒸水中，将溶液加热至沸腾，重复一次。待溶液 温度降至45°C左右，加入所需的EB。然后将凝胶溶液缓缓的倒入凝胶槽中，室温放置至完 全凝固。若不及时使用可保鲜膜封闭后4°C保存，备用。DEPC 水通风橱内用双蒸水配制0. 1 %的DEPC水溶液，用力振摇，使脂性液滴完全分散，室 温下静置48小时，高压灭菌20分钟。根据需要小量分装，分装部分-20°C冻存备用。剩余 部分密封，室温保存，备用。McCOYS 5A 培养基取一袋Gibco McCOYS 5A培养基(IL)，溶于800mL去离子水中，加碳酸氢钠2g，充 分混勻完全溶解后，加去离子水至IOOOmLjSO. 22um滤膜过滤除菌。用前加胎牛血清至终浓度为10% (ν/ν)，加青链霉素双抗至终浓度为100U/mL。不连续SDS-PAGE 胶10%分离胶(IOml)7jC4. Oml30%丙烯酰胺混合液 3.3ml1. 0mol/LTris(pH8. 8) 2.5ml10% SDS0. Iml10%过硫酸铵(新鲜配制)0.1mlTEMED0.004ml以上溶液按次序添加到小烧杯中，要求快速，待充分混勻后迅速加入到胶槽中，最 后在胶溶液中加入约Iml的双蒸水进行水封，室温下30分钟即可凝固。5%浓缩胶(4ml)/K2.7ml30%丙烯酰胺混合液0.67ml1.0mol/LTris(pH6.8) 0.5ml10% SDS0.04ml10%过硫酸铵(新鲜配制)0.(MmlTEMED0.004ml分离胶凝固后，倒去胶上面的水，并用滤纸充分吸干，按照浓缩胶配制的程序配 制，凝胶溶液加入完毕后迅速插入梳子。室温下45分钟即可凝固，最后轻轻拔去梳子即可。 若制备的凝胶不及时使用，可置入4°C冰箱保存。PI 染液柠檬酸钠 50mgNacl32. 4mgPI2. 5mgRNase0. 5mgTriton-100 0.25ml加水至50ml4°C避光保存7主要培养基LB液体培养基(普通、抗性)
0150]胰蛋白胨IOg
0151]酵母提取物 5g
0152]NaClIOg
0153]_摇动培养基瓶直至固形物完全溶解，用NaOH溶液调节pH至7. 0，定容至1000ml， 高压灭菌15分钟，4°C保存备用。(抗性培养基配制在使用时在普通培养基中加入抗生素 至所需浓度混勻即可。)LB固体培养基(普通、抗性)
胰蛋白胨log
酵母提取物 5g
58]NaCllog
琼脂15．og
一一
摇动培养基瓶直至圖形物完全溶解，用Na。H溶液调节pH至7．o，定容至lOOoml，高压灭菌15分钟，待培养基冷却至45度左右即可倒板。(抗性平板的制备在倒平板之前加入抗生素至所需的浓度倒板即可。)
8主要仪器
PCR基因扩增仪Therm。
电泳仪装置北京六一
凝胶成像系统Bi。一Rad
超淨工作台苏州淨化设备厂
落地式高速冷冻离心机 HitaChi
台式高速冷冻离心机上海离心机研究所
常温台式离心机北京医用离心机厂
超低温冰箱Therm。
冰箱SANY。
恒温摇床太仓实验设备厂
水平脱色摇床北京鼎国生物技术有限公司
恒温水浴箱北京医用设备厂
紫外分光光度计Bi。一Rad
恒温培养箱ESPEC
高压灭菌器山东新华医疗器械厂
微量进样器Eppend。rf
实施例2
实验方法
一1骨肉瘤组织中Rad5l的表达免疫组织化学染色
l1组织切片的制备
26例骨肉瘤组织标本和癌旁组织标本经4％多聚甲醛固定，常规脱水透明1浸蜡1石蜡包埋，切成厚度为4 u m的切片，烤片器60℃烘烤4小时，用于免疫组化染色(工mmun。hiSt。ChemiStry，工HC)。
21免疫组织化学方法
(1)石蜡切片常规脱蜡至水，步骤依次为二甲苯工和II各5min，lOO％乙醇工和II各lomin，95％乙醇工和II各lomin；
(2)蒸馏水冲洗2次，每次5min；
(3)微波抗原修复，以增强其免疫组化染色效果。切片置于含o．olM枸椽酸盐缓沖液(PH6．o)的修复盒中，高火煮沸lomin，取出室温自然冷却；
(4)蒸馏水冲洗3次，每次5min，在PBS中浸泡5min；
(5) 3%过氧化氢室温孵育lOmin，消除内源性过氧化物酶的活性；(6)蒸馏水冲洗3次，每次5min ；(7)滴加封闭液200 μ 1，室温孵育15min，倾去，勿洗；(8)滴加1 300稀释的兔抗人Ku80—抗200μ 1，4°C孵育过夜；(9)弃一抗，PBS冲洗3次，每次3min ；(10)滴加生物素标记山羊抗兔IgG 二抗200 μ 1，室温孵育15min ；(11)弃二抗，PBS 冲洗 3 次，每次:3min;(12)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液200 μ 1，室温孵育15min ；(13)弃之，PBS冲洗3次，每次3min ；(14) DAB显色Imin ；取Iml双蒸水，滴加一滴试剂A混合均勻，然后滴加一滴试剂 B再次混勻。现用现配，避光保存，应在30min内使用。(注意掌握染色时间)(15)着色后，浸入水中终止反应，自来水充分冲洗；(16)苏木精复染Imin ；(注意掌握染色时间)(17)自来水冲洗 IOmin ；(18)脱水依次为95%乙醇I和II各lOsec，100%乙醇I和II各lOsec，二甲苯 I和II各IOsec ；中性树脂封片。3、免疫组织化学评分取一片用PBS代替一抗作阴性对照。参照参考文献的判定标准，根据同样物镜下 阳性细胞数不同可以分为以下五个等级< 5%为0分；5-25%为1分；25-50%为2分； 50-75 %为3分；75-100 %为4分。依据染色强度进行半定量判定，分数标准是无色为0分； 淡黄色，即弱阳性为1分；棕黄色，即中等染色强度为2分；棕褐色，即强阳性为3分。免疫 反应的得分为阳性细胞的百分率得分与免疫染色的强度得分的乘积，最终评分范围为0-12 分。我们将最终评分彡8 (12定义为强表达，彡4 < 8为中等表达，彡0 < 4为弱 表达。4、统计学处理对于食管鳞癌和正常食管上皮组织之间KuSO表达情况的比较分析，采用配对t检 验，P<0. 05具有统计学意义。二、肿瘤细胞中的RAD51蛋白表达测定(western blotting)1、细胞总蛋白提取(1)取生长状态良好的不同肿瘤细胞系(骨肉瘤细胞H0S、MG_63、saos-2和U_2 OS,人胚皮肤成纤维细胞ccc-esf-Ι)，弃去培养基，用冰冷的PBS清洗两遍，常规消化收集 细胞，2000rpm 4°C 10分钟离心收集细胞沉淀。(2)在细胞沉淀中加入 200 μ 1 蛋白裂解液(20Mm Tris (PH7. 5)、150Mm NaClU % TritonX-100、sodium pyrophosphate> β-glycerophosphate、EDTA、NaV04、leupeptin)裂 解细胞，冰上作用lOmin，每5Min剧烈震荡一次。(3)4°C 12，OOOrpm，离心 5min。(4)取上清即为细胞总蛋白，分装后于-20°C冰箱中保存备用。2、蛋白定量按照BCA试剂盒说明书进行操作。
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(1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B (50 1)配制适量 BCA工作液，充分混勻。(工作液室温M小时内稳定)(2)完全溶解BSA蛋白标准品，取10 μ 1稀释至100 μ 1，使终浓度为0. 5mg/ml。(3)将标准品按0，1,2,4,8,12，16, 20 μ 1加到96孔板中，加标准品稀释液补足到 20 μ 1。(4)加10 μ 1样品到96孔板中，另加10 μ 1标准品稀释液。(5)各孔加入 200 μ 1 BCA 工作液，37°C放置 30min。(6)用酶标仪测定波长为570nm的吸光度值。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
3、SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白电泳(1)制胶按蛋白分子量要求制备相应浓度为10%的SDS-聚丙烯酰胺分离胶和 5%的浓缩胶，待浓缩胶凝固后，小心地拔出梳子，反复冲洗上样孔，将凝胶玻璃固定于电泳 装置上，加入电泳缓冲液，用弯头注射器排除凝胶底部的气泡，加样孔用电泳缓冲液冲洗后 上样。(2)上样样品预先用BCA试剂盒定量，取等量蛋白，加入上样缓冲液，100°C煮沸 5min变性，4°C 12，OOOrpm离心lOmin。每孔上样30yg总蛋白。同一板胶上加入预染蛋白 分子量marker电泳以确定待检蛋白的分子量和转膜效率。(3)电泳先以IlOV电压电泳，当染料前沿到达分离胶与浓缩胶交界时，调电压至 90V电泳，直至染料到达最下沿。(4)半干式电转染裁剪滤纸和PVDF膜，使大小与凝胶完全相同。用甲醇浸泡PVDF 膜lmin，用转移缓冲液浸泡6张3M滤纸，PVDF膜再用转移缓冲液预平衡5min。从阳极到 阴极依次是海绵、3张滤纸、PVDF膜、凝胶、3张滤纸和海绵，以200MA恒流转膜约1小时。(5)取出PVDF膜，室温下用TBS洗膜5min，进行下一步程序。凝胶用考马斯亮蓝 染色，膜用丽春红染色，以观察转膜效率。4、蛋白免疫印记(Western Blotting)(1)取转膜完毕的PVDF膜，放入封闭液中(1 XTBST+5%脱脂奶粉)，4°C封闭过夜。(2)用TBST洗3次，每次5min。用封闭液1 1000稀释一抗兔抗人Ku80，将PVDF 膜放入一抗中，4°C孵育过夜，并且摇床轻微振动。(3)用TBST洗3次，每次5min。用封闭液1 5000稀释二抗羊抗兔辣根过氧化 物酶标记的IgG，室温孵育1小时。 (4)用TBST洗3次，每次5min。将ECL Kit的A液和B液各一滴混均于Iml双蒸 水中，将混合液滴在膜上，使之完全覆盖PVDF膜。室温作用lmin。(5)将膜上多余的液体用滤纸从边缘吸走，不要碰到表面，用保鲜膜将其包裹。在 暗室曝光，显影，定影。三、表达RAD51基因发夹干扰RNA载体的构建(由上海吉凯基因有限公司完成)1寡核苷酸的设计为了实现特异基因的沉默，设计寡核苷酸来源于RAD51基因mRNA的一段长度为 19 21个碱基的独特序列，形成一对特定的DNA Oligos0以下链均正义链shRNA-A2 5，AATGTACATGGCCTTTCCTTCTTCAAGACGGAAGGAAAGGCCATGTACATT3，shRNA-F6 :5， AATGTACATGGCCTTTCCTTCTTCAAGACGGAAGGAAAGGCCATGTACATT3,目的片段作用于RAD51编码区的7观-748位。2DNA Oligos 的退火(1)将DNA Oligos溶解在灭菌、无核酸酶的水中，终浓度为;3mg/ml。(2)退火反应是将各1 μ 1的正向和反向DNA Oligos与48 μ 1的退火缓冲液混合。(3)将混合物在90°C温育％iin，70°C温育lOmin。慢慢冷却退火的DNA Oligos至 10°C。3pGCsi3. O载体的线性化用Hind III和BamH I限制酶将1 μ 1的pGCsi载体线性化。注意不要同时进行 酶切，而应该先用Hind III酶切60min，接着加BamH I继续反应2小时，然后加热终止反应 (升高温度至650C，加热20min)。4线性化载体的纯化将酶切后的线性化载体在1 %琼脂糖凝胶上进行纯化，切胶回收，调整质粒浓度为 0.2-0. 5ng/ml。5退火模板与载体的连接将2 μ 1退火后的DNA Oligos加到"Γ4 DNA连接酶缓冲液中，接着再加1 μ IpGCsi 载体、5 μ 1无核酸酶的水、1 μ 1Τ4 DNA连接酶。室温下孵育过夜。6转化细菌扩增和纯化将重组的pGCsi3. 0-shRad51载体转化入感受态宿主细胞株(ToplO)。用连接有 错拼碱基的发夹DNA Oligos的载体作为阴性对照来检测转化步骤的效率。细菌铺于含有 氨苄青霉素的琼脂糖平板，培养过夜，然后挑克隆，在含有青霉素的培养基里进行另一轮培 养。用质粒提取试剂盒纯化质粒后，_20°C保存备用。四、细胞培养人骨肉瘤细胞株HOS，用含10%胎牛血清的McCOYS 5A培养液在37°C、5% CO2条 件下常规培养，每3天传代一次。五、细胞转染1、G418致死剂量的测定将细胞接种于6孔培养板中，培养细胞至70 80%融合，在培养液中分别加入 50mg/mlG418，至终浓度为0、200、400、600和800μ g/ml，以14天内细胞全部死亡的浓度为 最适G418筛选剂量。得到为800 μ g/ml。2、用Lipofectamine 2000转染质粒入人骨肉瘤HOS细胞2. 1瞬时转染(1)转染前一天在M孔培养板中种植6X IO4细胞，转染时细胞密度达到80 90%。(2)准备以下复合体A-将1 μ g质粒DNA稀释于50 μ 1无血清培养基中，轻轻混 勻；复合体B-取1μ 1 Lipofectamine 2000(用前混勻)稀释于无血清培养基中，混勻。室 温孵育15min (在30min内将稀释的脂质体与稀释的DNA混合)(3)将上面的复合物A和B混合，轻轻混勻，室温孵育15min (复合体于室温6小时 内会保持稳定)。(4)将混合后脂质体-DNA复合体100 μ 1加入含无血清培养基的食管癌细胞中，上下左右轻轻混勻。将细胞放入孵箱内继续培养。2. 2稳定转染和阳性克隆筛选质粒转染细胞M小时后，加入G418 800 μ g/ml，每3天更换选择培养基一次，培 养14天后，挑选单克隆，扩大培养，待细胞生长至40 %左右，消化转至培养瓶中，在G418 400 μ g/ml培养液中继续扩增。六、RNA干扰效果的鉴定1 半定量 RT-PCR1. 1细胞总RNA的提取稳定转染细胞、阴性对照转染细胞和未转染细胞培养至对数生长期，常规消化，离 心收集，计数，每小管约5 X 106个细胞，按TRIZOL Reagent总RNA分离试剂盒使用说明进 行，具体操作步骤如下(1)离心收集5X106细胞，加Iml TRIZOL提取液，颠倒混勻15sec，室温放置 5min。(2)加0. 2ml氯仿，强烈振荡15sec，室温放置5min。(3)4°C，12，000rpm，离心15min，取上层水相，转入新的1.5ml离心管中。(4)加入等体积异丙醇(约400-500 μ 1)，混勻，室温放置IOmin。(5)4°C，12，OOOrpm，离心 IOmin0(6)弃去上清，加Iml 75%乙醇(用DEPC处理过的去离子水配制)，混勻。(7) 40C，7500rpm离心5min，弃去上清，空气干燥5_10min (不能干透)。(8)加10 μ 1 DEPC处理水溶解RNA，_80°C冰箱贮存备用。1. 2RNA浓度测定和纯度的鉴定1. 3RT-PCR采用TAKARA公司生产的TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0来进行目的基因扩增， 严格按照说明书的操作方法进行，设定退火温度为60°C。具体操作步骤如下反转录反应1.按下列组成配制反转录反应液MgCl210 μ 110XRT Buffer5μ 1RNase Free dH2018. 75 μ 1dNTP Mixture (各 IOmM)5 μ 1RNase Inhibitor1. 25μ 1AMV Reverse Transcriptase 2. 5 μ 1Oligo dT-Adaptor2. 5 μ 1人总RNA5. 0 μ 1Total50 μ 1/Sample(将上述配好的反应液用手指轻弹混勻后瞬间高速离心使反应液汇聚至管底)2.按以下条件进行反转录反应42 "C 15min99 °C 5min
5 0C IOmin
反应完毕后的产物即为cDNA，随后分装，标记，-20°C保存。
PCR反应
1.按下列组成配制PCR反应液
5XPCR Buffer10 μ 1
dH2028. 75 μ 1
TaKaRa Ex Taq HS0. 25 μ 1
F引物0. 5μ 1
R引物0. 5μ 1
cDNA10 μ 1
Total50 μ1/Sample
(将上述配好的反应液用手指轻弹混勻后瞬间高速离心使反应液汇聚至管底)
2.按以下设定好的程序进行反应
94 0C 2minICycle
94 °C 30sec
57. 2°C 30sec30cycle
72 °C 1. 5min
反应完毕后取一部分行琼脂糖凝胶电泳进行分析，剩余部分分装后冻存于-20°C。
琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物配制琼脂糖凝胶电泳所需的缓冲液和凝胶。每个PCR反应管上样3 μ 1，同时按照 说明书操作对DNA Marker上样。加入1 XTBE缓冲液，在恒压40V条件下，电泳90min。电 泳完毕后，将胶置于紫外分析仪观察目的条带及DNA Marker迁移情况，拍照，对实验结果进 行分析评价。2ffestern blotting2.1细胞总蛋白提取方法同前2. 2蛋白定量方法同前2. 3SDS-PAGE电泳 方法同前2. 4蛋白免疫印记 方法同前七、肿瘤细胞生物学行为的测定1、MTT法测定细胞生长曲线MTT 实验方法(1)将对数生长期的RNA干扰细胞、阴性转染细胞和未转染细胞，用胰酶消化后， 用含10%胎牛血清的培养基配成适合浓度的细胞悬液。(2)接种在96孔培养板中，每孔2000个细胞，设5个平行孔。(3)经37°C，5% C02条件下培养M小时。(4)分别在1、3、5和7天以MTT法检测其570nm的OD值。(5)到指定时间，取出细胞，弃去上清液，用培养液洗两遍。然后，每孔加入20 μ 1 含5mg/ml MTT，在37°C继续培养4小时。
(6)小心弃去上清，并加入200 μ 1 DMSO溶解沉淀，用震荡器震荡lOmin，在酶标仪 上用波长570nm测定吸光度值(OD)。(7)以天数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制生长曲线。2、平板克隆形成实验
(1)取对数生长期的各组细胞，用胰酶常规消化制备成单细胞悬液，接种于6孔板 中，每皿400个细胞。每组设三个重复培养皿，置于37°C，5% C02孵箱中培养。当培养到 14天，可观察到克隆形成。(2)固定取出细胞培养皿，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入新配制的固定液，即 甲醇冰醋酸(3 1)约5ml，铺满整个培养皿底面，固定5min。(3)染色弃去固定液，待稍干燥后加入5%结晶紫染色液，染色约lOmin，当克隆 着色足够时用水冲洗去残余的染色液，进行克隆计数。每团细胞数大于50个时作为一个克 隆。用下列公式求得克隆形成率。克隆形成率(％ )=集落数/接种细胞数X 100%八、裸鼠体内成瘤性实验1、取4周龄Balb/C雌或雄性裸鼠(按SPF级动物饲养于动物实验中心)，随机分 为对照组，阴性对照组和干扰组，每组5只。SPF级裸鼠由实验员专门饲养。2、取对数生长期各组细胞，胰酶常规消化，调整细胞浓度为5X IO7个/ml，取 200 μ 1即IX IO7个细胞接种于每只裸鼠的右上肢背部皮下，观察瘤细胞接种后的生长情 况，待6天后可见瘤块，每隔4天用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，按公式V = aXb2/2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。接种30天后，断颈法处死裸鼠，取出瘤体、肺、 心、肝组织，肉眼观察有无粘连和转移灶，然后用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，每个瘤体制 作4 μ m厚的连续切片，免疫组化分析RAD51表达情况。九、肿瘤细胞放射敏感性测定(1)取对数生长期的各组细胞，消化细胞成单个，接种细胞于IOOmm培养皿中，每 皿3000个细胞，每组设三个平行皿。(2) 小时细胞贴壁后，进行137Cs射线照射，照射剂量为1，2，4和8Gy (0. 86y/ min)，同时未照射组为对照组。(3)将培养皿置于37°C、5% C02培养箱中培养14天，有克隆形成。(4)固定和染色倒去上清培养液，用PBS洗涤2次，加入75%甲醇固定液，铺满培 养皿底面，固定5min。弃去固定液，待稍干燥后加入0.5%结晶紫(甲醇配制)染色5min， 在镜下检查染色程度，当克隆着色足够时用水洗去残余染液，以每团细胞数大于50个时作 为一个克隆计数，并拍照。(5)用下列公式求得克隆形成率。克隆形成率=(处理组克隆数/对照组克隆数)X 100%十、肿瘤细胞存活率的测定(1)将对数生长期的各组细胞，用胰酶消化后，用新的培养基重悬细胞，调整细胞 浓度为lX106/ml。(2)将各组细胞接种于96孔培养板中，每孔接种200 μ 1，每组设5个平行孔。(3)经37°C、5% C02培养箱中培养24小时。
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(4)加入不同浓度的MMC (0. 5，1，1. 5，2 μ g/ml)，作用48小时后用MTT法测定OD值。(5)肿瘤细胞生存率=(实验组OD/对数组0D) X 100%i^一、细胞凋亡的测定UDNA ladder 法a.收集约100万个细胞，离心沉淀，弃上清。加入200微升PBS，轻轻吹散或弹散 细胞，使细胞重悬于PBS中。b.加入4微升RNase A，Vortex混勻。室温(15_25°C )放置2分钟。c.加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻。d.加入200微升样品裂解液B，Vortex混勻。70°C孵育10分钟。加入样品裂解 液B后必须立即Vortex混勻。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合。e.加入200微升无水乙醇，Vortex混勻。加入乙醇后必须充分混勻，否则会严重 影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和 溶液全部转移到纯化柱内。f.把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。彡6000g (约彡8000rpm)离心1分 钟。倒弃废液收集管内液体。进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回 收废液收集管。注意必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！g.加入500微升洗涤液I，^ 6000g(约> 8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集 管内液体。进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。h.加入600微升洗涤液II，> 18000g(约> 12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收 集管内液体。进行本步骤前需把纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。i.再彡18000g(约彡12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。不可把步骤h 的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。j.将DNA纯化柱置于一洁净的1. 5ml离心管上，加入50-100微升洗脱液。室温放 置1-3分钟。》12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。洗脱液需要直接 加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。k.取部分抽提得到的DNA，1%琼脂糖凝胶电泳分析。如果细胞发生凋亡，即可观 察到典型的DNA ladder。电泳时一定要注意换用新鲜配制的电泳液，DNA凝胶也要用新鲜 配制的电泳液配制并新鲜配制后使用。电泳时为获取最佳的电泳效果使ladder充分分开， 电泳速度宜适当慢一些，凝胶宜适当长一些，而加样孔宜更加扁平一些。选取适当较薄的梳 齿，往往会获得更好的ladder电泳效果。2. Annexin V-PITC/PI 双染法1.细胞用不含EDTA的胰酶消化收集(注胰酶消化时间不易过长，否则容易引起 假阳性)；2.用PBS洗涤细胞二次QOOOrpm离心5min)收集5 X IO5细胞；3.加入 500 μ L 的 Binding Buffer 悬浮细胞；4.力口入 5yL Annexin V—FITC 混勻后，力口入 5 μ L Propidium Iodide,混勻；5.室温、避光、反应5 15min ；6.在Ihour内，进行流式细胞仪的观察和检测
7.用流式细胞仪检测，激发波长Ex = 488nm ；发射波长Em = 530nm。Armexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FLl)检测；PI红色荧光通过PI通道(FL2或FL3)检 测。实施例3实验结果URAD51在骨肉瘤组织中的表达情况为了了解RAD51在骨肉瘤组织中的表达情况。本发明采用免疫组织化学的方法， 检测了 RAD51在骨肉瘤及瘤旁正常组织中的表达。如图2所示。RAD51蛋白在骨肉瘤组织 中表达明显增强，胞核呈现强阳性着色，而在骨肉瘤癌旁组织中呈弱阳性或不表达。在沈 例食管癌标本中，有19例标本(73% )RAD51蛋白胞核呈强阳性着色，7例标本(27% )呈弱 阳性。因此在沈例骨肉瘤标本中RAD51蛋白高表达的阳性率为100%，;相比之下，在沈例 癌旁组织标本中，仅有1例(10% )显示了中度染色，其余的(90% )为弱或阴性染色。统 计学分析发现RAD51蛋白在骨肉瘤组织中呈明显的高度表达(P < 0. 05)。同时本发明人就RAD51表达情况同患者年龄、性别、骨肉瘤临床分期及病理分型 间的相关性进行了分析。如表1所示RAD51高表达和低表达二组之间，性别、年龄、临床分 期、和病理组织学类型间均无显著性差异(P > 0. 05)。表1. RAD51的表达与骨肉瘤临床及病理特征的关系
权利要求
1.一种DNA修复蛋白RAD51 pGCsi3. 0_shRAD51的干扰载体，其特征在于分别将一对 正义和反义的DNA寡核苷酸退火后连接哺乳动物表达载体pGCsi3. 0上，得到真核细胞RNA 干扰质粒，见图1。
2.权利要求1所述的DNA修复蛋白RAD51在制备抑制骨肉瘤增殖及增强放化疗敏感性 表达方面的应用。
3.权利要求2所述的应用，其中所述的放、化疗敏感性药物包括射线、顺钼、氮芥、苯 丁酸氮芥、阿霉素、丝裂霉素C、羟基脲或吉西他滨。
4.权利要求2所述的应用，其中的DNA修复蛋白RAD51在制备抑制骨肉瘤增殖表达方 面的应用。
5.权利要求2所述的应用，其中的DNA修复蛋白RAD51在制备治疗骨肉瘤放化疗耐受 力方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种DNA修复蛋白RAD51的pGCsi3.0-shRAD51质粒载体，具有干扰载体功能，同时也公开了RAD51在骨肉瘤的发生、发展中起重要作用，即DNA修复蛋白RAD51在制备治疗骨肉瘤药物中的应用，它可能成为临床诊断和治疗骨肉瘤的一个潜在靶点，本发明通过研究实验首次证实了同源重组修复途径参与了骨肉瘤的放化疗耐受，抑制修复蛋白RAD51的表达可提高骨肉瘤的敏感性，从而可为今后的治疗提供理论基础。
文档编号C12N15/85GK102108369SQ20091024511
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月28日 优先权日2009年12月28日
发明者刘强, 吴红英, 孟爱民, 张恒, 李德冠, 杜利清, 樊飞跃, 王小春, 王月英, 白剑强, 路璐 申请人:中国医学科学院放射医学研究所