鼠灰链霉菌amp脱氨酶基因的原核表达方法及其表达产物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的原核表达方法，该方法以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，并在其两端加入酶切位点，亚克隆至表达载体构建重组质粒，再将该重组质粒转化大肠杆菌感受态，最后IPTG诱导表达，纯化，得AMP脱氨酶表达终产物。本发明首次在大肠杆菌中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结果显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，易于纯化，可应用于食品、医药领域，为AMP脱氨酶的工业化生产奠定了基础。
【专利说明】鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的原核表达方法及其表达产物的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及AMP脱氨酶基因的原核表达，具体涉及一种鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶基因的原核表达方法及其表达产物的应用，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】 [0002]AMP脱氨酶,英文名为AMP deaminase,简写为AMPD,是一种氨基水解酶,其可催化AMP使其脱去氨基生成肌苷酸(MP)和NH3, MP在食品以及制药等领域中有重要应用。另外，AMP脱氨酶是嘌呤核苷酸代谢循环中的三种主要酶类之一，对于维持机体免疫力和腺苷酸能荷具有重要作用。因此，AMP脱氨酶是工业生产中一种重要的酶。
[0003]AMP脱氨酶广泛存在于各种生物体内。其最早由鼠骨骼肌制备，随后又由人红血细胞制备，目前工业化生产中通常由酵母、霉菌等微生物发酵产AMP脱氨酶，但是在酶的提取纯化、酶活性以及稳定性等方面存在诸多问题。因此，利用DNA重组技术，将微生物来源的AMP脱氨酶基因在特定宿主中进行重组表达，可以有效改善上述问题。现在国内关于AMP脱氨酶基因重组表达的研究从未报道过，国外关于该酶的重组表达的研究较少，仅在申请号为CN200580013789.3的专利“放线菌来源的AMP脱氨酶及其应用”( 申请人::天野酶株式会社)中报道过一次。
【发明内容】
[0004]针对现有技术存在的不足，本 申请人:经过研究改进，提供一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的原核表达方法。本发明首次在大肠杆菌中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结果显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的原核表达方法，是以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，并在其两端加入酶切位点，亚克隆至表达载体构建重组质粒，再将该重组质粒转化大肠杆菌感受态，最后IPTG诱导表达，纯化，得AMP脱氨酶表达终产物。
[0007]具体地，所述方法具体步骤如下:
[0008]( I)鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
[0009]以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID Ν0:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，并在其两端分别加入EcoRI和Not I酶切位点，纯化回收PCR产物；
[0010](2)重组表达载体的构建
[0011]将表达载体pET_28a和步骤(1)所得PCR产物均用EcoRI和Not I双酶切，连接所得酶切产物并转化E.coli JM109，用步骤(1)所述引物对进行菌落PCR筛选阳性克隆菌株；提取上述阳性克隆菌株质粒，转化E.coli BL21，筛选阳性克隆转化子；[0012](3) AMP脱氨酶基因的诱导表达及表达产物的纯化
[0013]挑取步骤(2)中阳性克隆转化子单菌落接种至氨苄青霉素终浓度为100ug/mL的LB培养基中，于37°C、200r/min条件下振荡培养过夜，再于相同条件下扩大培养至OD6tltl为
0.8，加入IPTG至终浓度为ImM，然后于25°C、150r/min条件下诱导培养12h ;离心收集细胞，加入PBS缓冲液后超声破碎细胞，收集上清液，采用N1-鳌合柱纯化该上清液蛋白质，即得重组AMP脱氨酶表达终产物。
[0014]优选地，步骤(1)所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)MCCCN0.1A01641。
[0015]具体地，步骤(1)所述PCR扩增条件为:95°C预变性5min，94°C变性30s，70°C退火lmin, 72°C延伸 1.5min, 30 个循环后 72°C再延伸 IOmin0
[0016]本发明还提供了上述原核表达方法制备得到的AMP脱氨酶表达产物在食品及医药等领域的应用。
[0017]本发明的有益技术效果在于:
[0018]本发明首次以鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因组为模板，通过重组载体pET28-AMPD的构建、转化与阳克隆转化子的筛选，IPTG诱导表达、重组酶的纯化等步骤及其工艺参数条件的精心筛选和优化，在大肠杆菌中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶；经检测，本发明制备的重组AMP脱氨酶表达产物具有较高的酶活，酶活性稳定，其最适反应温度为60°C，在30°C~60°C之间具有良好的热稳定性，在pH6.0时酶活达到最大，在pH5.0~8.0之间酶活最稳定，易于纯化，可应用于食品、医药等领域，为AMP脱氨酶的工业化生产奠定了基础，
【专利附图】
【附图说明】
`[0019]图1为实施例2重组表达载体pET28-AMPD双酶切验证结果电泳图。
[0020]图2为实施例4重组AMP脱氨酶表达产物纯化后SDS-PAGE蛋白电泳图。
[0021]图3为实施例5温度对重组AMP脱氨酶活性影响的曲线图。
[0022]图4为实施例5温度对重组AMP脱氨酶稳定性影响的曲线图。
[0023]图5为实施例5pH对重组AMP脱氨酶活性影响的曲线图。
[0024]图6为实施例5pH对重组酶稳定性影响的曲线图。
【具体实施方式】
[0025]以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。
[0026]以下实施例所涉及实验材料如下:
[0027]菌株:鼠灰链霉菌购自中国海洋微生物菌种保藏管理中心(MCCC)，保藏编号MCCCN0.1A01641,以下简称鼠灰链霉菌MCCC1A01641 ；E.coli JM109和E.coli BL21均购自大连宝生物工程有限公司。
[0028]所涉及其他试剂及试剂盒均为国产或进口商品。
[0029]实施例1鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆
[0030]以鼠灰链霉菌MCCC1A01641基因组为模板，设计引物对AMPDF1/AMPDR1特异性扩增鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因，并在两端分别加入EcoRI和Not I酶切位点(下划线表示)，引物对 AMPDF1/AMPDR1 序列如下:AMPDF1:5，-GCGGAATTCGCGCCGCCGCCCCGGCAG-3，(SEQ IDN0:1):5，-GCCGCGGCCGCTCACCCCCGGGCGTGCGCCC-3，(SEQ ID NO:2)。
[0031 ] PCR扩增条件为:95 V预变性5min, 94 V变性30s, 70。。退火lmin, 72 V延伸
1.5min，30个循环后72°C再延伸lOmin。
[0032]用胶纯化试剂盒纯化所得PCR产物。
[0033]实施例2重组表达载体pET28-AMPD的构建
[0034]将表达载体pET_28a和实施例1所得PCR产物均用EcoRI/Not I于37°C酶切2h，纯化酶切产物，所得纯化产物于16°C连接过夜并转化E.coli JM109，然后，用AMPDF1/AMPDR1为引物进行菌落PCR以筛选阳性克隆菌株；提取上述阳性克隆菌株质粒，转化E.coliBL21，筛选pET28a-AMPD-JM109阳性菌株；提取重组质粒，双酶切鉴定，酶切验证结果参见图1。
[0035]实施例3重组表达载体pET28-AMPD转化E.coli BL21
[0036]提取实施例2所得pET28a-AMPD_JM109阳性菌株质粒，转化E.coli BL21，筛选阳性克隆转化子。
[0037]实施例4AMP脱氨酶基因的诱导表达及表达产物的纯化
[0038]挑取实施例3所得阳性克隆转化子单菌落接种于30mL LB培养基(含100Ug/mLAmp)中，于37°C、200r/min条件下过夜培养，然后取ImL转接至50mL LB培养基(含IOOug/mL Amp)中于37°C、200r/min条件下培养至OD6tltl为0.8，加入IPTG至终浓度为ImM ;于25 0C、150r/min条件下诱导培养12h，4°C 8000r/min离心5min收集细胞；加入PBS缓冲液，超声破碎细胞5min，4°C 8000r/min离心5min收集上清液；将上清液过N1-鳌合柱(N1-chelatingcolumn),用 0.5mol/L NaCl、50mmol/L PBS(pH7.5)进行平衡，用 500mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、50mmol/LP`BS(pH7.5)进行洗脱，最后通过SDS-PAGE分析蛋白纯度，SDS-PAGE试验结果参见图2。
[0039]实施例5重组AMP脱氨酶酶学性质分析
[0040]5.1重组酶最适反应温度检测
[0041 ] 将实施例4所得酶液与底物在不同温度即30~75 °C条件下，通过分光光度法测定酶活力，计算出酶活以确定最适温度，结果如图3所示。从图3中可以看出:在30°C~55°C之间，随着温度的不断升高，酶活力也逐渐增强，这可能是一方面温度升高增加了酶反应的活化能，另一方面由于NH3减少了而降低了对AMP脱氨酶的抑制；在55°C~65°C之间，酶活的稳定性较好，且在60°C酶活达到最大；当温度高于65°C以后，酶活力随着温度的升高而急速下降，直到75°C酶活接近为零，这是由于温度过高，AMP脱氨酶发生了热变性失活。因此重组酶最适反应温度为60°C。
[0042]5.2重组酶热稳定性检测
[0043]将酶在不同温度下处理30min，立即取出，冰浴30min，按5.1所述方法测定酶活，以未处理(4°C保存)的酶活为100%，从而确定热稳定性，结果如图4所示。从图4中可以看出:在30°C~60°C之间，该酶有良好的热稳定性，但是，温度升高到75°C，酶活力急剧下降。
[0044]5.3pH与重组酶活性关系的检测
[0045]配制不同pH值的0.1moL/L琥珀酸-NaOH缓冲液，按照5.1所述方法测定酶活，计算出酶活以确定最适pH值，结果如图5所示。从图5中可以看出:在pH4.5~6.0之间，随着pH值不断增加,酶活也逐渐升高,且在pH6.0时酶活达到最大,然后，随着pH值增加，酶活不断降低，直至PH7.5时，酶活接近为零。因此，该重组酶最适pH为6.0。
[0046]5.4检测重组酶的pH稳定性
[0047]将酶液在不同的pH条件下处理30min，计算残存活性，以未处理(4°C保存)的酶稳定性为100%，从而确定pH的稳定性，结果如图6所示。由图6中可以看出:该重组酶在pH5.0~8.0之间酶活较稳定，在pH < 4.5以及pH > 8.0酶活急剧下降。
[0048]综上所述，本发明在大肠杆菌中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，经纯化的AMP脱氨酶产物最适反应温度为60°C，在30°C~60°C之间具有良好的热稳定性，在pH6.0时酶活达到最大,在pH5.0~8.0之间酶活最稳定,可应用于食品、医药等领域。 [0049]以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的原核表达方法，其特征在于:以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，并在其两端加入酶切位点，亚克隆至表达载体构建重组质粒，再将该重组质粒转化大肠杆菌感受态，最后IPTG诱导表达，纯化，得AMP脱氨酶表达终产物。
2.根据权利要求1所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的原核表达方法，其特征在于具体步骤如下: (1)鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆 以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID N0:1和SEQ ID NO: 2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，并在其两端分别加入EcoRI和Not I酶切位点，纯化回收PCR产物； (2)重组表达载体的构建 将表达载体pET-28a和步骤(1)所得PCR产物均用EcoRI和Not I双酶切，连接所得酶切产物并转化E.coli JM109，用步骤(1)所述引物对进行菌落PCR筛选阳性克隆菌株；提取上述阳性克隆菌株质粒，转化E.coli BL21，筛选阳性克隆转化子； (3)AMP脱氨酶基因的诱导表达及表达产物的纯化 挑取步骤(2)中阳性克隆转化子单菌落接种至氨苄青霉素终浓度为100ug/mL的LB培养基中，于37°C、200r/min条件下振荡培养过夜，再于相同条件下扩大培养至0D_为0.8，加入IPTG至终浓度为ImM，然后于25°C、150r/min条件下诱导培养12h ;离心收集细胞，加入PBS缓冲液后超声破碎细胞，收集上清液，采用N1-鳌合柱纯化该上清液蛋白质，即得重组AMP脱氨酶表达终产物。`
3.根据权利要求2所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的原核表达方法，其特征在于:步骤(I)所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus) MCCC N0.1A01641。
4.根据权利要求2所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的原核表达方法，其特征在于步骤(I)所述PCR扩增条件为:95°C预变性5min，94°C变性30s，70°C退火lmin，72°C延伸1.5min，30个循环后72°C再延伸lOmin。
5.权利要求1~4任一项所述鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的原核表达方法制备得到的AMP脱氨酶表达产物在食品及医药领域的应用。
【文档编号】C12N15/70GK103773792SQ201410039809
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】张梁, 石贵阳, 方炜, 丁重阳, 顾正华 申请人:江南大学