专利名称：ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种ath_eTM160及其在抑制microRNA160功能中的应用。
背景技术：
MicroRNA(miRNA)是一类重要的小分子RNA，它们参与调控植物的生长发育以及胁迫反应等多个途径。在植物中，miRNA主要通过降解靶基因的方式发挥作用。首先，成熟的miRNA通过碱基互补匹配的方式与靶基因结合，然后引起结合位置靶基因mRNA的切割(切割主要发生在互补区域的10与11位之间)，进而导致靶基因的降解。最近，有研究者报道了一个IPSl基因，虽然该基因能部分的与miR399序列互补匹配，但在切割位置上IPSl形成3个碱基的凸起，该凸起使IPSl不能被miR399切割，也就不能被降解。当细胞内高表达IPSl时，其与miR399结合，这导致miR399不能与其靶基因结合，进而使其靶基因不受miR399调控。IPSl被称为内源的模拟祀基因(endogenous Target Mimic-eTM)。IPSl可以作为抑制miR399的工具，应用于miR399的相关研究。而其它miRNA的内源模拟靶基因未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种ath_eTM160及其在抑制microRNA160功能中的应用。本发明提供的DNA分子，为一种内源DNA分子，命名为ath_eTM160，其为如下
(1)-(3)中任——种的DNA分子
(I)序列表中的序列I自5'末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述严格条件可为如下在6父33(，0.5%303的溶液中，在65° C下杂交，然后用2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到的重组载体。在本发明的实施例中，重组载体为序列表中的序列I自5'末端第8-187位核苷酸插入pCAMBIA1300的Xba I和Sac I酶切位点间得到的载体扩增上述DNA分子的全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物中microRNA160表达或其靶基因表达或改变植物叶片形状中的应用也是本发明保护的范围；其中，所述microRNA160的核苷酸序列为序列表中的序列5。上述应用中，所述microRNA160的靶基因为ARF10、ARF16和/或ARF17。ARFlO的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；ARF16的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；ARF17的核苷酸序列为序列表中的序列4。上述应用中，所述调控植物中microRNA160表达为抑制植物中microRNA160表达；所述调控植物中microRNA1 60靶基因表达为提高植物中microRNA160靶基因表达；所述改变植物叶片形状为增强植物叶片边缘锯齿化；所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。上述抑制植物中microRNA160表达通过提高目的植物中microRNA160表达实现。上述应用为将上述DNA分子导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下I) -3)中至少一种特征I)所述转基因植物中microRNA160表达量低于所述目的植物；2)所述转基因植物中microRNA160的靶基因ARF10、ARF16和/或ARF17表达量均高于所述目的植物；3)所述转基因植物叶片边缘锯齿化。上述DNA分子通过上述重组载体导入目的植物中。上述应用中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥。本发明的实验证明，本发明在拟南芥中获得一段DNA分子ath_eTM160，将其转入拟南芥中过表达，发现其可以抑制拟南芥中microRNA160的表达,且同时提高microRNA160靶基因的表达，也同时呈现叶片锯齿形加重。因此，该基因可以作为内源工具来调控microRNA160 的功能。
图I 为 PCR 扩增得到 ath_eTM160图2为转基因拟南芥的PCR鉴定图3为拟南芥ath_eTM160抑制mi croRNA160的功能
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、ath_eTM160基因的获得I、拟南芥总RNA的提取I) Trizol 法提取(I)取适量野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana,购自ABRC,美国)材料(O. Ig)加入液氮研磨15min，至粉末状，将粉末倒入2mL离心管(约占1/2管)，然后立即加入ImLTrizol试剂。将粉末与Trizol试剂混勻,在室温下孵育5min,以便核酸蛋白复合体完全解离。(2)将离心管于 4°C 12000rpm 离心 15min。(3)将上清液转移到新的2mL离心管中，并向其中加入等体积O. 5ml氯仿，手动剧烈振荡管体15s后，室温静至3min。
(4)将离心管于 4°C 12000rpm 离心 15min。(5)将上层的水相转移至新的离心管中，向其中加入等体积的异丙醇以沉淀RNA。混匀后，于一 20°C静置lOmin。(6)将离心管于 4°C 12000rpm 离心 lOmin。(7)倒掉上清液，加入ImL 75%乙醇清洗RNA沉淀，振荡后，4 °C 12000rpm离心3min。(8)除去乙醇溶液，在超净台吹干。(9)加入20 μ I不含RNA酶的水溶解沉淀，得到RNA溶液。2) RNA 的纯化(除 DNA) (I)将RNA溶液加水至39 μ 1，按下表加入其余试剂，混匀。
权利要求
1.一种DNA分子，为如下(I)-(3)中任--种的DNA分子 (1)序列表中的序列I自5'末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
2.含有权利要求I所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将权利要求I所述DNA分子插入表达载体中，得到的重组载体。
4.扩增权利要求I所述DNA分子的全长或其任意片段的引物对。
5.权利要求I所述DNA分子或权利要求2所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物中microRNA160表达或调控植物中microRNA160靶基因表达或改变植物叶片形状中的应用；所述microRNA160的核苷酸序列为序列表中的序列5。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述microRNA160的靶基因为ARF10、ARF16 和 / 或 ARF17。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述调控植物中microRNA160表达为抑制植物中microRNA160表达；所述调控植物中microRNA160靶基因表达为提高植物中microRNA160靶基因表达；所述改变植物叶片形状为增强植物叶片边缘锯齿化；所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物进一步具体为拟南芥。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为将权利要求I所述DNA分子导入目的植物，得到转基因植物； 所述转基因植物具有如下I) -3)中至少一种特征 1)所述转基因植物中microRNA160表达量低于所述目的植物； 2)所述转基因植物中microRNA160的靶基因ARF10、ARF16和/或ARF17表达量均高于所述目的植物； 3)所述转基因植物叶片边缘锯齿化。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于权利要求I所述DNA分子通过权利要求2所述重组载体导入目的植物中。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于 所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了ath-eTM160在抑制microRNA160功能中的应用。本发明提供的DNA分子，为如下(1)-(3)中任一一种的DNA分子(1)序列表中的序列1自5′末端第8-187位核苷酸所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。本发明的实验证明，在拟南芥中获得一段基因ath-eTM160，将其转入拟南芥中过表达，发现其可以抑制拟南芥中microRNA160的表达。
文档编号C12N15/113GK102864146SQ20121034820
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者王秀杰, 王猛, 吴华君, 王志敏 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所