Pai-1功能的治疗性抑制剂及其使用方法

专利名称：Pai-1功能的治疗性抑制剂及其使用方法
PA1-1功能的治疗性抑制剂及其使用方法发明背景 发明领域本发明涉及修饰的PAI-I蛋白和核酸。本发明也涉及哺乳动物PAI-I配体和调 节剂。本发明具体涉及多肽、多肽组合物以及编码PAI-I配体和/或调节剂多肽的多核苷 酸。本发明也涉及调节PAI-I活性的聚合配体(polyligand)，所述聚合配体是同质聚合配 体(homopoIyligand)或异质聚合配体(heteropolyligand)。本发明也涉及位于细胞区域 内的配体和聚合配体。本发明也涉及可用于为PAI-I配体和聚合配体提供空间调控的定位 束缚子(tether)和启动子序列。本发明还涉及可用于为PAI-I配体和聚合配体提供时序 调控的可诱导基因开关。本发明还涉及治疗或预防动脉粥样硬化的方法。本发明还涉及治 疗或预防纤维化的方法。
背景技术：
纤溶酶原激活剂抑制剂-1 (PAI-I)是一种组织纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶 纤溶酶原激活剂(uPA)的丝氨酸蛋白酶抑制剂，这种制剂能将酶原纤溶酶原转变成纤维 溶解酶纤溶酶。PAI-I对纤维蛋白溶解的调节是正常血管功能的重要控制点，因为纤维蛋 白积累会导致血栓，而纤维蛋白过度减少会导致出血。PAI-I在组织纤维化中也发挥重要 作用，可灭活基质金属蛋白酶以及产生纤溶酶(Takeshita，K等，American Journal of Physiology, 2004 (2) :449-456)，调节动物模型PAI-1表达的研究表明，PAI-I与化学或免 疫介导损伤后纤维化的发病有关(Weisberg. AD等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.， 2005,25 :365-371)。PAI-I也参与肾、肺、心血管和代谢疾病(Cale, JM禾口 Lawrence, DA. Curr Drug Targets, 2007,8 (9) :971-81)及癌症的病理生理学过程。许多研究支持PAI-I在心 脏疾病的发展中具有作用。例如，药理学抑制PAI-I证明能提供保护抵抗血管紧张素 (antiotensin)-II 诱导的主动脉重塑(Weisberg. AD 等，Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.，2005，25 :365-371)。此外，与野生型小鼠相比，观察到PAI-I缺陷小鼠心肌梗塞后 心脏纤维化发展减慢(Takesita，K 等，American Journal of Pathology, 2004,164 (2) 449-455)。一些研究(回顾 Sobel，BE 等，Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.，2003，23 1979-1989)提示，血管壁PAI-I表达的改变可能导致冠状动脉粥样硬化。调节心脏PAI-I表达的新制剂和方法有助于研究其在心脏疾病中的作用。此外， 本领域需要能抑制PAI-I活性的新制剂、治疗和方法。发明概述本发明的一个目的是提供哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂。本发明另一个目的是提供连接于定位束缚子的哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和 /或调节剂。本发明另一个目的是提供连接于组织特异性启动子的哺乳动物PAI-I配体、聚合 配体和/或调节剂。
本发明另一个目的是提供连接于可诱导基因开关的哺乳动物PAI-I配体、聚合配 体和/或调节剂。本发明另一个目的是提供一种实现空间调控哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/ 或调节剂的方法，该方法是将所述配体、聚合配体和/或调节剂连接于定位束缚子或组织 特异性启动子。本发明另一个目的是提供一种实现时序调控哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/ 或调节剂的方法，该方法是将所述配体、聚合配体和/或调节剂连接于可诱导基因开关。本发明另一个目的是提供可与PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂一起使用以提 供空间调控的定位束缚子。本发明另一个目的是提供可与PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂一起使用以提 供空间调控的组织特异性启动子。本发明另一个目的是提供可与PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂一起使用以提 供时序调控的可诱导基因开关。本发明另一个目的是提供编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂的多 核苷酸。本发明另一个目的是提供基因构建物，其包含编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配 体和/或调节剂的多核苷酸和定位束缚子或组织特异性启动子。本发明另一个目的是提供包含编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂 的多核苷酸的载体。本发明另一个目的是提供包含编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂 的多核苷酸的宿主细胞。本发明另一个目的是提供包含编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂 的多核苷酸的转基因生物。本发明另一个目的是提供用哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂治疗或 预防心血管疾病的方法。本发明另一个目的是提供用哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂治疗或 预防纤维变性疾病的方法。本发明另一个目的是一种将编码PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂的多核苷酸 转移到心血管组织内的方法。本发明另一个实施方式是提供一种评价PAI-I在不稳定斑块形成中所具功能的方法。本发明另一个目的是提供用经过修饰可表达纤维溶解途径抑制剂的单核细胞治 疗或预防动脉粥样硬化的方法。本发明另一个目的是提供用经过修饰可表达纤维溶解途径抑制剂的单核细胞治 疗或预防纤维变性疾病的方法。本发明另一个目的是提供一种包含连接于降解决定子的PAI-I蛋白的融合蛋白。本发明另一个目的是提供一种包含连接于定位信号的PAI-I的融合蛋白。本发明另一个目的是提供对载体插入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列。本发明另一个目的是提供对载体插入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任选连接于编码降解决定子的多核苷酸序列。本发明另一个目的是提供对载体插入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列，所述序 列任选连接于编码定位信号的多核苷酸序列。本发明另一个目的是提供基因构建物，其包含对载体插入已经过优化的PAI-I多 核苷酸序列，所述序列任选连接于编码降解决定子和/或定位信号的多核苷酸序列。本发明另一个目的是提供包含基因构建物的载体，所述基因构建物包含对载体插 入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任选连接于编码降解决定子和/或定位信 号的多核苷酸序列。本发明另一个目的是提供含有包含基因构建物的载体的宿主细胞，所述基因构建 物包含对载体插入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任选连接于编码降解决定 子和/或定位信号的多核苷酸序列。本发明另一个目的是提供转基因生物，其包含对载体插入已经过优化的PAI-I多 核苷酸序列，所述序列任选连接于编码降解决定子和/或定位信号的多核苷酸序列。本发明另一个目的是提供基因构建物，其包含对载体插入已经过优化的PAI-I多 核苷酸序列，所述序列任选连接于编码降解决定子和/或定位信号的多核苷酸序列，包括 遍在的组织特异性、细胞特异性或可诱导启动子。本发明另一个目的是提供包含基因构建物的载体，所述基因构建物包含对载体插 入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任选连接于编码降解决定子和/或定位信 号的多核苷酸序列，包括遍在的组织特异性、细胞特异性或可诱导启动子。本发明另一个目的是提供含有包含基因构建物的载体的宿主细胞，所述基因构建 物包含对载体插入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任选连接于编码降解决定 子和/或定位信号的多核苷酸序列，包括遍在的组织特异性、细胞特异性或可诱导启动子。本发明另一个目的是提供包含基因构建物的转基因生物，所述基因构建物包含对 载体插入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列任选连接于编码降解决定子和/或 定位信号的多核苷酸序列，包括遍在的组织特异性、细胞特异性或可诱导启动子。本发明另一个目的是提供一种改变宿主细胞PAI-I表达的方法。本发明另一个目的是提供一种改变心脏组织PAI-I表达的方法。本发明另一个目的是提供一种产生PAI-I表达改变转基因对象的方法。本发明另一个目的是提供哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂。本发明另一个目的是提供连接于降解决定子的哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和 /或调节剂。本发明另一个目的是提供连接于定位信号的哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/ 或调节剂。本发明另一个目的是提供编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂的多 核苷酸，其任选连接于表位、报道分子、降解决定子和/或定位信号。本发明另一个目的是提供基因构建物，其包含任选连接于表位、报道分子、降解决 定子和/或定位信号的编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂的多核苷酸。本发明另一个目的是提供包含基因构建物的载体，所述基因构建物包含任选连接 于表位、报道分子、降解决定子和/或定位信号的编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂的多核苷酸。本发明另一个目的是提供含有包含基因构建物的载体的宿主细胞，所述基因构建 物包含任选连接于表位、报道分子、降解决定子和/或定位信号的编码哺乳动物PAI-I配 体、聚合配体和/或调节剂的多核苷酸。本发明另一个目的是提供转基因生物，其包含任选连接于表位、报道分子、降解决 定子和/或定位信号的编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂的多核苷酸。本发明另一个目的是提供基因构建物，其包含任选连接于表位、报道分子、降解决 定子和/或定位信号的编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/或调节剂的多核苷酸，包括 遍在的组织特异性、细胞特异性或可诱导启动子。本发明另一个目的是提供含有基因构建物的载体，所述基因构建物包含任选连接 于表位、报道分子、降解决定子和/或定位信号的编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配体和/ 或调节剂的多核苷酸，包括遍在的组织特异性、细胞特异性或可诱导启动子。本发明另一个目的是提供含有包含基因构建物的载体的宿主细胞，所述基因构建 物包含任选连接于表位、报道分子、降解决定子和/或定位信号的编码哺乳动物PAI-I配 体、聚合配体和/或调节剂的多核苷酸，包括遍在的组织特异性、细胞特异性或可诱导启动 子。本发明另一个目的是提供含有基因构建物的转基因生物，所述基因构建物包含任 选连接于表位、报道分子、降解决定子和/或定位信号的编码哺乳动物PAI-I配体、聚合配 体和/或调节剂的多核苷酸，包括遍在的组织特异性、细胞特异性或可诱导启动子。本发明另一个目的是提供抑制宿主细胞PAI-I的方法。本发明另一个目的是提供抑制心脏组织PAI-I的方法。本发明另一个目的是提供产生PAI-I活性降低转基因对象的方法。多肽和多核苷酸序列的描述SEQ ID NO :1-30代表PAI-I配体和聚合配体及其编码多核苷酸的例子。图9所 示为各个以下配体和聚合配体的图，显示了它们各自的肽组成体系结构。具体地说，SEQ ID NO 1的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO :2编码，其中已为哺乳动 物表达和载体插入优化了密码子。SEQ ID NO :1的PAI-I聚合配体是同质聚合配体的一个 实施方式，在文中称为PAI1-DCY-94-1。SEQ ID NO 3的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 4编码，其中已为哺乳动物表达和 载体插入优化了密码子。SEQ ID NO :3的PAI-I聚合配体是单体配体(monomeric ligand) 的一个实施方式，在文中称为PAI1-DCY-94-2。SEQ ID NO 5的PAI-I聚合配体由SEQ ID NO 6编码，其中已为哺乳动物表达和 载体插入优化了密码子。SEQ ID NO :5的PAI-I聚合配体是同质聚合配体的一个实施方式， 在文中也称为PAI1-DCY-94-3。SEQ ID NO 7的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 8编码，其中已为哺乳动物表达和 载体插入优化了密码子。SEQ ID NO :7的PAI-I聚合配体是异质聚合配体的一个实施方式， 在文中也称为PAI1-DCY-94-4。SEQ ID NO 9的PAI-I聚合配体由SEQ ID NO 10编码，其中已为哺乳动物表达和 载体插入优化了密码子。SEQ ID NO :9的PAI-I聚合配体是单体配体(monomeric ligand)的一个实施方式，在文中称为PAI1-DCY-94-5。SEQ ID NO :11的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 12编码，其中已为哺乳动物表达和 载体插入优化了密码子。SEQ ID NO :11的PAI-I聚合配体是单体配体(monomeric ligand) 的一个实施方式，在文中称为PAI1-DCY-94-6。SEQ ID NO 13的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 14编码，其中已为哺乳动物表达 和载体插入优化了密码子。SEQ ID NO: 13的PAI-I聚合配体是异质聚合配体的一个实施 方式，在文中也称为PAI1-DCY-94-7。SEQ ID NO 15的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 16编码，其中已为哺乳动物表达 和载体插入优化了密码子。SEQ ID NO: 15的PAI-I聚合配体是异质聚合配体的一个实施 方式，在文中也称为PAI1-DCY-94-8。SEQ ID NO 17的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 18编码，其中已为哺乳动物表达 和载体插入优化了密码子SEQ ID NO: 17的PAI-I聚合配体是异质聚合配体的一个实施方 式,在文中也称为PAI1-DCY-94-9。SEQ ID NO 19的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 20编码，其中已为哺乳动物表达 和载体插入优化了密码子。SEQ ID N0:19的PAI-I聚合配体是异质聚合配体的一个实施 方式，在文中也称为PAI1-DCY-94-10。SEQ ID NO 21的PAI-I聚合配体由SEQ ID NO 22编码，其中已为哺乳动物表达 和载体插入优化了密码子SEQ ID NO :21的PAI-I聚合配体是异质聚合配体的一个实施方 式,在文中也称为PAI1-DCY-94-11。SEQ ID NO 23的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 24编码，其中已为哺乳动物表达 和载体插入优化了密码子。SEQ ID NO :23的PAI-I聚合配体是异质聚合配体的一个实施 方式，在文中也称为PAI1-DCY-94-12。SEQ ID NO 25的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 26编码，其中已为哺乳动物表达 和载体插入优化了密码子。SEQ ID NO :25的PAI-I聚合配体是异质聚合配体的一个实施 方式，在文中也称为PAI1-DCY-94-13。SEQ ID NO 27的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 28编码，其中已为哺乳动物表达 和载体插入优化了密码子。SEQ ID NO :27的PAI-I聚合配体是异质聚合配体的一个实施 方式，在文中也称为PAI1-DCY-94-14。SEQ ID NO 29的PAI-1聚合配体由SEQ ID NO 30编码，其中已为哺乳动物表达 和载体插入优化了密码子。SEQ ID NO :29的PAI-I聚合配体是异质聚合配体的一个实施 方式，在文中也称为PAI1-DCY-94-15。SEQ ID NO :31_36是用于构建配体和聚合配体的全长蛋白质的例子。SEQID N0: 31称为智人(Homo sapiens)纤溶酶原激活剂的抑制剂1，其公共登录号为AAA60009。SEQ ID N0:32称为智人玻连蛋白，其公共登录号为EAW51082。SEQ ID NO :33称为智人激肽释 放酶2，前列腺同工型1，其公共登录号为NP_005M2。SEQ ID NO :34称为智人组织纤溶酶 原激活剂，其公共登录号为BAA00881。SEQ ID NO :35称为智人toll样受体3，其公共登录 号为NP_003256。SEQ ID NO :36称为智人尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)，其公共登录号为 CAAO1390 οSEQ ID NO 37-51是单体配体肽的例子。SEQ ID NO 37-51中的每一个在图9中
12表示为母体蛋白质名称或其缩写名称，随后为母体蛋白质的氨基酸范围，再后为按照约定 表示的任何氨基酸取代突变，即X#Z，其中，X是被取代的氨基酸的单字母氨基酸代码，#是 母体蛋白质内该氨基酸残基的位置或编号，Z是新取代氨基酸的单字母氨基酸代码。SEQ ID NO 37 是 SEQ ID NO 31 的部分序列，在图 9 中表示为 iPAI 1354-368' SEQ ID NO :38 是 SEQ ID NO 31 的部分序列，在图 9 中表示为 iPAI 1300-309' SEQ ID NO :39 是 SEQ ID NO 31 的部分序列，在图 9 中表示为 ‘PAI1343-353，。SEQ ID N0:40是SEQ ID NO :32的部分序列，在图9中表示为‘玻连蛋白20-63，。SEQ ID NO 41是SEQ ID NO 32的部分序列，包含F32L取代突变，在图9中表示 为‘玻连蛋白20-63F32L，。SEQ ID NO 42是SEQ ID NO :32的部分序列，包含T29A取代突变，在图9中表示 为‘玻连蛋白20-63T29A' SEQ ID NO :43是SEQ ID NO 32的部分序列，包含E42A取代突变，在图9中表示 为‘玻连蛋白20-63E42A，。SEQ ID NO 44是SEQ ID NO 32的部分序列，包含L43A取代突变，在图9中表示 为‘玻连蛋白20-63L43A，。SEQ ID NO 45 是 SEQ ID NO 45 的部分序列，包含 S23F、T52E、D53L、A56Y 和 E57Y 取代突变，在图9中表示为‘玻连蛋白20-63突变体’。SEQ ID NO 46是SEQ ID NO :33的部分序列，在图9中表示为‘激肽释放酶 2(25-256)，。SEQ ID NO 47 是 SEQ ID NO 33 的部分序列，在图 9 中表示为 hK2 (25-44)。SEQ ID NO :48是SEQ ID NO :33的部分序列，在图9中表示为‘激肽释放酶 2(47-256)，。SEQ ID NO 49 是 SEQ ID NO 34 的部分序列，在图 9 中表示为 ‘tPA(301-308)，。SEQ ID NO 50 是 SEQ ID NO 35 的部分序列，包含 V55A、N57Y、T59N、S79K、D81K 和 G83E 取代突变，在图 9 中表示为 Ioll 样受体 329-121 (V55A，N57Y, T59N, S79K, D81K, G83E)，。SEQ ID NO 51 是 SEQ ID NO 36 的部分序列，包含 H224A、D275A 和 S376A 取代突 变，在图9中表示为‘尿激酶纤溶酶原激活剂(179-415)H224A，D275A，S376A，。SEQ ID NO :52表示用于产生天然间隔片段的全长蛋白质的例子。SEQ IDNO 524也称为特异腐质霉(Humicola insolens)外切葡聚糖酶-6A前体(外纤维二糖水解 酶6A) (1，4-β-纤维二糖水解酶6A) (β-葡聚糖纤维二糖水解酶6A)(微晶粉末纤维素酶 2 (Avicelase 2))，其公共登录号为 Q9C1S9。SEQ ID NO :53表示天然间隔片段的一个例子。SEQ ID Ν0:53是SEQ IDNO 52的 部分序列，在图9中表示为‘16aa接头’。SEQ ID NO :54_56是人造间隔的例子。SEQ ID NO 57-76代表用于本发明1类定位束缚子多肽的例子。

图14A-14B显示 以下1类定位束缚子多肽各自的图，显示了它们各自的肽组成体系结构。SEQ ID NO 57的1类定位束缚子多肽也称为91_1。SEQ ID NO 58的1类定位束缚子多肽也称为91_2。
SEQIDNO59的1类定位束缚子多肽也称为91-3。
SEQIDNO60的1类定位束缚子多肽也称为91-4。
SEQIDNO61的1类定位束缚子多肽也称为91-5。
SEQIDNO62的1类定位束缚子多肽也称为91-6。
SEQIDNO63的1类定位束缚子多肽也称为91-7。
SEQIDNO64的1类定位束缚子多肽也称为91-8。
SEQIDNO65的1类定位束缚子多肽也称为91-9。
SEQIDNO66的1类定位束缚子多肽也称为91-10。
SEQIDNO67的1类定位束缚子多肽也称为91-11。
SEQIDNO68的1类定位束缚子多肽也称为91-12。
SEQIDNO69的1类定位束缚子多肽也称为91-13。
SEQIDNO70的1类定位束缚子多肽也称为91-14。
SEQIDNO71的1类定位束缚子多肽也称为91-15。
SEQIDNO72的1类定位束缚子多肽也称为91-16。
SEQIDNO73的1类定位束缚子多肽也称为91-17。
SEQIDNO74的1类定位束缚子多肽也称为91-18。
SEQIDNO75的1类定位束缚子多肽也称为91-19。
SEQIDNO76的1类定位束缚子多肽也称为91-20。
SEQIDNO77--95是用于构建1类定位束缚子的多肽片段的例子。
SEQIDNO:96表示用作内部运载物(cargo)以构建1类定位束缚子的表位标签的例子，在图14A-14B中表示为‘TAG’。
SEQ ID NO :97-99是用于构建1类定位束缚子的间隔的例子。
SEQIDNO=100-111代表用于本发明3类定位束缚子多肽的例子。图15显示以下3类定位束缚子多肽各自的图显示了它们各自的肽组成体系结构。
SEQIDNO100 的3类定位束缚子多肽也称为93-1。
SEQIDNO101 的3类定位束缚子多肽也称为93-2。
SEQIDNO102 的3类定位束缚子多肽也称为93-3。
SEQIDNO103 的3类定位束缚子多肽也称为93-4。
SEQIDNO104 的3类定位束缚子多肽也称为93-5。
SEQIDNO105 的3类定位束缚子多肽也称为93-6。
SEQIDNO106 的3类定位束缚子多肽也称为93-7。
SEQIDNO107 的3类定位束缚子多肽也称为93-8。
SEQIDNO108 的3类定位束缚子多肽也称为93-9。
SEQIDNO109 的3类定位束缚子多肽也称为93-10。
SEQIDNO110 的3类定位束缚子多肽也称为93-11。
SEQIDNO111 的3类定位束缚子多肽也称为93-12。
SEQIDNO=112-129是用于构建3类定位束缚子的多肽片段的例子。
SEQIDNO:130表示用作内部运载物(cargo)以构建3类定位束缚子的表位标签
的例子，在图15中表示为‘TAG’或‘TAG/IC’。
SEQ ID NO :131是用于构建3类定位束缚子的合成TACE/ADAM17切割位点的例子。SEQ ID NO :132-139代表用于本发明组织特异性启动子序列的例子。SEQ ID NO 132是动脉平滑肌特异性启动子的例子，在文中也称为M0D5306，其结 构描绘于图10。SEQ ID NO :133是合成血管平滑肌细胞特异性启动子的例子，在文中也称为MOD 5309，其结构描绘于图IlA0SEQ ID NO :134是合成血管平滑肌细胞特异性启动子的例子，在文中也称为MOD 5312，其结构描绘于图11B。SEQ ID NO :135是合成血管平滑肌细胞特异性启动子的例子，在文中也称为MOD 5315，其结构描绘于图11C。SEQ ID NO :136是内皮细胞特异性启动子的例子，在文中也称为M0D4012-ESM1，其 结构描绘于图12A。SEQ ID NO :137是内皮细胞特异性启动子的例子，在文中也称为M0D4399-FLT1，其 结构描绘于图12B。SEQ ID NO :138是合成的内皮细胞特异性启动子的例子，在文中也称为MOD 4790， 其结构描绘于图13A。SEQ ID NO :139是合成的内皮细胞特异性启动子的例子，在文中也称为MOD 4791， 其结构描绘于图13B。如本领域所共知，本文采用了三字母氨基酸代码和单字母氨基酸代码。附图简述图1A-1F显示了有或没有间隔的同质聚合配体的例子。图2A-2J显示了有或没有间隔的异质聚合配体的例子。图3A-3H显示了连接于定位信号的配体和聚合配体的例子。图4A-4G显示了连接于表位或报道分子的聚合配体的例子。图5A-5I显示了连接于定位信号以及表位或报道分子的聚合配体的例子。图6A-6E显示了包括任选连接于表位、报道分子和/或定位信号的配体或聚合配 体的基因构建物的例子。图7A-7D显示了含配体基因构建物的载体的例子。图8显示了用于组成型合成聚合配体的顺序克隆方法的例子。图9显示了配体和聚合配体以及它们PAI-I抑制机制的例子。图10显示了动脉平滑肌特异性启动子的例子。图11A-11C显示了合成的血管平滑肌细胞特异性启动子的例子。图12A-12B显示了内皮细胞特异性启动子的例子。图13A-i;3B显示了合成的内皮细胞特异性启动子的例子。图14A-14B显示了 1类定位束缚子的例子。图15显示了 3类定位束缚子的例子。图16显示了 PAI-I配体和聚合配体的示例性抑制机制。图17A-17H显示了连接于降解决定子和/或定位信号的PAI-I的例子。图18A-18I显示了包含任选连接于降解决定子和/或定位信号的ULTRAVECTOR(UV)-能PAI-lcDNA的基因构建物的例子。图19A-19D显示了含有ULTRAVECTOR(UV)-能PAI-I基因构建物的载体的例子。图20A-20J显示了有或没有间隔的连接于降解决定子的配体和同质聚合配体的 例子。图21A-21H显示了有或没有间隔的连接于降解决定子的异质聚合配体的例子。图22A-22F显示了连接于降解决定子和定位信号的配体和聚合配体的例子。图23A-23G显示了包含任选连接于降解决定子和/或定位信号的配体或聚合配体 的基因构建物的例子。发明详述本说明书和权利要求书中使用的术语具有本领域所理解的常规含义。例如，多核 苷酸可与核酸互换使用，包括单链和双链DNA、RNA及其聚合类似物。术语嵌合表示由其天然状态下不毗连的片段构成。例如，嵌合型多核苷酸表示包 含其天然状态下不毗连片段的多核苷酸。术语多肽、肽和蛋白质可互换使用，代表氨基酸的聚合物。合成基因(或基因的一部分)是一种不同于野生型多核苷酸序列的非天然基因 (或基因的一部分)。合成基因(或基因的一部分)可包含一个或多个天然不毗连的核酸 序列(嵌合序列)，和/或可包含取代、插入和缺失以及它们的组合。非人生物包括非人灵长类、哺乳动物、脊椎动物、无脊椎动物、植物以及包括酵母 和粘菌在内的低等真核生物。限制性内切酶是能在核酸分子内的识别序列上切割核酸的酶。宿主细胞包括但不限于市售和非市售的细胞系，如从ATCC(马纳萨斯，弗吉尼亚 州)获得的细胞、原代细胞培养物、干细胞、免疫细胞、血细胞、任何生物或组织的细胞。载体指用于将核酸克隆和/或转移到宿主细胞内的任何运载体。载体可以是一 种复制子，其与另一 DNA区段相连可使所连区段复制。复制子指用作DNA体内复制的自 主单元，即能在其本身控制下复制的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病 毒)。术语载体包括用于在体外、离体或体内将核酸引入细胞的病毒和非病毒运载体。本 领域已知许多载体可用于操作核酸、将反应元件和启动子掺入基因中，等等。可能的载体包 括，例如质粒或修饰的病毒，包括，例如噬菌体，如λ衍生物，或质粒，如pBR322或pUC质 粒衍生物，或Bluescript载体。可用于本发明的载体的另一例子是如通过引用纳入本文 的TO 2007/038276所述的弗吉尼亚州布莱克斯堡的英特列克星敦公司antrexon Corp., Blacksburg，VA)的UltraVector 产生系统。例如，可通过将合适DNA片段连接入具有互 补粘性末端的所选载体而实现将对应于反应元件和启动子的DNA片段插入合适载体中。或 者，可用酶修饰DNA分子的两端，或者可将核苷酸序列(接头)连接入DNA末端来产生任何 位点。可工程改造这种载体使之含有可选择标记基因以选择标记已掺入细胞基因组中的细 胞。这种标记得以鉴定和/或选择掺入了标记并表达其所编码蛋白质的宿主细胞。病毒载体，特别是逆转录病毒载体已用于细胞以及活的动物对象的各种基因递送 应用。可采用的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘 病毒、单纯疱疹病毒、E-B病毒、腺病毒、双粒病毒和花椰菜花叶病毒载体。非病毒载体包括 质粒、脂质体、荷电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物。除核酸外，载体还可包含一个或多个调控区域和/或用于选择、检测和监测核酸转运结果(转动至何种组 织、表达持续时间等)的可选择标记。术语质粒指通常携带有基因的染色体外元件，它不是细胞中心代谢的一部分，通 常是环状双链DNA分子形式。这种元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA，线 形、环状或超螺旋形的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核 苷酸序列连接或重组入独特构建物中，该构建物能将所选基因产物的启动子片段和DNA序 列连同合适的3’非翻译序列一起引入细胞。克隆载体指复制子，它是单位长度的核酸，优选DNA，能顺序复制并包含复制起点， 例如质粒、噬菌体或粘粒，可将另一核酸区段与其相连从而复制该连接区段。克隆载体能在 一种细胞类型中复制，在另一种中表达(穿梭载体)。克隆载体可包含一条或多条序列而利 用其选择包含该载体的细胞和/或一个或多个插入感兴趣序列的多克隆位点。术语病毒载体指载体、质粒或运载体，其设计成能在转化入宿主后表达所插入的 核酸序列。克隆的基因，即，插入的核酸序列通常置于调控元件，例如启动子、最小启动子、 增强子等的控制下。可用于驱动核酸在所需宿主细胞中表达的启动调控区或启动子种类 繁多，为本领域技术人员所熟悉。事实上，任何能驱动这些基因表达的启动子都可用于表 达载体中，包括但不限于病毒启动子、细菌启动子、动物启动子、哺乳动物启动子、合成启 动子、组成型启动子、组织特异性启动子、致病或疾病相关启动子、发育特异性启动子、诱导 型启动子、光调节启动子；CYCU HIS3、GALU GAL4、GALlO, ADHU PGK、PH05、GAPDH、ADCU TRP1、URA3、LEU2、EN0、TPI、碱性磷酸酶启动子(用于在酵母菌中表达)；AOXl启动子(用 于在毕赤酵母菌中表达)；β-内酰胺酶、1肌、￡1仪、切扒仕？、让1^让1 、17、切(3、和trc启动 子(用于在大肠杆菌中表达)；光调节_、种子特异性_、花粉特异性_、子房特异性、花椰菜 花叶病毒35S、CMV 35S最低、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)、叶绿素a/b结合蛋白、核酮糖1， 5- 二磷酸羧化酶、枝条-特异性、根特异性、壳多糖酶、应激诱导型、水稻东格鲁杆状病毒、 植物超级启动子、马铃薯亮氨酸氨肽酶、硝酸盐还原酶、甘露碱合酶、胭脂碱合酶、泛素、玉 米蛋白和花青甙启动子(可用于在植物细胞中表达)；本领域已知的动物和哺乳动物启动 子，包括但不限于SV40早期(SV40e)启动子区、劳斯肉瘤病毒(RSV)的3’长末端重复序列 (LTR)中所含的启动子、腺病毒(Ad)的ElA或主要晚期启动子(MLP)基因的启动子、巨细胞 病毒(CMV)早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)启动子、杆状病毒IEl启动子、 延伸因子la (EFl)启动子、磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、泛素⑴be)启动子、白蛋白启 动子、小鼠金属硫蛋白-L启动子的调控序列和转录调控区、遍在启动子(HPRT、波形蛋白、 β-肌动蛋白、微管蛋白等)、中间丝(索蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP等)的启动子、治疗基 因(MDR、CFTR或VIII型因子等的)的启动子、致病或疾病相关启动子、和显示组织特异性 及已用于转基因动物中的启动子，例如在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因调控 区；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因调控区、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因 调控区、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调控区；白蛋白基因、 在肝中有活性的Apo AI和Apo AII调控区、在肝中有活性的甲胎蛋白基因调控区、在肝中 有活性的α -抗胰蛋白酶基因调控区、在骨髓细胞中有活性的β-球蛋白基因调控区、在 大脑少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱蛋白基因调控区、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻 链-2基因调控区、和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因调控区、丙酮酸激酶启动子、绒毛蛋白启动子、脂肪酸结合肠蛋白的启动子、平滑肌细胞肌动蛋白的启动子， 等等。此外，可通过加入增强子或调节序列等来修饰这些表达序列。可用本领域已知的方法，例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚 糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、利用基因枪或DNA载体运输蛋白将载体引入所需 的宿主细胞中(参见，例如 Wu 等，J.Biol. Chem.洸7 :963(1992) ；Wu 等，J. Biol. Chem.洸3 14621(1988)；和 Hartmut 等，加拿大专利申请号 2,012,311)。也可通过脂质转染体内引入本发明的多核苷酸。在过去10年，用脂质体体外包裹 和转染核酸逐渐增多。可利用合成的阳离子脂质制备用于体内转染编码标记的基因的脂质 体，设计的阳离子脂质能减少脂质体介导转染遇到的困难和危险(Feigner等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84 :7413 (1987) ；Mackey 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027(1988)； 和Ulmer等，Science 259:1745(1993))。采用阳离子脂质可促进带负电核酸的包裹，也 能促进与带负电细胞膜的融合(Feigner等，Science 337:387(1989))。W095/18863、 W096/17823和U. S. 5，459，127描述了转运核酸特别有用的脂质化合物和组合物。采用脂质 转染将外源性基因体内引入特定生物体具有一定的实用优点。脂质体分子可靶向特定细胞 代表了一类优点。直接转染特定细胞类型显然在具有细胞异质性的组织，例如胰腺、肝脏、 肾脏和脑中特别优选。为了靶向目的，可将脂质与其它分子化学偶连(Mackey等，1988，同 上)。可将靶向的肽，例如激素或神经递质和蛋白质，例如抗体，或非肽分子化学偶联于脂质 体。也可采用其它分子来促进核酸的体内转染，例如阳离子寡肽(如W095/21931)、衍 生自DNA结合蛋白质的肽(如W096/25508)或阳离子聚合物(如W095/21931)。也可将载体作为裸DNA质粒引入体内(参见，美国专利号5，693，622、5，589，466 和5，580, 859)。还可采用受体介导的DNA递送方法(Curiel等，Hum. Gene Ther. 3 147 (1992)；和 Wu 等，J. Biol. Chem. 262 4429 (1987))。术语转染指细胞摄取外源或异源性RNA或DNA。当这种RNA或DNA被引入细胞内 时，称该细胞被外源或异源性RNA或DNA转染。当转染的RNA或DNA导致表型改变时，称细 胞被外源或异源性RNA或DNA转化。转化的RNA或DNA可以整合(共价相连)入构成细胞 基因组的染色体DNA中。转化指核酸片段转移入宿主生物体的基因组中，从而导致遗传学稳定的遗传性。 含有被转化核酸片段的宿主生物称为转基因或重组生物或转化生物。此外，包含本发明多核苷酸的重组载体可包含它们要在其中扩增或表达的细胞宿 主的一个或多个复制起点，标记或可选择标记。术语可选择标记指一种可鉴定因子，通常是根据该标记基因的作用而选择抗生素 抗性或化学抗性基因(即抵抗抗生素、抵抗除草剂)、比色标记、酶、荧光标记等，可利用这 种作用来示踪遗传了感兴趣核酸和/或鉴定已遗传了该感兴趣核酸的细胞或生物。本领域 已知并使用的可选择标记基因的例子包括提供氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、 潮霉素、双丙氨磷除草剂、磺酰胺等抗性的基因；和可用作表型标记物的基因，即花青苷调 节基因、异戊烯转移酶基因，等等。术语报道分子指编码能依据报道分子的作用而得到鉴定的鉴定因子的核酸，可利 用这种来示踪遗传了感兴趣核酸，鉴定已遗传了感兴趣核酸的细胞或生物，和/或检测基因表达诱导或转录。本领域已知并使用的报道分子的例子包括但不限于萤光素酶(Luc)、 荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β -半乳糖苷酶(LacZ)、β -葡 糖醛酸糖苷酶(Gus)等。可选择标记基因也可视作报道分子。启动子和启动子序列可互换使用，指能控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序 列。编码序列通常位于启动子序列的3’端。启动子可以全部衍生自天然基因，或由衍生自 天然发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA区段。本领域技术人 员知道不同启动子可指导不同组织或细胞类型，或不同发育阶段，或在对不同环境或生理 条件反应时的基因表达。可导致基因在大多数细胞类型中大部分时间内表达的启动子通常 称为组成型启动子。可导致基因在特定细胞类型中表达的启动子通常称为细胞特异性启动 子或组织特异性启动子。可导致基因在发育或细胞分化特定阶段表达的启动子通常称为发 育特异性启动子或细胞分化特异性启动子。在与能诱导启动子的药物、生物分子、化学品、 配体、光等接触或用这些物质处理细胞后，诱导和导致了基因表达，这种启动子通常称为诱 导型启动子或可调节启动子。还应知道，由于在大多数情况中调控序列的确切边界并不完 全明确，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。启动子序列在其3’末端通常结合有转录起始位点并向前延伸(5’方向)而包含 启动转录水平超过背景而可检测的所需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列中可找到 转录起始位点(通过，例如核酸酶Sl图谱不难确定)以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结 合结构域(共有序列)。术语同源性指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的相同性百分比。可用本领域已 知的技术测定一个部分的序列与另一部分的序列之间的对应性。例如，可排列对比序列信 息并利用不难获得的计算机程序来直接比较两个多肽分子之间的序列信息从而测定同源 性。或者，可在同源区之间形成稳定双链体的条件下使多核苷酸杂交，然后用单链同源性核 酸酶消化并测定消化片段的大小来测定同源性。本文所用的术语同源的所有语法形式和拼写变化形式指具有共同进化起源的蛋 白质之间的关系，包括来自超家族(例如，免疫球蛋白超家族)的蛋白质和不同物种的同源 蛋白质(例如，肌球蛋白轻链等)(Reeck等，Cell 50 :667 (1987))。序列高度相似反映了这 种蛋白质(和它们的编码基因)具有序列同源性。然而，在常规应用和本申请中，当术语同 源采用副词(例如高度)修饰时，指序列相似性而不指共同的进化起源。因此，术语序列相似性的所有语法形式指可能具有或不具有共同进化起源的核酸 和蛋白质的氨基酸序列之间的相同性或对应性程度(参见Reeck等，Cell50 :667(1987))。 在一个实施方式中，当二条DNA序列在确定长度上有至少约50% (例如，至少约75^^90% 或95%)的核苷酸匹配时，称这两条DNA序列基本上同源或基本上相似。可利用已有的序 列数据库标准软件，或在(例如)特定系统所规定的严谨条件下进行Southern杂交实验比 较序列，从而鉴定基本上同源的序列。本领域技术人员知道如何确定合适的杂交条件(参 见例如，Sambrook等，1989，同上)。本文所用的基本上相似，指核酸片段中一个或多个核苷酸碱基的改变导致一个或 多个氨基酸取代，但不影响该DNA序列所编码蛋白质的功能特性。基本上相似，也指核酸片 段中一个或多个核苷酸碱基的改变不影响该核酸片段(用反义或共-阻遏技术检测)介导 基因表达改变的能力。基本上相似，还指本发明核酸片段的修饰，例如缺失或插入一个或多个核苷酸碱基不实质性影响所产生的转录物的功能特性。因此，应该知道本发明包括多个 具体的示范性序列。提到的各种修饰是本领域常规技术中所熟知，如测定编码的产物是否 保留了生物学活性。此外，本领域技术人员知道还可通过在严谨性条件下(0. IX SSC,0. 1% SDS,65°C 和用2X SSC, 0. 1% SDS，然后用0. IX SSC, 0. 1% SDS洗涤)能否与本文举例的序列杂交来 确定本发明包括的基本上相似的序列。本发明的基本上相似的核酸片段是其DNA序列与本 文报道的核酸片段的DNA序列有至少约70%、80%、90%或95%相同的那些核酸片段。本文所用术语相对应指相似或同源序列，而无论检测相似性或同源性的分子某确 切位置是否相同或不同。核酸或氨基酸序列排列比对时可包括空格。因此，术语相对应指 序列相似性，而不指氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。氨基酸或核苷酸序列的实质性部分包含足够长的多肽氨基酸序列或基因核苷酸 序列，可由本领域技术人员通过手工操作评价序列，或采用诸如BLAST (局部序列比对基本 检索工具；Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 :403 (1993))；可从 ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 获 得)等算法进行计算机自动序列比较和鉴定来推测性鉴定该多肽或基因。通常，10个或更 多个毗连的氨基酸或30个或更多个核苷酸的序列是推测性鉴定某多肽或核酸序列是否与 已知蛋白质或基因同源所必需。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个毗连核苷酸的基因特 异性寡核苷酸探针可用于基因鉴定(例如，Southern杂交)和分离(例如，细菌菌落或噬 菌体噬斑的原位杂交)的序列依赖性方法。另外，12-15个碱基的短寡核苷酸可用作PCR中 的扩增引物以获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的实质性部分应包含足 够长的序列以特异性鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本发明的一个方面是提供一种连接于降解决定子的PAI-I蛋白。降解决定子可 连接在PAI-I蛋白的氨基末端或羧基末端。降解决定子，或降解决定信号是本领域已知 的，是一种短的、通常为可诱导多肽降解的便携式元件，它几种例子描述于Garcin，D等， Journal of Virology, 2004, 78 (16) :8799-8811 以及(Gardner，RG 和 Hampton，RY，The EMBO Journal, 1999,18(21) :5994_6004。连接于降解决定子的 PAI-1 的例子见图 17A、17B、17E、 I7F、17G 和 17H。本发明另一个方面是提供连接于定位信号的PAI-I蛋白。细胞定位信号的非限制 性例子有定位于肌质网、内质网、胞外基质、线粒体、高尔基体、过氧化物酶体、溶酶体、核、 核仁、核内体、外体、其他胞内囊泡、胞质膜、顶膜和基底外侧膜的信号。在一个实施方式中， PAI-I通过例如美国临时申请60/957，328中所述的那些非细胞特异性胞质膜定位信号传 递到细胞外表面。在其他实施方式中，PAI-I通过细胞特异性定位信号，如成纤维细胞、内 皮细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞和心肌细胞肌膜的特异性定位信号，传递到细胞外表面。在 其他实施方式中，PAI-I通过胞外相关结构域，例如胶原结合蛋白，传递到胞外基质，或心肌 梗塞区富含的其他胞外组分。图17C-17H显示了连接于定位信号的PAI-I的其他例子。给 出的定位信号仅是举例而不是限制。本发明一方面是提供对载体插入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列。在一个实施 方式中，所述多核苷酸为插入ULTRAVECT0R(弗吉尼亚州布莱克斯堡的英特列克星敦公司 (Intrexon Corp. Blacksburg, VA)，US2004/0185556)质粒载体已经过优化。在另一个实 施方式中，通过除去以下内部限制性位点NgoMIV、Xma I, Cla I, BamH I, BstB I, EcoR I、RcoR V,Pci I、Sac I、Stu I, ApaL I,Bgl II, Kpn I, Mfe I, Nde I, Nhe I, Nsi I, Asc I、 AsiS I,Bsiff I,Fse I,Mlu I,Not I,Pac I.Sal I,SbfI,SnaB I,Swa I,Rsr IIl、RsrII2、 BstXKSap I、BsmB I、Xba I、Xho I、Hpa I、Pml I、Sph I、Aar I、Bgl I、BsmB I、BspM I、 BstAP I、BstX I、Dra III, Ear I、Sap I、Blp I和BspE I，对插入载体的多核苷酸已进行 了优化。本发明一方面是提供对载体插入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列连 接于降解决定子多核苷酸序列。在一个实施方式中，所述降解决定子序列连接于PAI-I多 核苷酸序列的5'端(例如，见图18C和18H)。在本发明另一个实施方式中，所述降解决定 子序列连接于降解决定子多核苷酸序列的3'端(例如，见图18B和18F)。本发明另一方面是提供对载体插入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列，所述序列 连接于定位信号(例如见图18D-18I)。本发明另一个实施方式涉及选择性调控载体插入优化的PAI-I多核苷酸序列在 所需细胞、组织或生理状态中表达的基因构建物。所述基因构建物可包括任选连接于降解 决定子和/或定位信号的PAI-I基因构建物。示例性的基因构建物见图13A-13E、23A-23G 和18A-18I。所述基因构建物的启动子部分可以是组成型启动子、非组成型启动子、组织特 异性启动子(组成型或非组成型)或可诱导启动子。可用于本发明的组织特异性启动子 的非限制性例子是内皮细胞特异性启动子(White，SJ等，Gene Ther. 2007/11/8[印刷前 电子公开])，血管平滑肌细胞特异性启动子(Ribault，S，Circ Res.，2001，88 (5) :468-75; Appleby, CE 等，Gene Ther. 2003，10 (18) :1616-22)，心肌细胞特异性启动子(Xu, L 等，J Biol Chem.，2006，281 (45) =34430-40)，冠脉脂肪细胞特异性启动子，以及心脏成纤维细胞 特异性启动子。组合的组织和状态特异性启动子如心脏和缺氧特异性启动子(Su，H等，Proc Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 2004,101 (46) =16280-5)也可用于本发明。可诱导启动子可用药 物或其他因子激活。RHE0SWITCH是一种从马萨诸塞州伊普斯威奇市新英格兰生物实验室 (New England BioLabs, Ipswich,ΜΑ)购得的可诱导启动子系统，可用于本发明。本发明的 一个实施方式包括表达受可诱导启动子系统调控的PAI-I基因构建物。201本发明另一方面提供含基因构建物的载体，以表达本文所述的为哺乳动物细 胞表达和载体插入而优化的PAI-I多核苷酸序列。载体可以是本文所述的病毒载体或非病 毒载体。这种载体的非限制性例子见图19A-19D。图19Α显示了通用形式含载体插入优化的PAI-I多核苷酸序列和任选的定位信号 和/或降解决定子的载体，其中的基因构建物可作为一个单元从载体上释放而产生转基因 动物。例如，通过限制性核酸内切酶消化使所述基因构建物或转基因从载体骨架释放。然 后将释放的转基因注射到小鼠受精卵的原核中；或用该转基因转化胚胎干细胞。图19Α所 示的载体也可用于瞬时转染转基因，其中所述转基因的启动子和密码子为哺乳动物表达已 进行了优化。图19Β和19C描绘了用于递送和控制PAI-I多肽体内表达的基因治疗载体的实施 方式。图19Β和19C中连接于基因构建物的多核苷酸序列包括基因组整合结构域以利于转 基因整合入病毒基因组和/或宿主基因组中。图19D显示了用于产生稳定细胞系的含定位信号基因构建物的载体。本发明另一方面提供了含有载体的宿主细胞，所述载体包含基因构建物，以表达本文所述的为哺乳动物细胞表达和载体插入已经过优化的PAI-I多核苷酸序列。在一个实 施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞包括人、非人灵长类、小鼠、牛、猪、羊、 马、大鼠、兔、狗、猫和豚鼠细胞。宿主细胞的具体类型包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细 胞、平滑肌细胞和脂肪细胞。本发明另一方面提供含有为哺乳动物细胞表达和载体插入而优化的PAI-I多核 苷酸序列的转基因生物。在一个实施方式中，所述转基因宿主是哺乳动物。哺乳动物转基 因宿主包括非人灵长类、小鼠、牛、猪、羊、马、大鼠、兔、狗、猫和豚鼠。将完整的转基因注射 到受精卵母细胞的原核内或胚胎干细胞内以产生转基因生物。完整的转基因包括为哺乳 动物细胞表达和载体插入而优化的PAI-I多核苷酸序列，任选连接于本文所述的降解决定 子、定位信号或组成型启动子、非组成型启动子、组织特异性启动子(组成型或非组成型) 或可诱导启动子。所述转基因生物可用作动物模型来确定PAI-I在心脏中的作用。本发明另一方面是改变宿主细胞PAI-I表达的方法，包括将包含编码至少一个 PAI-I拷贝的载体插入优化的核酸分子的载体转染入宿主细胞，并在适合产生至少一个 PAI-I拷贝的条件下培养该转染的宿主细胞。本发明另一方面是改变对象心脏组织PAI-I表达的方法，包括将包含编码至少一 个PAI-I拷贝的载体插入优化的核酸分子的载体注射入对象的心脏组织。本发明另一方面是一种产生具有PAI-I表达改变的转基因对象的方法，包括将包 含编码至少一个PAI-I拷贝的载体插入优化的核酸分子的载体注射入受精卵或胚胎干细 胞中。本发明一个方面是通过截短和/或氨基酸取代修饰天然底物和/或调节剂从而提 供PAI-I活性的新型配体抑制剂。本发明另一个方面是通过将新型抑制剂及其变体连接在一起从而提供PAI-I活 性的模块式聚合配体抑制剂。本发明又一方面是通过与降解决定子相连而限制PAI-I抑制 剂、配体或聚合配体的活性。本发明再一个方面是通过与定位信号相连而使PAI-I抑制剂、 配体或聚合配体细胞定位。本发明的一个方面包括抑制PAI-I作为预防心脏组织纤维化的方法。通过抑制 PAI-I将缓解对纤溶酶原激活剂的抑制，导致纤溶酶原活化成纤溶酶而破坏纤维蛋白。增强 患病心脏纤维蛋白的破坏是治疗或预防II型糖尿病、高甘油酯血症、高血压、肥胖症、烟草 接触或其他原因所致心肌病的一种潜在方法。本发明其他方面包括用于任何组织的PAI-I抑制剂。本发明的其他实施方式包括通过与靶向细胞某区域的定位信号相连而使PAI-I 抑制剂定位于不同细胞位置。本发明涉及PAI-I的多肽配体和聚合配体。PAI-I配体和聚合配体的各种实施方 式代表为SEQ ID NO :1-30和SEQ ID NO :37-51。更具体地说，本发明涉及包括SEQ ID NO: 37-51中任何一个或多个的配体、同质聚合配体和异质聚合配体。此外，本发明涉及包含SEQ ID NO :31-36的一个或多个部分序列(截短片段)或其任一部分的配体和聚合配体。此 外，本发明涉及与包含SEQ IDNO 37-51中一个或多个或者其任一部分的聚合配体有至少 约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列相同性的聚合配体。此外，本发明涉 及与包含SEQ ID NO :31-36的一个或多个部分序列的聚合配体有至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%序列相同性的聚合配体。聚合配体可以是同质聚合配体或异质聚合配体，是由两个或多个单体多肽配体构 成的嵌合配体。同质聚合配体的例子见图4A-4F。异质聚合配体的例子见图6A-6J。单体 配体的一个例子是SEQ ID NO :40所示的多肽。SEQ ID NO :40是从亲本全长SEQ ID NO 32 中选出的部分序列。同质聚合配体的一个例子是包含SEQ ID NO :37的二聚体或多聚体的 多肽。异质聚合配体的一个例子是包含SEQ ID NO 37和SEQ ID NO :38-51之一或多个的 多肽。SEQ ID NO :37-51中的每一个代表了一个单体形式的多肽配体。SEQ ID NO 37-51 是选出的SEQID NO 31-36部分序列的例子，然而，SEQ ID NO :31-36的其他部分序列也可 用作单体配体。SEQ ID NO 31-36的单体部分序列可以与亲本多肽如SEQ IDNO 40的一部 分相同。此外，SEQ ID NO :31-36的单体部分序列可含有氨基酸取代，如SEQ ID NO :41_45。 此外，单体配体和聚合配体与包含SEQ ID NO :37-51之一个或多个的氨基酸序列的配体的 序列相同性至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。此外，单体配体和聚 合配体与SEQ ID NO 31-36的部分序列的序列相同性至少约80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%禾口 99%。有许多方法可将SEQ ID NO :37_51并入同质聚合或异质聚合配体。此外，有许多 方法可将SEQ ID NO 31-36的其他部分序列相互合并和与SEQ IDNO :37-51合并得到聚合 配体。同质聚合配体体系结构的非限制性例子见图1A-1F。异质聚合配体体系结构的非限 制性例子见图2A-2J。本发明涉及同质聚合配体和异质聚合配体的所有可能组合，对此没有 限制。本发明的配体和聚合配体被设计成能调节PAI-I的内源功能。在本发明的一个实施方式中，所述配体或聚合配体是本文所述的PAI-I配体或聚 合配体。在本发明另一个实施方式中，所述配体或聚合配体与本文所述PAI-I配体或聚合 配体至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同。在本发明另一个实施方式中，所述配体或聚合配体是本文所述的PAI-I配体或聚 合配体，所述配体或聚合配体已经过修饰而包含一个或多个氨基酸缺失、取代、插入、截短， 或它们的组合。本发明另一个实施方式是与SEQ ID NO :1_30中奇数编号序列所示多肽至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同的多月太。本发明另一个实施方式是与SEQ ID NO :1_30中偶数编号序列所示多核苷酸至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%^； 99%相同的多核苷酸。在本发明另一个实施方式中，所述PAI-I配体或聚合配体包含至少一个与SEQ ID NO 37-51 之一至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 相同的肽。在本发明另一个实施方式中，所述PAI-I配体或聚合配体具有以下抑制机制潜 伏状态、将PAl转变成底物、空间位阻tPA结合、空间位阻内源玻连蛋白的、或直接竞争结合 位点的至少一种。本发明另一个实施方式是编码本文所述PAI-I配体或聚合配体的多核苷酸。本发明的聚合配体在诸单体之前、之后或之间任选包含间隔氨基酸(示例性的体 系结构见图1D-1F和图2F-2J)。
本发明意图包括同质聚合配体和异质聚合配体的所有组合，而不仅限于上下文给 出的例子。在本说明书中，术语“配体”包括单体配体、聚合配体、同质聚合配体和/或异质 聚合配体。术语配体还包括诱骗剂、抑制剂和调节剂。单体配体是一种多肽，所述多肽的至少一部分能够被PAI-I识别。所述多肽能够 被识别的这部分称为识别基序。在本发明中，识别基序可以是天然的或合成的基序。识别 基序的例子是本领域熟知的，包括但不限于天然产生的PAI-I底物、假底物基序以及PAI-I 调节结合蛋白中存在的相互作用结构域及其修饰形式。通常通过鉴定和分离假定的PAI-I相互作用结构域识别基序来构建基于天然 PAI-I相互作用伴侣的配体单体。示例性的天然PAI-I相互作用伴侣是本领域已知的，包 括纤维蛋白、组织纤溶酶原激活剂(SEQ ID NO :34表示的蛋白质)、尿激酶纤溶酶原激活剂 (SEQ ID NO :36表示的蛋白质)和玻连蛋白(SEQ IDNO :32表示的蛋白质)。其他单体包 括PAI-I识别基序以及邻近和毗连PAI-I相互作用结构域识别基序二侧的氨基酸。因此， 单体配体可以是任何长度，只要该单体包括PAI-I识别基序即可。例如，单体可包括PAI-I 识别基序和至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、四、30或100个或更多个邻近该识别基序的氨基酸。其他设计灵感来自配体 的三维模型以及与PAI-I结合相互作用的型模。根据这种模型，可能需要对配体或聚合配 体的一级序列进行修饰。例如，在一个实施方式中，本发明包括的PAI-I抑制剂含有选自以下肽的至少一 个拷贝a)与包含SEQ ID NO 31的氨基酸残基354-368相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；b)与包含SEQ ID NO 31的氨基酸残基300-309相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；c)与包含SEQ ID NO 31的氨基酸残基343-353相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；d)与包含SEQ ID NO 32的氨基酸残基20_63相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；e)与包含SEQ ID NO 32的氨基酸残基20_63相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO 32的氨基酸残基32相对应的氨基酸残基从苯丙氨酸突变为亮氨酸；f)与包含SEQ ID NO 32的氨基酸残基20_63相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO 32的氨基酸残基四相对应氨基酸残基从苏氨酸突变为丙氨酸；g)与包含SEQ ID NO 32的氨基酸残基20_63相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO 32的氨基酸残基42相对应的氨基酸残基从谷氨酸突变为丙氨酸；h)与包含SEQ ID NO 32的氨基酸残基20_63相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO 32的氨基酸残基43相对应的氨基酸残基从亮氨酸突变为丙氨酸；
i)与包含SEQ ID NO 32的氨基酸残基20_63相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO :32的氨基酸残基23相对应的氨基酸残基从丝氨酸突变为苯丙氨酸，与SEQ ID NO 32的氨基酸残基52相对应的氨基酸残基从苏氨酸突变为谷氨酸，与SEQ ID NO 32的氨基 酸残基56相对应的氨基酸残基从丙氨酸突变为酪氨酸，与SEQ ID NO :32的氨基酸残基57 相对应的氨基酸残基从谷氨酸突变为酪氨酸；j)与包含SEQ ID NO 33的氨基酸残基25_256相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；k)与包含SEQ ID NO 33的氨基酸残基25_44相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；1)与包含SEQ ID NO 33的氨基酸残基47_256相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；m)与包含SEQ ID NO :34的氨基酸残基301-308相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；η)与包含SEQ ID NO 35的氨基酸残基四_121相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO 35的氨基酸残基55相对应的氨基酸残基从缬氨酸突变为丙氨酸，与SEQ ID NO 35 的氨基酸残基57相对应的氨基酸残基从天冬氨酸突变为酪氨酸，与SEQ ID Ν0:35的氨基 酸残基59相对应的氨基酸残基从苏氨酸突变为天冬酰胺，与SEQ ID Ν0:35的氨基酸残基 79相对应的氨基酸残基从丝氨酸突变为赖氨酸，与SEQ ID NO :35的氨基酸残基81相对应 的氨基酸残基从天冬氨酸突变为赖氨酸，与SEQ ID NO :35的氨基酸残基83相对应的氨基 酸残基从甘氨酸突变为谷氨酸；和ο)与包含SEQ ID NO :36的氨基酸残基179-415相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO :36的氨基酸残基2Μ相对应的氨基酸残基从组氨酸突变为丙氨酸，与SEQ ID NO 36 的氨基酸残基275相对应的氨基酸残基从天冬氨酸突变为丙氨酸，与SEQ ID Ν0:36的氨基 酸残基376相对应的氨基酸残基从丝氨酸突变为丙氨酸。文中，术语“相对应于”和“与...相对应”在涉及序列比对时，意指参比蛋白质 (如纤溶酶原激活剂的抑制剂1，ΑΑΑ60009, SEQ ID NO 31)中所列举的位置以及与参比蛋 白位置比对的那些位置。因此，当将目的肽的氨基酸序列与参比肽(如SEQ ID NO 31)的 氨基酸序列进行排列对比时，目的肽序列中“相对应于”参比肽序列某些列举位置的氨基酸 就是与参比肽序列这些位置进行对比的氨基酸，但不必须在参比序列的这些准确编号位置 内。排列对比序列以确定序列之间相对应氨基酸的方法在下文中描述。在其他实施方式中，配体可以是单克隆抗体片段、噬菌体展示产物、PAI-I合成抑 制剂、或转录因子诱骗剂。单体配体是一种多肽，所述多肽的至少一部分能够被PAI-I识别。所述多肽能够 被识别的这部分称为识别基序。在本发明中，识别基序可以是天然的或合成的基序。识别 基序的例子是本领域熟知的，包括但不限于天然产生的PAI-I底物、假底物基序以及PAI-I 调节结合蛋白中存在的相互作用结构域及其修饰形式。
聚合型配体(聚合配体)包含两个或多个单体配体。同质聚合配体是一种聚合配体，其组成的各个单体配体的氨基酸序列都相同，除 了一个或多个单体配体中的可去磷酸化的残基如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸可被取代或修饰 外。修饰包括但不限于取代伪磷酸化的残基(酸性氨基酸)或取代天然残基。异质聚合配体是一种聚合配体，其组成的一些单体配体的氨基酸序列不相同。本发明的配体任选连接于能提供表位标签、报道分子和/或细胞定位信号的额其 它分子或氨基酸。细胞定位信号可使配体靶向细胞的某个区域。表位标签和/或报道分子 和/或定位信号可以是相同的分子。表位标签和/或报道分子和/或定位信号也可以是不 同分子。本发明还包括包含配体、同质聚合配体和异质聚合配体编码核苷酸序列的多核苷 酸。本发明的核酸任选连接于编码具有其他特征，如表位标签、报道分子和/或细胞定位信 号多肽的其它核苷酸序列。所述多核苷酸任选侧接包含限制性核酸内切酶位点和限制性核 酸内切酶活性所需其他核苷酸的的核苷酸序列。所述侧翼序列任选在载体内提供独特的克 隆位点并任选提供亚序列克隆取向。此外，可任选将本发明的核酸掺入载体多核苷酸中。本 发明的配体、聚合配体和多核苷酸可用作检索工具和/或治疗。本发明的其他实施方式包括基于假定或真实PAI-I相互作用伴侣的单体(如上所 述)。此外，如果底物或结合蛋白含有一个以上的识别基序，则可将其鉴定为一个以上的单 体。本发明另一个实施方式是包含编码配体肽至少一个拷贝的多核苷酸序列的核酸 分子。本发明另一个实施方式是核酸分子，其中的多核苷酸序列编码一个或多个肽配体 的一个或多个拷贝。本发明另一个实施方式是核酸分子，其中的多核苷酸序列编码至少2、3、4、5、6、7、 8、9或10个肽拷贝。本发明另一个实施方式是包含编码配体或聚合配体至少一个拷贝的核酸分子的 载体。本发明另一个实施方式是包含载体的重组宿主细胞，所述载体包含编码配体或聚 合配体至少一个拷贝的核酸分子。本发明另一个实施方式是一种抑制宿主细胞PAI-I的方法，包括将包含编码配体 或聚合配体至少一个拷贝的核酸分子的载体转染入宿主细胞，并在适合产生配体或聚合配 体至少一个拷贝的条件下培养该转染的宿主细胞。本发明另一方面是一种抑制对象心脏组织PAI-I的方法，包括将包含编码PAI-I 配体或聚合配体至少一个拷贝的核酸分子的载体注射入对象的心脏组织中。本发明另一方面是一种产生PAI-I活性降低转基因对象的方法，包括将包含编码 PAI-I配体或聚合配体至少一个拷贝的核酸分子的载体注射入受精卵或胚胎干细胞中。本发明还涉及与参比抑制剂至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同的修饰的抑制剂。“修饰的抑制剂”用于指可通过添加、删 除或取代蛋白或多肽抑制剂一级结构(氨基酸序列)中的一个或多个氨基酸而产生的肽。 “修饰的识别基序”是通过添加、删除或取代该基序一级结构(氨基酸序列)中的一个或多个氨基酸而经过修饰的天然形成的PAI-I识别基序。术语“蛋白质”和“多肽”和“肽”在本 文中可互换使用。参比抑制剂不必是野生型蛋白或其一部分。因此，参比抑制剂可以是之 前已对其序列进行修饰而不同于野生型蛋白的蛋白质或肽。参比抑制剂可以是或不是特定 生物的野生型蛋白质。某多肽的氨基酸序列与参比氨基酸序列至少，例如约95% “相同”应理解为该多 肽的氨基酸序列与参比序列相同，除了编码参比肽的参比氨基酸序列的每100个氨基酸中 可包括至多约5个修饰外。换句话说，为获得氨基酸序列与参比氨基酸序列至少约95%相 同的肽，至多约5%的参比序列氨基酸残基可缺失或被其他氨基酸取代，或者可在参比序列 中插入占参比序列总氨基酸数至多约5%的氨基酸。对参比序列的这些修饰可发生在参比 氨基酸序列的N-末端或C-末端位置，或者那些末端位置之间的任何位置，可各自分散在参 比序列的氨基酸中，或者以一个或多个毗连基团分散在参比序列中。本文所用“相同性”表示核苷酸序列或氨基酸序列与参比核苷酸或氨基酸序列 的相同性。通常，排列序列以获得最高级别的匹配。“相同性”本身具有本领域已知的含 义，可采用公开的技术来计算。(参见，例如，Computational Molecular Biology(计算分 子生物学)，Lesk, A.M.编，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约(1988)； Biocomputing Informatics and Genome Projects (生物计算信息禾口基因组项目)， Smith, D. W.编，学术出版社(Academic Press),纽约(1993) ；Computer Analysis of Sequence Data(序列数据的计算机分析)，第I部分，Griffin, Α. Μ.和Griffin, H. G.编， 休玛効β 出版社(Humana Press),新泽西州(1994) ；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物学的序列分析)，von Heinje, G.编，学术出版社(1987) JPkquence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov，Μ.和Devereux，J.编，斯托克顿出版社， 纽约(1991))。尽管现已有几种方法可测量两个多核苷酸或多肽序列之间的相同性，但 术语“相同性”是本领域熟练技术人员熟知的(Carillo, H. &Lipton, D.，Siam J Applied Math 48 :1073(1988))。通常用来确定两个序列之间相同性或类似性的方法包括但不限 于，Martin J. Bishop编的Guide to Huge Computers (巨型计算机指南)，学术出版社，圣 地亚哥(1994)以及 Carillo，H.和 Lipton, D.，Siam J Applied Math 48 :1073(1988)中 披露的方法。计算机程序也可包含计算相同性和类似性的方法和算法。确定两个序列之 间相同性和类似性的计算机程序方法的例子包括但不限于，GCG程序包(Devereux，J.等， Nucleic Acids Researchl2 (i) :387(1984)), BLASTP，ExPASy, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F.等，J Molec Biol 215 :403(1990))和FASTDB。测定相同性和类似性方法的例子讨论 见 Michaels, G.禾口 Garian, R. , Current Protocols in Protein Science (蛋白质禾斗学实验 指南)，第一卷，约翰威利父子公司(John Wiley &S ons, he.) (2000)，该书纳入本文作为 参考。在本发明一个实施方式中，用于测定两个或多个多肽之间相同性的算法是BLASTP。在本发明另一个实施方式中，用于测定两个或多个多肽之间相同性的算法是 FASTDB,该方法基于 Brutlag 等的算法(Comp. App. Biosci. 6 :237-245 (1990)，纳入本文作 为参考)。在FASTDB序列对比中，查询和对象序列是氨基酸序列。序列比对结果为相同性 百分比。可用于氨基酸序列FASTDB比对计算相同性百分比的参数包括但不限于矩阵= PAM，k-元组=2，错配罚分=1，连接罚分=20，随机组长度=0，截断值=1，缺口罚分=5， 缺口大小罚分0. 05，窗口大小=500或对象氨基酸序列的长度，取较短的值。
如果对象序列比查询序列长或短是因为N-末端或C-末端添加或缺失而不是因为 内部添加或缺失，则可进行手工纠正，因为当计算相同性百分比时FSTDB程序不考虑对象 序列N-末端和C-末端的截短或添加。对于相对于查询序列两端都截短的对象序列，可计 算与参比序列不匹配/对齐的查询序列N-和C-末端的碱基数占查询序列碱基总数的百分 比，而纠正相同性百分比。FASTDB序列比对的结果决定了匹配/对齐。然后从上述FASTDB 程序用特定参数计算出的相同性百分比减去对齐百分比可得到最终的相同性百分比评分。 可用这种纠正评分来确定对齐部分是如何相互“对应”的，以及确定相同性百分比。可分别 考虑查询(对象)序列或参比序列中延伸超过参比或对象序列N-或C-末端的残基以便手 工校正相同性百分比评分。也就是说，当手工校正相同性百分比评分或对齐数目时可计算 出与对比序列N-或C-末端不匹配/对齐的残基数目。例如，可将90个氨基酸残基的对象序列与100个残基的参比序列排列对比以确 定相同性百分比。因此，当对象序列的N-末端发生缺失时，FASTDB比对不会显示N-末端 前10个残基的匹配/对齐程度。这10个不相配的残基占序列的10% (N-和C-末端不匹 配的残基数/查询序列的残基总数)，因此要将FASTDB程序算出的相同性百分比评分减去 10%。如果其余90个残基完美匹配，则最终的相同性百分比为90%。在另一个例子中，将 90个残基的对象序列与100个残基的参比序列进行比较。此时的缺失是内部缺失，因此对 象序列的N-或C-末端没有与查询序列不匹配/对齐的残基。此时无需手工纠正FASTDB 算出的相同性百分比。本发明的聚合配体可在诸单体之前、之后或之间任选包含间隔氨基酸。间隔物的 长度和组成可不同。间隔物的一个例子是谷氨酸、丙氨酸、多聚谷氨酸或多聚丙氨酸。有时 考虑采用脯氨酸作为间隔物以打断多肽的二级结构。间隔氨基酸可以是任何氨基酸，不限 于丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸。间隔物的例子提供于SEQ ID N0:53-56。本发明涉及含有或 没有间隔物的同质聚合配体和异质聚合配体的所有组合，而不仅限于上下文给出的例子。本发明的配体和聚合配体可任选连接于将配体定位于细胞某区域的信号。细胞定 位信号的非限制性例子有定位于肌质网、内质网、胞外基质、线粒体、高尔基体、过氧化物酶 体、溶酶体、核、核仁、核内体、外体、其他胞内囊泡、胞质膜、顶膜和基底外侧膜的信号。在一 个实施方式中，所述配体和聚合配体通过如美国临时申请60/957，328中所述的那些非细 胞特异性胞质膜定位信号递送到细胞外表面。在其他实施方式中，所述配体和聚合配体通 过细胞特异性定位信号，例如成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞和心肌细胞肌 膜的特异性定位信号递送到细胞外表面。在其他实施方式中，所述配体和聚合配体通过胞 外相关结构域，如胶原结合蛋白，或心肌梗塞区中富含的其他胞外组分递送到胞外基质。图 3A-3H、5A-5I、11A-1 II和22A-22F显示了连接于定位信号的配体和聚合配体的示例性体系 结构。给出的定位信号仅是举例而不是限制。本发明一个实施方式是连接于1类定位束缚子的配体或聚合配体。本发明另一个实施方式是连接于2类定位束缚子的配体或聚合配体。本发明另一个实施方式是连接于3类定位束缚子的配体或聚合配体。本发明另一个实施方式是本文所述的1类定位束缚子。本发明另一个实施方式是与本文所述1类定位束缚子至少60^^65^^70%, 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的 1 类定位束缚子。
本发明另一个实施方式是已经过修饰的包含一个或多个氨基酸缺失、取代、插入、 截短，或它们的组合的本文所述1类定位束缚子。本发明另一个实施方式是与SEQ ID NO 57-76 至少 60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的1类定位束缚子。本发明另一个实施方式是包含至少一个与SEQ ID NO :77_95之一至少60 %、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同肽的 1 类定位束缚子。本发明另一个实施方式是编码本文所述1类定位束缚子的多核苷酸。本发明另一个实施方式是本文所述的2类定位束缚子。本发明另一个实施方式是编码本文所述2类定位束缚子的多核苷酸。本发明另一个实施方式是本文所述的3类定位束缚子。本发明另一个实施方式是与本文所述3类定位束缚子至少60^^65^^70%, 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的 3 类定位束缚子。本发明另一个实施方式是已经过修饰包含一个或多个氨基酸缺失、取代、插入、截 短，或它们的组合的本文所述3类定位束缚子。本发明另一个实施方式是与SEQ ID NO 100-111至少60 %、65 %、70 %、75 %、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的 3 类定位束缚子。本发明另一个实施方式是包含至少一个与SEQ ID NO :112-1 之一至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同肽的 3 类定位束缚子。本发明另一个实施方式是编码本文所述3类定位束缚子的多核苷酸。本发明的配体和聚合配体也可连接于降解决定子以限制它们的活性。图21A-21H 和22A-22F显示了连接于降解决定子的配体和聚合配体的几种非限制性例子。此外，本发明的配体和聚合配体任选连接于可提供表位标签或报道分子的其它分 子或氨基酸(见图4A-4G)。表位标签的非限制性例子是FLAGTM、HA(血凝素)、c-Myc和 His6。报道分子的非限制性例子是碱性磷酸酶、半乳糖苷酶、过氧化物酶、萤光素酶和荧光 蛋白。给出的表位和报道分子仅是举例而不是限制。表位标签和/或报道分子可以是相同 分子。表位标签和/或报道分子也可以是不同分子。可采用本领域已知技术通过化学方法或重组方法合成配体和聚合配体以及与其 连接的任选氨基酸。化学合成技术包括但不限于通常用自动化肽合成仪进行的肽合成。也 可用本领域已知的非自动化肽合成方法来合成肽。重组技术包括将配体编码核酸插入表达 载体，其中用细胞因子和加工合成核酸表达产物。细胞定位信号、表位标签或降解决定子与配体或聚合配体的连接可包括与配体共 价连接或可酶解连接。当定位信号包括多肽之外的材料如脂质或碳水化合物时，可采用化 学反应来连接分子。此外，也可用非标准氨基酸以及用脂质、碳水化合物、磷酸或其他分子 修饰的氨基酸作为肽合成的前体。本发明的配体含有或没有定位信号时都有治疗作用。然 而，连接有定位信号的配体可用作亚细胞工具或治疗剂。图6A-6E、13A-13E和23A-23G显示了含PAI-1配体的基因构建物的例子。如本文 所述，含PAI-I配体的基因构建物可通过病毒或非病毒载体递送。图7B和7C描绘了用于递送和调控多肽体内表达的基因治疗载体的实施方式。图7B和7C中的连接于基因构建物 的多核苷酸序列包含基因组整合结构域有利于转基因整合入病毒基因组和/或宿主基因 组中。AttP和AttB序列是基因组整合序列的非限制性例子。图7A显示了含PAI-I配体基因构建物的载体，其中所述配体基因构建物可作为一 个单位从载体释放以产生转基因动物。例如，通过限制性核酸内切酶消化使载体骨架释放 所述配体基因构建物或转基因，。然后将释放的转基因注射到受精小鼠卵的原核中；或用该 转基因来转化胚胎干细胞。图7A所示的含配体基因构建物的载体也可用于瞬时转染转基 因，其中所述转基因的启动子和密码子已按照宿主生物进行了优化。图7A的含配体基因构 建物的载体也可用于在适应了小规模或大规模制造的可发酵生物中重组表达多肽，其中所 述转基因的启动子和密码子已按照发酵宿主生物进行了优化。图7D显示了用于产生稳定细胞系的含PAI-I配体基因构建物的载体。本发明还包括包含编码配体和聚合配体核苷酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷 酸任选连接于编码降解决定子、定位信号或报道分子的其它核苷酸序列。此外，可任选将本 发明的核酸掺入载体多核苷酸中。所述多核苷酸任选侧接包含限制性核酸内切酶位点和限 制性核酸内切酶活性所需其他核苷酸的的核苷酸序列。侧翼序列任选在载体内提供克隆位 点。限制性位点可包括但不限于大多数市售克隆载体中的任何一个常用位点。为此目的也 可使用被包括归巢内切核酸酶在内的其他限制性酶切割的位点。多核苷酸侧翼序列还任选 可为亚序列克隆提供取向。优选5’和3’的限制性内切核酸酶位点彼此不同，从而可使双 链DNA定向克隆入克隆载体中相应的互补位点。也可采用重组技术合成含有或没有降解决定子、定位信号、表位或报道分子的配 体和聚合配体。制备包含所需组分的多核苷酸表达构建物将其插入表达载体中。然后将表 达载体转染入细胞并表达和分离多肽产物。通过重组DNA技术制得的配体可用作研究工具 和/或治疗剂。下面是如何制造编码配体和聚合配体的多核苷酸的一个例子。合成编码配体和侧 翼序列的互补寡核苷酸并退火。用本领域已知技术将所得双链DNA分子插入克隆载体中。 当配体和聚合配体框内被置于邻近翻译成蛋白质产物的转基因构建物序列时，它们在细胞 或转基因动物内表达形成融合蛋白的一部分。本发明另一个实施方式涉及选择性调控PAI-I配体或聚合配体在所需细胞、组织 或生理状态中表达的基因构建物。示例性的基因构建物体系结构见图6A-6E。所述基因 构建物的启动子部分可以是组成型启动子、非组成型启动子、组织特异性启动子(组成型 或非组成型)或可诱导启动子。可用于本发明的组织特异性启动子的非限制性例子是内 皮细胞特异性启动子(White, SJ等，Gene Ther. 2007/11/8 [在公布前电子公开])，血管 平滑肌细胞特异性启动子(Ribault，S，Circ Res.，2001，88 (5) :468-75 ；Appleby, CE 等， Gene Ther. 2003,10(18) 1616-22)，心肌细胞特异性启动子(Xu，L等，J Biol Chem. ,2006, 281(45) :34430-40)，冠脉脂肪细胞特异性启动子，以及心脏成纤维细胞特异性启动子。由 于组合的组织和状态特异性启动子如心脏和缺氧特异性启动子(Su，H等，Proc Natl. Acad. Sci.U. S. Α. ,2004,101(46) :16280-5)能够在心肌梗塞区表达配体或聚合配体，因此尤其 适用于本发明。可用药物或其他因子激活可诱导启动子。RHE0SWITCH是一种从马萨诸塞州 伊普斯威奇市新英格兰生物实验室(New England BioLabs, Ipswich, ΜΑ)购得的可诱导启动子系统，可用于本发明。本发明一个实施方式包括表达受可诱导启动子系统控制的配体 或聚合配体基因构建物。本发明一个实施方式是编码连接于组织特异性启动子的配体或聚合配体的多核 苷酸。本发明另一个实施方式是编码连接于动脉平滑肌特异性启动子的配体或聚合配 体的多核苷酸。本发明另一个实施方式是编码连接于血管平滑肌细胞特异性启动子的配体或聚 合配体的多核苷酸。本发明另一个实施方式是编码连接于内皮细胞特异性启动子的配体或聚合配体 的多核苷酸。本发明另一个实施方式是编码连接于合成的内皮细胞特异性启动子的配体或聚 合配体的多核苷酸。本发明另一个实施方式是编码本文所述组织特异性启动子的多核苷酸。本发明另一个实施方式是已经过修饰的包含一个或多个核苷酸缺失、取代、插入、 截短，或它们组合的编码本文所述组织特异性启动子的多核苷酸。本发明另一个实施方式是编码与本文所述组织特异性启动子至少60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的组织特异性启动子的多
核苷酸。本发明另一个实施方式是与SEQ ID NO :132-139所示多核苷酸至少60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的多核苷酸。聚合配体的性质是模块。本发明一个方面是所述聚合配体的组合模块。本发明另 一个方面是制造这些模块聚合配体的简单易行方法。就这点而言，本发明的一个实施方式 包括模块克隆基因表达组分的方法。当重组合成配体、同质聚合配体、异质聚合配体和任选 的氨基酸表达组分时，可考虑将每个可克隆的元件作为模块。为快速方便地克隆，需要制备 粘性末端相容易于依次插入和克隆的模块元件。这可通过利用限制性内切酶位点识别和切 割的天然特性而实现。本发明一个方面包括模块侧翼序列，位于模块一端的侧翼序列可用 于限制性酶消化一次，而位于另一端的侧翼序列需要时可用于限制性酶多次消化。换句话 说，可利用并破坏位于模块一端的限制性位点以便顺序克隆模块元件。侧接编码区模块的 限制性位点的一个例子是限制性酶NgoM IV和Cla I;或XmaI和Cla I所识别的序列。用 NgoM IV和Cla I切割第一环状DNA产生含有5 ‘ NgoM IV突出端和3' Cla I突出端的 线性DNA ；用Xma I和Cla I切割第二环状DNA产生含有5' Cla I突出端和3' Xma I突 出端的线性DNA，从而得到含有相容粘性末端的第一和第二 DNA片段。当将这些第一和第 二 DNA片段混合在一起、退火并连接形成第三环状DNA片段时，第一 DNA中的NgoM IV位点 和第二 DNA中的Xma I位点在第三环状DNA中被破坏。此时DNA的该残留区受到保护不会 被Xma I或NgoM IV消化，但第三环状DNA保留的侧翼序列仍含有完整的5' NgoM IV和 3' Cla I位点。可重复该过程多次以实现定向的顺序模块克隆。内切核酸酶NgoM IV、Xma I和Cla I所识别的限制性位点是一组用作侧翼序列时可顺序克隆的位点。除了环状DNA，另一种直接依次装配编码区模块的方法是采用线性DNA。例如，与 上述顺序克隆过程相似，编码区模块侧接的限制性位点是限制性酶NgoM IV和Cla I ；或Xma I和Cla I所识别的序列。用NgoM IV和Cla I切割第一环状DNA产生含有5' NgoM IV突出端和3' Cla I突出端的线性DNA。通过PCR扩增或者合成并退火互补寡核苷酸产 生第二线性双链DNA。此第二线性DNA含有5' Cla I突出端和3' Xma I突出端，是与线 性化第一 DNA相容的粘性末端。当将这些第一和第二 DNA片段混合在一起、退火并连接形 成第三环状DNA片段时，第一 DNA中的NgoM IV位点和第二 DNA中的Xma I位点在第三环 状DNA中被破坏。第三环状DNA内保留的侧接序列仍含有完整的5' NgoM IV和3' Cla I 位点。可重复多次该过程以实现定向的顺序模块克隆。内切核酸酶NgoM IV、Xma I和Cla I所识别的限制性位点是一组用作侧接序列时可顺序克隆的位点。该过程的描述见图8。本领域普通技术人员明白，可如上所述顺序直接克隆其他限制性位点。选择限制 性内切核酸酶的优选标准是选择一对可产生相容粘性末端但其位点在相互连接后被破坏 的内切核酸酶。选择第三内切核酸酶位点的另一个标准是不会产生与前两个位点之一相容 的粘性末端。当将该标准用于顺序直接克隆体系时，可按照需要将配体、聚合配体以及其他 编码区或或表达组分组合装配在一起。同样的顺序过程可用于表位、报道分子、降解决定子 和/或定位信号。描述了聚合配体以及调节PAI-I活性聚合配体的制备方法。疗法包括将含有或没 有定位信号的纯化的配体或聚合配体递送给细胞。或者，可通过病毒或逆转录病毒构建物， 如采用腺病毒、慢病毒、腺伴随病毒的构建物或能在细胞内表达蛋白质产物的其他病毒或 逆转录病毒构建物，来递送含有或没有定位信号的配体和聚合配体。所述PAI-I配体或聚合配体、编码PAI-I配体和聚合配体的核酸、以及含有编码 PAI-I配体和聚合配体核酸的载体可用于治疗患纤维变性疾病的对象或者有发生纤维化风 险的对象。所述对象可以是患天然发生的纤维变性疾病或手术诱导的、化学诱导的、遗传诱 导的或其他实验因素诱导的纤维变性疾病的动物。纤维变性疾病的原因可以是糖尿病或因 化学接触、饮食原因、遗传原因、肥胖或自然成熟诱导的高血糖症。纤维变性疾病的原因也 可能是高血压、缺血、坏死、免疫介导的损伤、接触烟草烟雾、接触化学物质、接触纤维、病毒 或细菌感染，或者特发原因。所述PAI-I配体或聚合配体、编码PAI-I配体和聚合配体的核 酸、以及含有编码PAI-I配体和聚合配体核酸的载体可用于治疗心脏、血液、肾脏、肝脏、肺 和卵巢的纤维化和其他PAI-I相关疾病。所述PAI-I配体或聚合配体、编码PAI-I配体和 聚合配体的核酸、以及含有编码PAI-I配体和聚合配体核酸的载体可用于治疗表达PAI-I 的各种癌症。。本发明另一个实施方式是将编码配体或聚合配体的多核苷酸转移到本文所述心 血管组织内的方法。本发明另一个实施方式是将编码配体或聚合配体的多核苷酸转移到心血管组织 内的方法，包括以下之一局部注射腺病毒、离体转导单核细胞、或直接注射入主动脉。本发明另一个实施方式是评价PAI-I在本文所述不稳定斑块形成中的功能的方法。本发明另一个实施方式是评价PAI-I在不稳定斑块形成中的功能的方法，包括建 立胰岛素抗性小鼠模型的步骤。本发明另一个实施方式是实现空间或时序调控本文所述的配体或聚合配体的方法。
本发明另一个实施方式是实现空间调控配体或聚合配体的方法，包括将所述配体 或聚合配体连接于组织特异性启动子的步骤。本发明另一个实施方式是实现空间调控配体或聚合配体的方法，包括将所述配体 或聚合配体连接于定位束缚子的步骤。本发明另一个实施方式是实现时序调控配体或聚合配体的方法，包括将所述配体 或聚合配体连接于可诱导基因开关的步骤。本发明另一个实施方式是治疗、预防或缓解心血管疾病的方法，包括以下步骤a)鉴定患有心血管疾病或有发生心血管疾病风险的对象；和b)给予该对象PAI-I配体或聚合配体。本发明另一个实施方式是治疗、预防或缓解纤维变性疾病的方法，包括以下步 骤a)鉴定患有纤维变性疾病或有发生纤维变性疾病风险的对象；和b)给予该对象PAI-I配体或聚合配体。可将纯化的PAI-I配体制成供口服或肠胃外给药、局部给药、或片剂、胶囊或液体 形式、鼻内或吸入气溶胶、皮下给药、肌肉内给药、腹膜内给药、或其他注射方式，静脉内输 液；或任何其他给药途径。此外，可将编码该配体的核苷酸序列掺入设计用来递送和在细胞 内表达基因产物的载体中。这种载体包括质粒、粘粒、人造染色体和修饰的病毒。可体内或 离体递送给真核细胞。离体递送方法包括分离预定为受者的细胞或供者细胞并将载体递送 给那些细胞内，然后用该细胞治疗受者。本发明另一方面是治疗或预防动脉粥样硬化的方法，包括a)鉴定患有血管损伤或有血管损伤风险的对象；b)分离所述对象的单核细胞；c)将至少一个与启动子相连的编码纤维溶解途径多肽调节剂的多核苷酸引入所 述单核细胞从而产生修饰的细胞；和d)将所述修饰的细胞引入所述对象。333本发明另一个实施方式涉及制备向对象递送纤维溶解途径多肽调节剂的修饰 细胞的方法，包括在所述对象的单核细胞内引入至少一个与启动子相连的编码纤维溶解途 径多肽调节剂的多核苷酸以产生修饰的细胞。在本发明一个实施方式中，所述启动子是可诱导启动子。在本发明另一个实施方 式中，所述启动子是巨噬细胞特异性启动子。在本发明另一个实施方式中，所述启动子是泡 沫细胞特异性启动子。与治疗动脉粥样硬化的现有局部递送方法，如用导管递送涂布药物的支架或气囊 血管成形术介导的通过病毒向内皮和/或血管平滑肌细胞递送相比，本发明具有一些优 势。除了与器械介导递送方法相关的困难外，血管细胞的类型是难以转导且转基因表达差 的细胞，这使得向这些细胞局部递送转基因困难得难以置信。因此这些方法的效率大打折 扣。本发明采用了一种循环细胞类型，单核细胞，该细胞会回巢于血管损伤区域，因此不需 要使用器械介导的局部递送蛋白质治疗剂。在血管损伤部位单核细胞分化为巨噬细胞。巨 噬细胞一旦出现在动脉粥样化局部环境中将进一步分化为泡沫细胞。巨噬细胞对动脉粥样硬化发展的大多数阶段都有作用。因此它们是递送转基因、表达纤维溶解途径调节剂、定位于粥样硬化损伤的一种有用细胞类型。这些损伤可发生在 所有脉管系统内。已显示纤维溶解途径在动脉粥样硬化发生和发展中有关键作用，此外在 止血中也有关键作用。因此，本发明考虑该途径的时空调控调节剂，以防止不良反应，如全 身给药可能造成的潜在失控性出血。在本发明一个实施方式中，时空调控通过采用可诱导 基因开关而实现。例如，本发明另一方面是治疗或预防动脉粥样硬化的方法，包括a)鉴定患有血管损伤或有血管损伤风险的对象；b)分离所述对象的单核细胞；c)将以下多核苷酸引入所述细胞以产生修饰的细胞(1)编码基因开关的多核苷 酸，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码化学 配体依赖性转录因子，和( 至少一个与启动子相连的编码纤维溶解途径多肽调节剂的多 核苷酸，所述启动子可用所述化学配体依赖性转录因子活化；d)将所述修饰的细胞引入所述对象；和e)将所述化学配体引入对象以激活启动子。本发明另一个实施方式涉及一种制备向对象递送纤维溶解途径多肽调节剂的修 饰细胞的方法，包括将以下多核苷酸引入所述细胞的多核苷酸以产生修饰的细胞(a)编 码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个转录因子序列，其中所述至少一个转 录因子序列编码化学配体依赖性转录因子，和(b)至少一个与启动子相连的编码纤维溶解 途径多肽调节剂的多核苷酸，所述启动子可用所述化学配体依赖性转录因子活化。在一个实施方式中，所述纤维溶解途径调节剂是本文所述的PAI-I配体或聚合配 体。然而，所述治疗或预防动脉粥样硬化的方法不限于本文所述的PAI-I配体或聚合配体， 还包括采用纤维溶解途径的任何多肽调节剂。例如，可用于本发明方法的纤维溶解途径调 节剂可包括其他多肽PAI-I抑制剂；天然纤溶酶原激活剂如美国专利5，830，849中描述的 那些；突变纤溶酶原激活剂如美国专利5，866，413中描述的那些；或纤溶酶原激活剂片段 如美国专利5，039，791中描述的那些。本发明还考虑采用巨噬细胞特异性调控元件来控制可诱导基因开关以限制转基 因只在巨噬细胞内表达。此时可实现对转基因表达的空间和时序调控，从而使表达仅限 于巨噬细胞和/或动脉粥样化内巨噬细胞衍生的细胞。巨噬细胞特异性调控元件可用 于可诱导基因开关系统，以加入化学物质调节特定细胞类型内纤维溶解途径调节剂的表 达。在离体情况下将基因表达程序转导入巨噬细胞的前体细胞，如单核细胞，再引入体内 以治疗动脉粥样硬化。用于本发明的巨噬细胞特异性调控元件的例子有，Gough，P.J.和 Ε. W. Raines, Blood 101(2) =485-91(2003)所述的巨噬细胞限制性CD68基因的调控元件。例如，本发明另一方面是治疗或预防动脉粥样硬化的方法，包括a)鉴定患有血管损伤或有血管损伤风险的对象；b)分离所述对象的单核细胞；c)将以下多核苷酸引入所述细胞产生修饰的细胞(1)编码基因开关的多核苷 酸，所述基因开关包含至少一个连接于巨噬细胞特异性调控元件的转录因子序列，其中所 述至少一个转录因子序列编码化学配体依赖性转录因子，和( 至少一个与启动子相连的 编码纤维溶解途径多肽调节剂的多核苷酸，所述启动子可用所述化学配体依赖性转录因子活化；d)将所述修饰的细胞引入所述对象；和e)将所述化学配体引入对象以激活启动子。此外，本发明另一个实施方式涉及制备向对象递送多肽配体或聚合配体的修饰细 胞的方法，包括将以下多核苷酸引入所述对象的单核细胞以产生修饰的细胞(a)编码基 因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一个连接于巨噬细胞特异性调控元件的转录因 子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码化学配体依赖性转录因子，和(b)至少一个 与启动子相连的编码纤维溶解途径多肽调节剂的多核苷酸，所述启动子可用所述化学配体 依赖性转录因子活化。在其他实施方式中，在单核细胞内弓丨入编码其他治疗蛋白如载脂蛋白的其它多核 苷酸。本发明考虑通过靶向其他巨噬细胞群来治疗其他组织内涉及纤维化的其他疾病。 例如，通过纤维溶解调节剂的特异性启动子或其他定向表达方法靶向其他固定的巨噬细 胞，如肺泡巨噬细胞，从而有可能治疗肺纤维化。属于本发明范围内的其他固定巨噬细胞以 及它们在组织内的定位包括结缔组织的组织细胞、肝脏的枯氏细胞、神经组织的小神经胶 质细胞、肉芽肿的上皮样细胞、骨骼的破骨细胞、脾窦状隙衬里细胞和肾小球系膜细胞。本 发明考虑通过靶向表达纤维溶解途径多肽调节剂来治疗任何涉及这些和其他巨噬细胞亚 型的纤维变性疾病。本发明另一个方面是治疗、预防或缓解涉及固定巨噬细胞群的纤维变性疾病的方 法，包括以下步骤a)鉴定患有纤维变性疾病的对象；b)分离所述对象的单核细胞；c)将至少一个与固定巨噬细胞群特异性调控元件相连的编码纤维溶解途径多肽 调节剂的多核苷酸引入所述单核细胞以产生修饰的细胞；和d)将所述修饰的细胞引入所述对象。本发明还考虑通过采用美国专利6，875，612描述的单核细胞特异性载体使纤维 溶解途径多肽调节剂在体内单核细胞来源的细胞内靶向表达的方法。方法结果获自证明成功调节心血管组织内纤维溶解活性的体外和体内实验的综合数 据将证明局部PAI-I抑制对患病心血管组织具有治疗功效。在II型糖尿病患者中，产生 PAI-I诱骗剂的临床意义是降低不稳定粥样硬化斑块的形成。目的目标是开发一种利用可诱导组织特异性表达PAI-I的诱骗剂的腺病毒基因 疗法，所述诱骗剂靶向患病血管的细胞外表面膜和/或胞外微环境。构成这种疗法的各组 分描述如下。各组分--PAI-1诱骗剂纤溶酶原激活剂的抑制剂-1 (PAIl)是一种参与调节纤 维蛋白溶解的丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝抑蛋白)。其目标包括组织纤溶酶原激活剂(tPA) 和尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)。PAIl在自杀性抑制剂反应中结合其靶标，在仅缓慢清除 的中间体阶段共价结合(不在复合体正常清除之前)。PAIl单独存在于溶液中的半衰期很 短，小于2小时。它自发经历构象转变形成无功能的潜伏形式。由于玻连蛋白含有其他胞外基质(ECM)蛋白的结合域，因此PAIl与玻连蛋白结合可大大增强该分子的活性寿命并使 之靶向胞外基质的特定部位。设计诱骗剂可综合多种方式抑制PAI-1，包括扣留该分子、通 过造成构象转变的肽下调和蛋白水解该分子。PAI-I诱骗剂的空间和时序调控PAI-1诱骗剂在组织和细胞水平的正确空间定 位是使PAI-I诱骗剂功效最大毒性最小所必需的。在组织水平上，可通过采用组织特异性 启动子调控PAI-I诱骗剂的表达而实现。而在细胞水平上，这将通过利用与PAI-I诱骗剂 融合的定位束缚子而实现。组织特异性启动子为使PAI-I诱骗剂的表达仅限于靶器官，已设计了组织特异 性启动子使转基因定向表达于特定的血管细胞类型，包括血管平滑肌细胞和内皮细胞。采 用I^heoSwitch技术工程改造时序调控以便用验证过的组织特异性启动子进行可诱导表 达。定位束缚子为在细胞水平进行空间调控，设计出了定位束缚子，当与PAI-I诱骗 剂融合时能将其运送到正确部位实现治疗效益。可能需要对治疗诱骗剂进行一些体内优化 以获得对粥样硬化斑块的最大治疗效果。例如，如果治疗诱骗剂的浓度梯度浅而宽，这种基 因疗法靶向的细胞可能产生最佳效果-也许扩散得远而且广泛从而甚至产生某些精细的 内分泌效果(第2类)。另一方面，也可能需要限制诱骗剂的浓度梯度使其主要存在于被转 染细胞的表面；该方法将治疗区域限制于一个小得多的范围(第1类)。第3类，此小结的 主题，试图“沿中间道路前进”，在损伤正在愈合的情况下(即蛋白水解微环境)能够旁分泌 扩散诱骗剂。范围除了成功整合这些单独组分外，开发了经过验证的诱骗剂、Ioc和启动子组 分以开发用于临床前研究的基因疗法。成功完成这些实验将证明，在代谢病模型中，通过局 部抑制PAI-I来调节纤维蛋白溶解可降低脉管系统中不稳定粥样硬化斑块的形成。临床前模型用胰岛素抗性临床前小鼠模型的动脉粥样硬化发展来评价PAI-I在 不稳定斑块形成中的作用。在小鼠中评价基因转移技术以便用于向靶组织递送基因。胰岛素抗性小鼠模型-开发小鼠模型的全面计划实验1)用FFA、甘油三酯 和胰岛素试验证实，在10周龄具有胰岛素抗性的胰岛素抗性小鼠(IRSl+/-ApoE-/-和 IRS2+/-ApoE-/")以及对照W57BL6)非胰岛素抗性小鼠和胰岛素抗性PAI-I缺陷小鼠 (IRS1 +/-ApoE-/-PAI-1 +/-and IRS2+/-ApoE-/-PAI-1 +/-)中诱导了动脉粥样硬化和心肌 梗塞；当动物达到12周龄时进行高分辨超声波心脏询问，并评价16周龄时的心脏收缩和舒 张功能；和评价10周龄时做过冠状动脉闭塞的16周龄小鼠心脏左心室的梗塞面积、纤维化 程度以及PAI-I含量和定位；幻描绘不同小鼠品系纤维化程度与按梗塞面积标准化的左心 室功能伴随病损之间的关系；3)将PAI-I缺陷动物与过表达PAI-I的胰岛素抗性动物杂交 并进行以上1和2所述相同的研究，以消除PAI-I在冠状动脉闭塞后发生心脏纤维化以及 诱导梗死形成中的潜在作用；和4)用细胞成像技术特征分析主动脉粥样硬化斑块。心血管组织的基因转移尽管已经尝试对血管组织基因转导做过多次研究，但都 没能明确适合临床基因治疗的理想载体和给药途径。全身给药将导致腺病毒被快速清除以 及肝脏附着/感染。曾经报道过对心血管组织的局部转导。虽然心肌细胞易被腺病毒转导， 但内皮细胞(EC)和血管平滑肌细胞(VSMC)则不易。VSMC对2和5血清型腺病毒介导的基 因转移极顽固。这是由于病毒进入差和转基因本身的传统遍在启动子转录无效。SMC表面的柯萨奇腺病毒受体(CAR)表达有限很好地解释了病毒进入差的原因，这导致转导水平大 大低于感染相同剂量(病毒)上皮细胞所得到的转导水平[(BeckJramoto等2004)，见参 考文献]。局部注射腺病毒推荐方法之一是通过心尖进行心室内注射，注射到左心室腔内。 该方法证明能导致转基因在主动脉内皮中表达(Jimn，Lee等2001)。虽然采用该方法未观 察到VSMC表达，但这可能是由于转基因的无效转录所致。CMV介导的转基因表达在VSMC 中无效，因此证明包含VSMC特异性启动子会导致体内表达升高(Akyurek，Yang等2000 ； Akyurek, Nallamshetty 等 2001 ；Appleby，Kingston 等 2003)。因此，采用该技术，联用强 VSMC启动子与高效价病毒可能导致VSMC表达。此外，在注射期间夹紧输出血管有可能增加 病毒与靶细胞接触。这也将导致经冠状动脉的心脏灌注(Roth，Lai等2004)概述-局部注射腺病毒该方法适合心肌细胞和内皮细胞的体内基因转移。然而， 根据文献中报道的发现，由于EC屏障和转导效率低，VSMC中不可能有强表达。单核细胞离体转导另一种推荐方法是采用离体方法。巨噬细胞在血管壁动脉粥 样硬化发展的全部阶段都有作用。募集的单核细胞粘附于血管损伤部位并分化成巨噬细 胞。此外，它们还具有很强的生物合成能力(Beck，toamoto等2004)。不难分离获得骨髓 细胞、转导和返还动物以进行离体基因递送。曾用该方法将治疗基因递送到动脉粥样硬化区域。在该方法的大多数例子中，利 用表达的ApoE来促进胆固醇的逆向转运(Hasty, Linton等1999 ；Van Eck, Heri jgers等 2000 ；Ishiguro, Yoshida 等 2001 Juan, Lee 等 2001 ；Yoshida, Hasty 等 2001 ；Gough 和 Raines 2003)。此外，单核细胞衍生的巨噬细胞在对MI的炎性反应中具有作用。因此该方 法也可用于MI模型以降低梗死区PAI-I的活性。概述-单核细胞离体转导该方法的主要缺点是，单核细胞对Ad5血清型有抗性 (Burke, Sumner等2002 ；Burke 2003)。Adllp和Ad;35血清型以及慢病毒和逆转录病毒载 体容易感染血液生成细胞类型，包括髓细胞类型如单核细胞Gegerman,Lindman等2006)。直接注射入主动脉另一种方法是直接动脉内注射入升主动脉的斑块区域。这是 一种常用于心肌基因转移的方法，然而，我们不能确保该方法用于主动脉基因转移是否可 行。综述-心血管组织的基因转移根据对已报道的各种基因转移策略的评价，通过 注射到左心室腔，钳闭肺动脉和主动脉内递送转导的单核细胞或冠状动脉内递送，都可能 提供用于多种心血管细胞类型的可行基因转移方法。实验框架诱骗剂-计划11.用！fepG2细胞体外验证PAI-1的作用a.抗原b.活性2.用VSMC体外验证PAI-I的作用a.抗原b.活性3.用VSMC迁移试验体外验证
a.人 VSMCb. /Jn VSMC定位束缚子-计划21.用VSMC体外验证a.培养液和细胞(膜)裂解液中的抗原b.通过荧光显微镜定位2.用EC体外验证a.培养液和细胞(膜)裂解液中的抗原b.通过荧光显微镜定位3.单核细胞/巨噬细胞体外验证a.培养液和细胞(膜)裂解液中的抗原b.通过荧光显微镜定位启动子-计划34.用VSMC体外验证a. VSMC和非VSMC中的报道分子活性b. VSMC和非VSMC中的可诱导报道分子活性5.用EC体外验证a. EC和非EC中的报道分子活性b. EC和非EC中的可诱导报道分子活性6.单核细胞/巨噬细胞体外验证a.单核细胞/巨噬细胞以及非单核细胞/巨噬细胞细胞类型中的报道分子活性b.单核细胞/巨噬细胞以及非单核细胞/巨噬细胞细胞类型中的可诱导报道分子 活性定位诱骗剂-计划41.被转导VSMC的体外验证(表达和定位试验)2.被转导EC的体外验证(表达和定位试验)3.用被转导VSMC迁移试验体外验证a. Avsmcb.小鼠 VSMC4.被转导单核细胞/巨噬细胞的体外验证(表达和定位试验)具有可诱导/组织特异性报道分子表达的病毒-计划51. VSMC体外验证2. EC体外验证3.单核细胞/巨噬细胞体外验证病毒基因疗法-计划61.用VSMC体外验证(表达和定位试验)2.被转导EC的体外验证(表达和定位试验)3.用被转导VSMC迁移试验体外验证a.人 VSMC
b. /Jn VSMC4.被转导单核细胞/巨噬细胞的体外验证(表达和定位试验)体外数据的编译报告-计划71.计划1-6的编译数据临床前模型-计划81.诱导有或没有PAI-I缺陷的胰岛素抗性(IR)小鼠动脉粥样硬化。2.特征分析无PAI-I小鼠、胰岛素抗性(IR)小鼠的主动脉粥样硬化斑块。3.验证基因转移模型a.离体转导单核细胞b.在阻塞或不阻塞输出血管情况下心肌内注射c.直接注射入主动脉
实施例实施例PAI-1诱骗剂和抑制策略PAI-I诱骗剂的示例性抑制机制描绘于图16。在几乎每种情况下，以下示例性诱骗剂设计包括了多种抑制机制。每种示例性诱 骗剂设计及其抑制机制的示意图见图9。图9描绘的并在以下实施例中描述的诱骗剂设计 可作为本发明的示例性实施方式。本领域普通技术人员应理解，本发明不限于本文所述的具体实施方式
，许多等价设计和抑制策略也属于本发明范围内。参见“多肽和多核苷酸序列描述”部分以了解以下示例性PAI-I诱骗剂的相对应 SEQ ID NO.。PAI-I诱骗剂1-3 天然PAIl在溶液中的半衰期很短不到2小时。它自发经历构象 转变成为非抑制性的潜伏形式。最邻近蛋白酶切割位点(R346-M347)的反应中心环(RCL) 肽在转变为潜伏形式时插入到PAIl结构存在的β片层中。基于该RCL序列的肽可阻断 PAIl蛋白酶的抑制活性。据此，PAI-I诱骗剂1-3可利用此RCL序列来抑制该分子。基于该序列的重组肽 已显示可抑制PAIl作用，其作用原理与天然RCL极其相同，但时间较短。评价各单独序列、 多个序列以及被间隔物隔开的多个序列(有可能与PAIl分子聚合)。这种序列将模拟天 然RCL肽的作用。这些DCY将几乎明确抑制，目的是鉴定哪种类型的构建物将最有效地抑 制以及可能与下面的其他设计联用。PAI1-DCY-94-1 用RCL肽的4种串联重复序列来抑制正常的PAIl自杀反应。比 较该 DCY 与 PAI1-DCY-94-2 和 PAI1_DCY_94_3 的相对效率。PAI1-DCY-94-2 用单个RCL来抑制正常的PAI1自杀反应。比较该DCY与 PAI1-DCY-94-1 和 PAI1-DCY-94-3 的相对效率。PAI1-DCY-94-3 用RCL肽的4种串联重复序列(被间隔物隔开以增强其与多个 PAIl分子的相互作用)来抑制正常的PAIl自杀反应。比较该DCY与PAI1-DCY-94-1和 PAI1-DCY-94-2的相对效率。PAI-I诱骗剂4和5 与几种丝氨酸蛋白酶(例如，tPA、uPA、凝血酶)之一结合后， PAIl在切割过程显著的构象变化从而导致自杀性抑制反应。实验证据显示，这种结构重排是抑制机制的重要部分。延迟这种构象变化能使切割反应进行完全从而将PAIl转变成不 同于正常底物。在活性PAIl结构中无序存在的反应中心环(RCL)肽插入β片层。出于以下两个潜在目的之一，尝试使PAI-I诱骗剂4和5与活性ρΑΙ 1的RCL相互 作用1)减缓RCL插入PAIl结构中以使PAIl被靶标丝氨酸蛋白酶自然切割，或2)通过空 间干扰阻止与靶标蛋白酶结合在一起。RCL肽与PAIl的β片层相互作用。利用该片层的 序列约束天然RCL。PAI1-DCY-94-4 该DCY的目的是稳定RCL同时使其仍旧独立于片层而允许切割反 应进行。利用构成片层部分插入了 RCL的β链为RCL肽提供另一结合表面。PAIl的两个 反向平行β链将被用来产生其中插入并结合RCL的天然β片层部分。构成该DCY的两条 链在序列中不毗连，因此可利用形成β转角的四个残基结合它们并得到合适的二级结构。PAI1-DCY-94-5 该DCY的目的是稳定RCL同时使其仍旧独立于片层并允许切割反 应进行。RCL肽实际插入在PAIl结构的两条平行β链之间。这两条链在天然结构序列中 不毗连，但它们是PAIl这种β片层的顺序成员。富含亮氨酸的重复序列(LRR)是见于几种蛋白质，包括胞外基质蛋白核心蛋白聚 糖和双糖链蛋白聚糖以及Toll样受体中的基序。该基序包含β链的微凹表面以及螺旋或 半螺旋结构的凸面。这些基序反复堆叠形成螺线管结构，含有一系列平行β链形成凹片 层。该序列关键部分的亮氨酸提供了内部口袋，允许面朝外的残基有巨大变异。这种基序 稳定，尤其是当连续重复时。来自Toll样受体3胞外域的几个LRR将被用作支架以再形成 其中插入了 RCL的天然片层结构部分。由于平行链的堆叠，使LRR理想地模拟了 PAIl β片 层结构部分。由于PAIl中片层的大小，它们将在LRR支架上再产生两个区段。PAI-I诱骗剂6和7 激肽释放酶2 (hK2)是一种前列腺正常表达的丝氨酸蛋白酶， 可用作前列腺癌的标记物。它对Pl切割位点Arg显示有强特异性。它能切割和随后灭活 PAI1，效率高于其他蛋白酶。该蛋白的表达状况结合其特异性，使其成为实际切割和灭活 PAIl的良好候选物。如果靶向存在PAIl的区域，它能够切割并因此有效灭活PAI1。PAI-I诱骗剂6和7可利用活性蛋白酶激肽释放酶2 (hK2)来消化PAI1。hK2是一 种通常见于前列腺的丝氨酸蛋白酶。其表达状况特殊已被用作前列腺癌的标记物。其底物 特殊已显示出能特异性消化PAIl而不是被其抑制。这些构建物之一具有带电环，能模拟天 然tPA序列，显示对PAI1结合至关重要。PAI1-DCY-94-6 可制得激肽释放酶2的潜在突变体以增强其结合特异性。存在于 tPA中的环含有几个对tPA-PAIl结合至关重要的带电残基。可突变hK2中相应的环使之匹 配该序列并可能增强对PAIl的结合特异性。PAI1-DCY-94-7 激肽释放酶2 (hl^)是一种前列腺正常表达的丝氨酸蛋白酶，可 用作前列腺癌的标记物。它对Pl切割位点Arg显示有强特异性。它能切割和随后灭活 PAI1，效率高于其他蛋白酶。该蛋白的表达状况结合其序列特异性使其成为DCY实际切割 和灭活PAIl的良好候选物。已证明组织纤溶酶原激活剂(tPA)表面带正电荷的环对PAIl结合至关重要。据 认为它能与PAIl的RCL肽附近的一系列酸性残基相互作用。获得该区域以代替hK2中较 短的环。加入该序列导致较高的结合亲和力和更有效地切割。PAI-I诱骗剂8-12 纤溶酶原激活剂的抑制剂_1 (PAIl)是一种参与调节纤维蛋白溶解的丝氨酸蛋白酶抑制剂。其靶标包括组织纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶纤溶酶原激 活剂(uPA)。PAIl在自杀性抑制剂反应中结合其靶标，仅在极缓慢切割的酰基酶中间体阶 段共价结合(不在复合体被清除之前)。PAIl在溶液中的半衰期很短不到2小时。它自发 经历构象转变成为无功能的潜伏形式。最邻近切割位点的反应中心环(RCL)肽插入PAIl 结构上已有的β片层中。基于该RCL序列的肽可阻断PAIl蛋白酶的抑制活性。玻连蛋白是一种结合多个ECM伴侣的胞外基质(ECM)分子。它以高亲和力结合 PAIl并显著延长其半衰期，从而能与tPA、uPA和其他丝氨酸蛋白酶相互作用并抑制。与 PAIl的相互作用发生在玻连蛋白的生长调节素B(SMB)结构域中。结合是特异性的亲和力 高(Kd 约 InM)。PAI-I诱骗剂8-12利用玻连蛋白与PAIl相互作用并使其与RCL抑制肽结合。玻 连蛋白的生长调节素B (SMB)结构域以高亲和力结合PAIl并可显著延长其有效半衰期。一 些论文显示，该结合表面的酪氨酸突变可完全消除结合。尽管我们的目的不是消除结合，而 是使SMB结合的稳定作用最小同时保留至少部分结合亲和力。制备一系列保守性突变以探 测结合表面。SMB突变与RCL肽结合将赋予DCY相当大的抑制特性。将会发现使结合最大 同时使稳定性最小的构建物，无论其是天然的SMB结构域或是突变构建物之一。SMB的高结 合亲和力将RCL肽有效束缚于PAI1，应能促进更迅捷的相互作用。PAI l-DCY-94-8 =DCY将利用玻连蛋白的SMB结构域以高亲和力和特异性靶向PAI1 结合。SMB结构域将附着于基于PAIl的RCL多个重复抑制肽。最初的SMB结合将使该肽非 常接近并插入β片层，导致抑制作用，并可能导致SMB结构域分离。RCL肽可能以顺式或反 式起作用，影响附近的含有这些多个结合域和抑制域的PAIl分子。PAI1-DCY-94-9 该诱骗剂将利用玻连蛋白的生长调节素B结构域以高亲和力和 特异性靶向PAIl结合。SMB结构域将附着于基于PAIl的RCL多个重复抑制肽。最初的SMB 结合将使肽非常接近并插入β片层，导致抑制作用，并可能导致SMB结构域分离。RCL肽可 能以顺式或反式起作用，影响附近的含有这些多个结合域和抑制域的PAIl分子。所述SMB 结构域将被突变。这种突变将有可能降低玻连蛋白对PAIl的稳定作用但将维持有效靶向 RCL肽的充足亲和力。PAI1-DCY-94-10 该诱骗剂将利用玻连蛋白的生长调节素B结构域以高亲和力和 特异性靶向PAIl结合。SMB结构域将附着于基于PAIl的RCL多个重复抑制肽。最初的SMB 结合将使肽非常接近并插入β片层，导致抑制作用，并可能导致SMB结构域分离。RCL肽可 能以顺式或反式起作用，影响附近的含有这些多个结合域和抑制域的PAIl分子。所述SMB 结构域将被突变。这种突变将有可能降低玻连蛋白对PAIl的稳定作用但将维持有效靶向 RCL肽的充足亲和力。一些研究文章证明，突变消除了结合，尤其是在结合界面的T — A突 变。本发明的目的不是消除结合，而是尽可能消除玻连蛋白结合PAIl的二级稳定作用。PAI1-DCY-94-11 该诱骗剂将利用玻连蛋白的生长调节素B结构域以高亲和力和 特异性靶向PAII结合。SMB结构域将附着于基于PAIl的RCL多个重复抑制肽。最初的SMB 结合将使肽非常接近并插入β片层，导致抑制作用，并可能导致SMB结构域分离。RCL肽可 能以顺式或反式起作用，影响附近的含有这些多个结合域和抑制域的PAIl分子。所述SMB 结构域将被突变。这种突变将有可能降低玻连蛋白对PAIl的稳定作用但将维持有效靶向 RCL肽的充足亲和力。
PAI1-DCY-94-12 该诱骗剂将利用玻连蛋白的生长调节素B结构域以高亲和力和 特异性靶向PAIl结合。SMB结构域将附着于基于PAIl的RCL多个重复抑制肽。最初的SMB 结合将使肽非常接近并插入β片层，导致抑制作用，并可能导致SMB结构域分离。RCL肽可 能以顺式或反式起作用，影响附近的含有这些多个结合域和抑制域的PAIl分子。所述SMB 结构域将被突变。这种突变将有可能降低玻连蛋白对PAIl的稳定作用但将维持有效靶向 RCL肽的充足亲和力。PAI-I诱骗剂13和14 玻连蛋白是一种结合多个ECM伴侣的胞外基质(ECM)分 子。它以高亲和力结合PAIl而显著延长其半衰期，使之能与tPA、uPA和其他丝氨酸蛋白酶 相互作用并抑制。与PAIl的相互作用发生在玻连蛋白的生长调节素B(SMB)结构域中。结 合有特异性亲和力高(Kd约InM)。激肽释放酶2(hK2)是一种前列腺正常表达的丝氨酸蛋白酶，可用作前列腺癌的 标记物。它对Pl切割位点Arg显示出强特异性。它能切割和随后灭活PAI1，效率高于其他 蛋白酶。该蛋白的表达状况结合其序列特异性使其成DCY实际切割和灭活PAIl的良好候 选物。PAI-I诱骗剂13-14也利用SMB结构域来提高对PAIl的结合亲和力，此时与能够 结合并隔离PAIl的灭活蛋白酶结合，或与能将其消化的激肽释放酶2结合。PAI1-DCY-94-13 尿激酶-型纤溶酶原激活剂(uPA)是一种参与激活纤维溶解途 径以及通过其受体参与信号传导反应的丝氨酸蛋白酶。uPA是PAIl的靶标。该酶将被截 短成仅含催化结构域，催化残基将被突变而消除活性。这种灭活的酶将连接于玻连蛋白的 SMB结构域为PAIl提供结合平台。PAIl将被隔离不能与其他丝氨酸蛋白酶相互作用并抑 制。与PAI1-DCY-94-7和PAI1-DCY-94-14不同，这种DCY将不会在靶区域引入任何新的酶 活性。PAI1-DCY-94-14 该诱骗剂将利用玻连蛋白的生长调节素B结构域以高亲和力和 特异性靶向PAIl结合。SMB结构域将附着于活性激肽释放酶2分子以高亲和力和特异性靶 向PAIl并将其切割，从而使其灭活。PAI-I诱骗剂15 玻连蛋白是一种结合多个ECM伴侣的胞外基质(ECM)分子。它 以高亲和力结合PAIl并显著延长其半衰期，从而能与tPA、uPA和其他丝氨酸蛋白酶相互作 用并抑制。与PAIl的相互作用发生在玻连蛋白的生长调节素B(SMB)结构域中。结合有特 异性亲和力高(Kd约InM)。PAI-I诱骗剂15是SMB结构域的又一组突变。SMB的结构就其骨架而言几乎是对 称的。PAIl结合表面和面对结合位点的表面二者的螺旋和环取向几乎相同。在许多方面， 5个突变将在SMB分子上再产生第二个PAIl结合位点。虽然背面螺旋和环之间的间隔略小 于天然结合位点的间隔，但该螺旋区域能提供以一定亲和力结合第二个PAIl分子的充足 相互作用。如果确实结合两个PAIl分子，可连接RCL肽以能与两个结合的PAIl分子相互 作用。与天然结合位点相对的表面具有与结合位点类似的骨架。该表面的突变能部分复 制PAIl结合位点。可引入若干突变以概括SMB的大多数PAIl结合表面。突变诸残基的α 碳附加上0. 99埃的RMS，而螺旋结构域的α碳附加上0. 49埃的RMS。这样可能导致PAIl分子以面对面方式二聚化。存在至少两种可能该分子的RCL肽可能相互干扰，可能有实质性空间位阻而影响PAIl的抑制性能。为增强PAIl的抑制作 用，可使能结合从而抑制PAIl的外源RCL肽连接于该突变的SMB结构域成为重复的四聚 体。实施例组织特异性启动子参见“多肽和多核苷酸序列描述”部分以了解以下示例性组织特异性启动子的相 对应 SEQ ID NO。MOD 5306-动脉平滑肌特异性启动子(示于图10)-原理结蛋白基因编码骨骼、 心脏和平滑肌细胞中存在的中间丝蛋白。用于本文的该启动子区域含有能结合血清反应因 子和Oct-样因子的CArG/八聚体重叠元件；它还含有最小启动子(用启动子预测工具确 定)；该区域在动脉平滑肌细胞中具有活性，但在静脉平滑肌细胞或体内心脏中没有活性。合成启动子的MOD原理分析启动子区域并收集血管平滑肌细胞(VSMC)表达的基 因提供了与VSMC特异性表达相关的几种调控元件列表。在以下合成的启动子构建物融 合于平滑肌收缩蛋白SM22ci基因片段的肾母细胞瘤过表达的(Nov)最小启动子区域中采 用了一组这种调控元件的组合。SM22ci是一种已建立的VSMC分化标记物。其最小启动子 显示能指导不同转基因的动脉平滑肌特异性表达。近年报道了成年大鼠主动脉有非常高的 Nov表达。本发明示例性合成的血管平滑肌启动子包括M0D 5309-合成的VSMC特异性启动 子1(示于图11A)，M0D 5312-合成的VSMC特异性启动子2 (示于图11B) JnMOD 5315-合 成的VSMC特异性启动子3 (示于图11C)MOD原理分析启动子区域并收集血管平滑肌细胞(VSMC)表达的基因，提供了与 VSMC特异性表达相关的几种调控元件列表。在以下合成的启动子构建物融合于人肌球蛋 白重链11，平滑肌启动子区域的平滑肌收缩蛋白SM22ci基因片段中采用了一组这种调控 元件的组合。SM22ci是一种已建立的VSMC分化标记物。该大鼠最小启动子显示能指导不 同转基因的动脉平滑肌特异性表达。类似地，MYHll也是平滑肌特异性。MOD 4012-ESM1,内皮细胞特异性启动子(示于图12A)_Mod原理该基因编码一种 主要在内皮细胞中表达的分泌蛋白。该基因的启动子可用于需要内皮细胞特异性表达治疗 /诱骗分子的基因疗法。MOD 4399-FLT1，内皮细胞特异性启动子(示于图12B)_M0D原理人跨膜fms-样 受体酪氨酸激酶Flt-I是诱导内皮增殖和血管通透性的血管内皮生长因子的受体之一。 Flt-I在内皮中特异性表达。Flt-I启动子可用作将引入的外源基因靶向内皮表达的工具。MOD 4790-合成的内皮细胞特异性启动子1 (示于图13A)和MOD 4791-合成的内 皮细胞特异性启动子2 (示于图13B)-M0D原理基因疗法的主要目的是将感兴趣的基因引 入所需细胞类型。内皮细胞系实际上覆盖所有大的血管因此直接接触循环系统。有可能通 过内皮细胞递送的基因产物包括激素，血浆中发现的蛋白因子，如胰岛素、生长激素、因子 VIII，以及分别用于治疗局部缺血或新生血管疾病的血管生成分子或血管抑制分子。检查 内皮细胞特异性基因的启动子区域揭示，大多数具有特异性和非特异性转录因子二者的结 合位点。这种设计的目的是构建合成的内皮细胞特异性小启动子。将位于许多内皮细胞特 异性mRNA转录物5'端的已知转录因子结合位点的序列连接于人ICAM2最小启动子，从而 产生了合成的内皮细胞特异性启动子1和2。
实施例定位束缚子参见“多肽和多核苷酸序列描述”部分以了解以下示例性定位束缚子的相对应SEQ ID NO.。脂质修饰的束缚子，整合于胞质膜，胞外束缚子(示于图 14A-14B)设计的1类定位束缚子可将运载物锚定在胞质膜的细胞外表面。所设计的它们 具有心脏、骨骼或成纤维细胞组织记忆力。大部分构建物利用羰基磷脂酰肌醇(GPI)脂质 修饰而锚定于膜。GPI生物合成发生于在ER内翻译之后。该蛋白质的C-末端区识别疏水 基序，随后将其切除。切除后该蛋白质加入完整的GPI部分。GPI锚的结构和组成多种多 样，可以是蛋白质或组织特异性。一旦位于细胞表面，GPI锚可被磷脂酶切除。GPI切割的 动力学取决于脂质长度、膜表面电荷以及膜双层自身的生理化学特性。如此，设计中采用了 不同的GPI锚以提供各种表面保留时间。设计的91-1到91-4包含血幼素(hemojuvelin，HJV)GPI-锚切割/添加结构域。 选择HJV是因为它在骨骼肌内表达，并且如果加入正确的GPI锚就具有组织特异性，从而可 提供用于肌肉组织的理想结构域。91-1是基础信号肽/运载物/GPI基序的蓝图。91-2在 运载物与脂质锚之间加入了一个接头可增加运载物的移动范围。91-3含有包含突变的HJV 的较长C-末端区域，可防止HJV与神经发生素结合，但已被证明能适当地运输到膜。91-4 与91-2相同，但加入在MAGPl微纤维蛋白结合结构域中。当GPI锚被切除时，设计的该构 建物可结合周围的微纤维基质。这能保持运载物非常接近基质修饰蛋白。设计的91-5和91-6可利用Thy-IGPI切割/添加位点。选择Thy-I是由于经研 究并确认其保留时间长于其他的GPI锚定蛋白。Thy-I锚的结构可造成磷脂酶空间位阻而 减慢其切割速率。91-7基于91-6构建，加入了腱糖蛋白-X(TNX)基质结合域。该结构域应 将切割的GPI-锚定蛋白靶向I型胶原微纤维。91-8也含有基质结合域，但不是靶向基质框 架，这种ApoB结构域能结合葡糖胺基葡聚糖(9637699).设计的91-9到91-11具有相同的设计原理，但利用了磷脂酰肌醇聚糖_1的GPI 基序。磷脂酰肌醇聚糖-1是一种定位于膜筏(raft)和小凹的GPI-I锚定蛋白聚糖。它在 不同组织中广泛表达，在这种MDR中提供可能不同于其他GPI的保留时间。91-12到91-16 具有类似的原理，但含有MT-MMP6GPI切割/添加位点以及不同组合的接头与基质结合域。设计91-17和91-18试图产生能适当运输呈递运载物于细胞外表面的一种跨膜 LOC，。MTl-MMP C-末端尾和跨膜区域除了假定的运输信息没有已知功能。91-18加入了 糖基化胞外结构域，以在91-17不存在于膜中时帮助运输。91-19和91-20能将运载物置 于C-末端。蛋白裂解酶(matriptase)是一种II型丝氨酸蛋白酶。其蛋白酶结构域位于 C-末端区域，在这些构建物中被除去。剩余部分可能被糖基化而介导胞质膜递送。总之，设计91-1到91-16试图得到不同的膜保留时间以获得适合所加入的诱骗剂 的理想运载物呈递。一些设计包含基质结合域以增强递送位点的运载物在基质中的活性。 设计91-17到91-20试图获得不具有内在活性的可能是最简单的设计。所有设计的潜在缺 陷将是胞质膜运输缺陷。2类定位束缚子-可分泌和/或胞外束缚子，可溶性这些定位模块的意图是通过 调节型分泌途径或组成型细胞膜释放途径，使携带的运载物通过细胞进入胞外空间。一旦 到达细胞外，结合序列将允许肽附着于细胞质膜外部小叶并在此处合成，或者附着于形成胞外基质的蛋白质。为了分泌，采用了三种策略。第一种，利用细胞的调节型分泌途径，使脂质或蛋白 质聚集和/或结合于颗粒内表面。第二种，利用组成型分泌途径，使常规信号进入这些囊 泡。第三种，利用上述两种途径。这是由于在患理状态下，上述一种或另一种途径可能会 “超载”，而利用两种功能不同的信号(肽)应不会阻止肽活性完全消失。当利用与分泌颗 粒内表面的结合时，将选择对PH或钙水平变化敏感的结合，而有助于肽的细胞表面释放。一旦该肽从囊泡释放到表面，预计会与结合在细胞外部小叶表面的蛋白质(即 uPAR或膜联蛋白)结合，或与包含胞外基质的蛋白质(即纤维蛋白)结合。在一些构建物 中，利用了已知会在梗死区过度表达从而“暴露” “隐藏的”ECM结合基序的那些酶的蛋白酶 (识别)位点。采用这种方法试图防止运载物被健康组织区域内的蛋白质捕获和激活。换 句话说，位点的安置方式应使定位肽主体释放运载物时仅将其自身释放到胞外基质中。预 计与ECM结合将使运载物具有“逗留能力”，而与膜蛋白质维持结合将允许我们的肽翻转。3类定位束缚子-条件性可溶性胞外束缚子(示于图15)本设计的基本模块元件 如下预计活性较低的跨膜蛋白(或前蛋白)，熟知的信号肽，脂质膜附着基序(GPI和棕榈 酰基)，以及条件性可切割的蛋白水解位点(用于TACE/ADAM17、MTl-MMP、uPA/tTPA或多种 蛋白酶切割)。在11种设计和1种可能的阳性对照中这些组分不相同。这些设计作为一个 整体试图破坏不同风险因素(实验的和实际的)之间的平衡。L0C-93-1 本身就是一类。其基于前 _ 原 _TGF_ α (pre-pro-TGF-alpha)，但在该 设计中，删除了分泌和加工的生长因子，代之以治疗诱骗剂、标签或荧光蛋白。为了使该设 计能“工作”，必需用与成熟TGF-α非常类似的方法处理该诱骗剂。前-原-TGF-α大部 分被肿瘤坏死因子α转化酶(TACE/ADAM17)切割和激活，该酶也参与各种促炎细胞因子 如TNF-α的“屏蔽”。TACE由促炎微环境诱生，可用佛波酯处理人为诱生。TACE大量存在 于心脏损伤、组织重塑和肿瘤微环境区域内，可在细胞表面或者甚至在分泌之前在分泌小 泡内被激活。该组中采用TACE(或预测的TACE共有序列)的其他设计是L0C-93-2、-3、-4 和_9。然而，预计这些共有位点通过不同方式定位到表面。L0C-93-2、_3、_4、_5、_6、_7和_12(对照)利用了一种称为TMlO的少许不明确 的多肽，即Opalin(—种功能未知的脑特异性蛋白)的人同源物。通过检索EMBL-GFP(海 德堡，德国)定位数据库计划中小的(即小于200个氨基酸)跨膜蛋白鉴定到这种蛋白质。 它不含明显的信号肽、配体受体或激酶结构域，其141氨基酸序列的BLAST检索显示无密切 同源物。尽管LOCATE数据库称TMlO是一种II型膜蛋白，但对该序列进行的多次分析揭 示，毫无例外它实际上明确是I型膜蛋白(含有通过LOCATE相连的分析位点)。在完成这 些设计之后，Kippert等最近Q008/4/25 ； 18439243)对TMlO (TMEMlO)进行了定性，实验证 明为I型，具有很强的胞质膜定位功能和可能的肌动蛋白结合功能。采用小的致密跨膜LOC 信号肽(transmembraneLOCsig)的理由几乎不言而喻，因为这种例子的许多肽体积较大很 可能参与多效性信号传导一这对治疗有潜在危害。心脏治疗采用少突胶质细胞特异性多肽 的理由是，脑特异性蛋白质干扰心脏特异性过程的可能性很小。通过实验比较将L0C-93-2、_3和_4归为一组。将合成的嵌合TACE底物(基于 TGF- α TACE位点+TNF- α的两个取代基，侧接短间隔残基)与TMlO的N-末端融合，形成 TAG/DCY与LOC之间的连接。L0C-93-3通过包含EGFR的η-末端信号肽将93_2转变为“内部运载物”；这测试了信号肽是否增强了向表面的递送。L0C-93-4在L0C-93-3中添加了 C-末端棕榈酰附着位点；这种添加进而可测试C-末端脂化是否增强了细胞表面的定位和/ 或保留。也通过比较不同的蛋白水解位点将L0C-93-3、-5、-6、_7 —起归入另一组。所述 蛋白水解切割位点可以是TACE/ADAM17、uPA/tPA、MTl-MMP的切割位点，或者是更不稳定的 可被多种蛋白酶(即α -2巨球蛋白)靶向的位点。L0C-93-8、_9、-10和-11的设计如下。其构型为信号肽(来自前-磷脂酰 肌醇聚糖)后接内部运载物，终止于C-末端的假定GPI锚定位点(来自MMP 25)。与 L0C-93-3、-5、-6和-7类似，这些测试显示蛋白酶切割位点的四种变化。然而，在本文中， 膜附着是困难的，因为不是通过跨膜，而是通过单一脂化模式。L0C-93-12是胞质膜定位的一种潜在阳性对照物，已由EMBL-海德堡的GFP-LOC计 划以及最近的Kippert等的论文Q008/4/25 ； 18439243)定性。本发明还提供了以下非限制性实施方式。El. 一种分离的多肽配体，其中所述配体调节PAI-I活性。E2. 一种分离的多肽异质聚合配体，其中所述异质聚合配体调节PAI-I活性。E3. 一种分离的多肽同质聚合配体，其中所述同质聚合配体调节PAI-I活性。E4. 一种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含母体蛋白的一个或多个片段，所 述母体蛋白含有至少一个假想的PAI-I相互作用结构域识别基序。E5.如E4所述的分离的融合蛋白，其中所述母体蛋白是纤维蛋白、组织纤溶酶原 激活剂、尿激酶纤溶酶原激活剂或玻连蛋白。E6.如E1-E5所述的多肽，还包含降解决定子、定位信号、表位或报道分子的一个 或多个。E7. 一种分离的多核苷酸，其包含编码E1-E7各项所述多肽的核苷酸序列。E8. 一种载体，其包含E7所述多核苷酸。E9. 一种宿主细胞，其包含E7所述多核苷酸。E10. 一种非人生物，其包含E7所述多核苷酸。Ell.任选连接于启动子的E7所述的多核苷酸。E12.如Ell所述的任选连接于启动子的多核苷酸，其中所述启动子是组成型启动 子、非特异性启动子、可诱导启动子或组织特异性启动子。E13.如E12所述的任选连接于启动子的多核苷酸，其中所述组织特异性启动子是 内皮细胞特异性启动子、血管平滑肌细胞特异性启动子、心肌细胞特异性启动子、冠脉脂肪 细胞特异性启动子或心脏成纤维细胞特异性启动子。E14.如E9所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。E15.如E14所述宿主细胞，其中所述宿主细胞是内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌 细胞、冠脉脂肪细胞或心脏成纤维细胞。E16.如ElO所述非人生物，其中所述生物是非人灵长类、小鼠、牛、猪、羊、马、大 鼠、兔、狗、猫或豚鼠。E17. 一种抑制细胞PAI-I的方法，包括用E8所述载体转染宿主细胞并在适合产生 至少一个所述多肽拷贝的条件下培养被转染的宿主细胞。
E18组织中。
E19卵中。
E20
E21
E22
-种分离的多核苷酸，其包含编码E20-E22各项所述多肽的核苷酸序列。 -种分离的多核苷酸，其包含对载体插入已经过优化的编码PAI-I的核苷酸
-种抑制对象心肌组织PAI-I的方法，包括将E8所述载体注射到对象的心脏
-种产生PAI-I活性降低转基因对象的方法，包括将E8所述载体注射到受精
-种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与降解决定子相连的PAI-1。 -种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与定位信号相连的PAI-1。 -种分离的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与降解决定子和定位信号相连 的 PAI-I。E23.E24. 序列的多核苷酸。E25.如EM所述的分离的多核苷酸，其中所述载体是ULTRAVECT0R。E26. 一种载体，其包含E23-E25所述多核苷酸。E27. 一种宿主细胞，其包含E23-E25所述多核苷酸。E28. 一种非人生物，其包含E23-E25所述多核苷酸。E29.任选连接于启动子的E23-E25所述的多核苷酸。E30.如E^所述的任选连接于启动子的多核苷酸，其中所述启动子是组成型启动 子、非特异性启动子、可诱导启动子或组织特异性启动子。E31.如E^所述的任选连接于启动子的多核苷酸，其中所述组织特异性启动子是 内皮细胞特异性启动子、血管平滑肌细胞特异性启动子、心肌细胞特异性启动子、冠脉脂肪 细胞特异性启动子或心脏成纤维细胞特异性启动子。E32.如E27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。E33.如E32所述宿主细胞，其中所述宿主细胞是内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌 细胞、冠脉脂肪细胞或心脏成纤维细胞。E34.如似8所述非人生物，其中所述生物是非人灵长类、小鼠、牛、猪、羊、马、大 鼠、兔、狗、猫或豚鼠。E35. 一种改变宿主细胞内PAI-I表达的方法，包括将E^所述载体转染入宿主细 胞并在适合产生至少一个PAI-I拷贝的条件下培养转染的宿主细胞。E36. 一种改变对象心脏组织PAI-I表达的方法，包括将E^所述载体注射到对象 的心脏组织中。E37. 一种产生PAI-I表达改变的转基因对象的方法，包括将E^所述载体注射到 受精卵中。上述实施例和实施方式仅作为列举性实施方式。本领域技术人员应理解，本发明 不限于本文所述的具体实施方式
，许多等价设计也属于本发明范围内。参考文献Akyurek, L. Μ. , S. Nallamshetty 等.(2001). “ Coexpression of guanylate kinase with thymidine kinase enhances prodrug cell killing in vitro and suppresses vascular smooth muscle cell proliferation in vivo (鸟 1Q1 酸激 禾口月匈 苷激酶共表达体外增强了前药的细胞杀伤并抑制体内血管平滑肌细胞增殖).“Mol Ther3 (5 第 1 部分)779-86.Akyurek, L. M.，Z. Y. Yang 等.(2000). ‘‘ SM22alpha promoter targets gene expression to vascular smooth muscle cells in vitro and in vivo (SM22 α 启动子在 体外和体内使基因表达靶向血管平滑肌细胞).“Mol Med 6(11) :983-91.Appleby, C. Ε. , P. A. Kingston ^ . (2003). ‘‘ A novel combination of promoter and enhancers increases transgene expression in vascular smooth muscle cells in vitro and coronary arteries in vivo after adenovirus-mediated gene transfer(jp 动子和增强子的新型组合提高了腺病毒介导的基因转移后体外血管平滑肌细胞和体内冠 状动脉中的转基因表达).“Gene Ther 10(18) :1616-22.Beck, C. , H. Uramoto 等.(2004). “ Tissue-specific targeting for cardiovascular gene transfer. Potential vectors and future challenges (
性靶向心血管的基因转移。潜在的载体和未来挑战).“Curr Gene Ther 4(4) :457-67.Burke, B. (2003). “ Macrophages as novel cellular vehicles for gene therapy(巨噬细胞是基因治疗的新型运载细胞).‘‘Expert Opin Biol Ther 3(6) 919-24.Burke, B. , S. Sumner ^ . (2002). “ Macrophages in gene therapy :cellular delivery vehicles and in vivo targets (巨噬细胞在基因疗法中的应用细胞输送载体 和体内靶标)· “ T Leukoc Biol 72(3) :417-28.Gough, P. J. and Ε. W. Raines (2003). “ Gene therapy of apolipoprotein E-deficient mice using a novel macrophage-specific retroviral vector(; 用新 型巨噬细胞-特异性逆转录病毒载体基因治疗载脂蛋白E-缺陷小鼠)."Mood 101(2) 485-91.Hasty, Α. H. , Μ. F. Linton ^ . (1999). ‘‘ Retroviral gene therapy in ApoE-deficient mice :ApoE expression in the artery wall reduces early foam cell lesion formation(Apo-E缺陷小鼠的逆转录病毒基因疗法动脉壁ApoE表达降低了早期 泡沫细胞损伤的形成).“Circulation 99(19) :2571-6.Ishigurο, H. , H. Yoshida 等.(2001). “ Retrovirus-mediated expression of apolipoprotein A-I in the macrophage protects against atherosclerosis in vivo(逆转录病毒介导的巨噬细胞载脂蛋白A-I表达体内保护免于动脉粥样硬化).“J Biol Chem 276(39) :36742-8.Juan，S. H.，Τ· S. Lee 等· (2001). ” Adenovirus-mediated heme oxygenase-lgene transfer inhibits the development of atherosclerosis in apolipoprotein Ε-deficient mice (腺病毒介导的血红素加氧酶_1基因转移抑制了载脂蛋白E缺陷小鼠动 脉粥样硬化的发展).“Circulation 104 (13) :1519-25.Lu, Ζ. Ζ. , F. Ni 等· (2006). " Efficient gene transfer into hematopoietic cells by a retargeting adenoviral vector system with a chimeric fiber of adenovirus serotype 5and lip (用含腺病毒血清型5和lip嵌合纤维的再靶向腺病毒载 体系统将基因有效转移给造血细胞).“Exp Hematol 34(9) :1171-82.Nilsson,M. , S. Karlsson等· (2004). “ Functionally distinct subpopulationsof cord blood CD34+cells are transduced by adenoviral vectors with serotype 5or 35tropism(用含血清型5或35向性的腺病毒载体转导脐带血⑶34+细胞的不同功能亚 群)· 〃 Mol Ther 9(3) :377-88.Ophorst, 0. J. , S. Kostense 等.(2004). “ An adenoviral type 5vector carrying a type 35fiber as a vaccine vehicle :DC targeting, cross neutralization, and immunogenicity (携带35型纤维的腺病毒5型载体作为疫苗运载体 DC靶向、交叉中和以及免疫原性).“Vaccine 22(23-24) :3035-44.Roth, D. Μ. , N. C. Lai ^ . (2004). ‘‘ Indirect intracoronary delivery of adenovirus encoding adenylyl cyclase increases left ventricular contractile function in mice (间接冠状动脉内递送编码腺苷酸环化酶的腺病毒增强了小鼠的左心室 收缩功能).“Am T Physiol Heart Circ Physiol 287(1) :Η172_7·Segerman,A.，Κ· Lindman等· (2006). " Adenovirus types lip and 35attach to and infect primary lymphocytes and monocytes, but hexon expression in T-cells requires prior activation (lip和35型腺病毒能附着感染原代淋巴细胞和单核细胞，但 在T细胞中的六邻体表达要求预先活化).“ViroloRY 349(1) :96-111.Shayakhmetov, D. M.，T. Papayannopoulou 等.(2000). “ Efficient gene transfer into human CD34 (+) cells by a retargeted adenovirus vector (通过再革巴向 的腺病毒载体将基因有效转移人⑶；34(+)细胞).“T Virol 74(6) :2567-83.Van Eck, Μ. , N. Herijgers 等.(2000). “ Effect of macrophage-derived mouse ApoE, human ApoE3_Leiden, and human ApoE2(Arg 158—> Cys)on cholesterol levels and atherosclerosis in ApoE-def icient mice (巨噬细胞-产生的小鼠 ApoE、人 ApoE3-Leiden和人ApoE2(Argl58— > Cys)对ApoE-缺陷小鼠胆固醇水平和动脉粥样硬化 的影响)· “ Arterioscler Thromb Vasc Biol 20(1) :119-27.Yoshida, H. , A. H. Hasty φ . (2001). “ Isoform-specif ic effects of apolipoprotein E on atherogenesis :gene transduction studies in mice (载月旨蛋 白E对动脉粥样硬化形成的同种型特异性效应小鼠的基因转导研究).“Circulation 104(23) :2820-5.
权利要求
1.一种本文所述的PAI-I配体或聚合配体。
2.一种与本文所述的PAI-I配体或聚合配体至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的PAI-I配体或聚合配体。
3.一种已经过修饰的本文所述的PAI-I配体或聚合配体，其包含一个或多个氨基酸缺 失、取代、插入、截短，或它们的组合。
4.一种与SEQ ID NO :1-30中奇数编号序列所示多肽至少60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的多肽。
5.一种包含至少一个与 SEQ ID NO :37-51 之一至少 60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的肽的PAI-I配体或聚合配体。
6.一种具有以下抑制机制潜伏状态、将PAl转变成底物、空间位阻tPA结合、空间位 阻内源玻连蛋白、或直接竞争结合位点至少一种的PAI-I配体或聚合配体。
7.一种包含SEQ ID NO :31-36中所示母体蛋白至少一个片段的PAI-配体或聚合配体， 其中所述片段任选包含一个或多个氨基酸缺失、取代、插入，截短，或它们的组合。
8.—种PAI-I抑制剂，其包含选自以下肽的至少一个拷贝a)与包含SEQID NO :31的氨基酸残基354-368相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；b)与包含SEQID NO :31的氨基酸残基300-309相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相同的肽；c)与包含SEQID NO :31的氨基酸残基343-353相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；d)与包含SEQID NO :32的氨基酸残基20-63相对应氨基酸残基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；e)与包含SEQID NO :32的氨基酸残基20-63相对应氨基酸残基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO 32的氨基酸残基32相对应的氨基酸残基从苯丙氨酸突变为亮氨酸；f)与包含SEQID NO :32的氨基酸残基20-63相对应氨基酸残基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO 32的氨基酸残基四相对应的氨基酸残基从苏氨酸突变为丙氨酸；g)与包含SEQID NO :32的氨基酸残基20-63相对应氨基酸残基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的肽，其中所述SEQ ID NO: 32的氨基酸残基42相对应的氨基酸残基从谷氨酸突变为丙氨酸；h)与包含SEQID NO :32的氨基酸残基20-63相对应氨基酸残基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO 32的氨基酸残基43相对应的氨基酸残基从亮氨酸突变为丙氨酸；i)与包含SEQID NO :32的氨基酸残基20-63相对应氨基酸残基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO 32的氨基酸残基23相对应的氨基酸残基从丝氨酸突变为苯丙氨酸，与SEQ ID NO 32 的氨基酸残基52相对应的氨基酸残基从苏氨酸突变为谷氨酸，与SEQ ID N0:32的氨基酸 残基56相对应的氨基酸残基从丙氨酸突变为酪氨酸，与SEQ ID NO 32的氨基酸残基57相对应的氨基酸残基从谷氨酸突变为酪氨酸；j)与包含SEQ ID NO :33的氨基酸残基25-256相对应氨基酸残基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；k)与包含SEQ ID NO :33的氨基酸残基25-44相对应氨基酸残基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；1)与包含SEQ ID NO :33的氨基酸残基47-256相对应氨基酸残基的肽至少60^^65%, 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；m)与包含SEQ ID NO :34的氨基酸残基301-308相对应氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽；η)与包含SEQ ID NO :35的氨基酸残基四-121相对应氨基酸残基的肽至少60^^65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO 35的氨基酸残基55相对应的氨基酸残基从缬氨酸突变为丙氨酸，与SEQ ID NO 35的 氨基酸残基57相对应的氨基酸残基从天冬氨酸突变为酪氨酸，与SEQ ID N0:35的氨基酸 残基59相对应的氨基酸残基从苏氨酸突变为天冬酰胺，与SEQ ID NO :35的氨基酸残基79 相对应的氨基酸残基从丝氨酸突变为赖氨酸，与SEQ ID NO :35的氨基酸残基81相对应的 氨基酸残基从天冬氨酸突变为赖氨酸，与SEQ ID NO :35的氨基酸残基83相对应的氨基酸 残基从甘氨酸突变为谷氨酸；和ο)与包含SEQ ID NO 36的氨基酸残基179-415相对应的氨基酸残基的肽至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%相同的肽，其中所述与 SEQ ID NO :36的氨基酸残基2M相对应的氨基酸残基从组氨酸突变为丙氨酸，与SEQ ID NO 36 的氨基酸残基275相对应的氨基酸残基从天冬氨酸突变为丙氨酸，与SEQ ID NO :36的氨基 酸残基376相对应的氨基酸残基从丝氨酸突变为丙氨酸。
9.一种编码如权利要求1-8所述多肽的多核苷酸。
10.一种与SEQ ID NO :1-30中偶数编号序列所示多核苷酸至少60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的多核苷酸。
11.一种连接于1类定位束缚子的配体或聚合配体。
12.一种连接于2类定位束缚子的配体或聚合配体。
13.一种连接于3类定位束缚子的配体或聚合配体。
14.一种编码如权利要求11-13所述多肽的多核苷酸。
15.一种本文所述的1类定位束缚子。
16.一种与本文所述1类定位束缚子至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%相同的1类定位束缚子。
17.—种已经过修饰的本文所述1类定位束缚子，其包含一个或多个氨基酸缺失、取 代、插入、截短，或它们的组合。
18.一种与 SEQ ID NO :57-76 至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%相同的1类定位束缚子。
19.一种包含至少一个与 SEQ ID NO :77-95 之一至少 60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的肽的1类定位束缚子。
20.一种编码权利要求15-19所述多肽的多核苷酸。
21.一种本文所述的2类定位束缚子。
22.—种编码权利要求21所述多肽的多核苷酸。
23.一种本文所述的3类定位束缚子。
24.一种与本文所述3类定位束缚子至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%相同的3类定位束缚子。
25.—种已经过修饰的本文所述的3类定位束缚子，其包含一个或多个氨基酸缺失、取 代、插入、截短，或它们的组合。
26.—种与 SEQ ID NO :100-111 至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%相同的3类定位束缚子。
27.一种包含至少一个与 SEQ ID NO :112-1 之一至少 60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的肽的3类定位束缚子。
28.—种编码权利要求23-27所述多肽的多核苷酸。
29.一种连接于组织特异性启动子的编码配体或聚合配体的多核苷酸。
30.一种连接于动脉平滑肌特异性启动子的编码配体或聚合配体的多核苷酸。
31.一种连接于血管平滑肌细胞特异性启动子的编码配体或聚合配体的多核苷酸。
32.一种连接于内皮细胞特异性启动子的编码配体或聚合配体的多核苷酸。
33.一种连接于合成的内皮细胞特异性启动子的编码配体或聚合配体的多核苷酸。
34.一种编码本文所述组织特异性启动子的多核苷酸。
35.一种已经过修饰的编码本文所述组织特异性启动子的多核苷酸，其包含一个或多 个核苷酸缺失、取代、插入、截短，或它们的组合。
36.一种编码与本文所述组织特异性启动子至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同的组织特异性启动子的多核苷酸。
37.一种与 SEQ ID NO :132-139所示多核苷酸至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸。
38.一种将编码配体或聚合配体的多核苷酸转移到本文所述心血管组织的方法。
39.一种将编码配体或聚合配体的多核苷酸转移到本文所述心血管组织的方法，所述 方法包括以下之一种局部注射腺病毒、离体转导单核细胞、或直接注射入主动脉内。
40.一种评价PAI-I在本文所述不稳定斑块形成中所具功能的方法。
41.一种评价PAI-I在不稳定斑块形成中所具功能的方法，所述方法包括建立胰岛素 抗性小鼠模型的步骤。
42.一种实现空间或时序调控本文所述配体或聚合配体的方法。
43.一种实现空间调控配体或聚合配体的方法，包括将所述配体或聚合配体连接于组 织特异性启动子的步骤。
44.一种实现空间调控配体或聚合配体的方法，包括将所述配体或聚合配体连接于定 位束缚子的步骤。
45.一种实现时序调控配体或聚合配体的方法，包括将所述配体或聚合配体连接于可 诱导基因开关的步骤。
46.一种治疗、预防或缓解心血管疾病的方法，包括以下步骤a)鉴定患有心血管疾病或有发生心血管疾病风险的对象；和b)给予该对象PAI-I配体或聚合配体。
47.一种治疗、预防或缓解纤维变性疾病的方法，包括以下步骤a)鉴定患有纤维变性疾病或有发生纤维变性疾病风险的对象；和b)给予该对象PAI-I配体或聚合配体。
48.一种治疗或预防动脉粥样硬化的方法，该方法包括a)鉴定患有血管损伤或有血管损伤风险的对象；b)分离所述对象的单核细胞；c)将至少一个与启动子相连的编码纤维溶解途径多肽调节剂的多核苷酸引入所述单 核细胞中产生修饰的细胞；和d)将所述修饰的细胞引入所述对象。
49.一种制备向对象递送纤维溶解途径多肽调节剂的修饰细胞的方法，所述方法包括 在所述对象的单核细胞内引入至少一个与启动子相连的编码纤维溶解途径多肽调节剂的 多核苷酸而产生修饰的细胞。
50.一种治疗或预防动脉粥样硬化的方法，该方法包括a)鉴定患有血管损伤或有血管损伤风险的对象；b)分离所述对象的单核细胞；c)在所述单核细胞内引入(1)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一 个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码化学配体依赖性转录因子，和(2) 至少一个与启动子相连的编码纤维溶解途径多肽调节剂的多核苷酸，所述启动子可被所述 化学配体依赖性转录因子活化，从而产生修饰的细胞；d)将所述修饰的细胞引入所述对象；和e)将所述化学配体引入对象以激活启动子。
51.一种制备向对象递送纤维溶解途径多肽调节剂的修饰细胞的方法，所述方法包括 在所述对象的单核细胞中引入(a)编码基因开关的多核苷酸，所述基因开关包含至少一 个转录因子序列，其中所述至少一个转录因子序列编码化学配体依赖性转录因子，和(b) 至少一个与启动子相连的编码纤维溶解途径多肽调节剂的多核苷酸，所述启动子可被所述 化学配体依赖性转录因子活化，从而产生修饰的细胞。
52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述转录因子序列连接于巨噬细胞特异 性调控元件。
53.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述转录因子序列连接于巨噬细胞特异 性调控元件。
54.如权利要求48-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述纤维溶解途径多肽调节 剂是权利要求1-8中任一项所述的PAI-I配体或聚合配体。
55.如权利要求48-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述纤维溶解途径多肽调节 剂是PAI-I抑制剂。
56.如权利要求48-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述纤维溶解途径多肽调节 剂是天然纤溶酶原激活剂。
57.如权利要求48-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述纤维溶解途径多肽调节 剂是突变纤溶酶原激活剂。
58.如权利要求48-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述纤维溶解途径多肽调节 剂是纤溶酶原激活剂片段。
59.一种治疗、预防或缓解涉及固定巨噬细胞群的纤维变性疾病的方法，包括以下步骤a)鉴定患有纤维变性疾病或有发生纤维变性疾病风险的对象；b)分离所述对象的单核细胞；c)将至少一个与固定巨噬细胞群特异性调控元件相连的编码纤维溶解途径多肽调节 剂的多核苷酸引入所述单核细胞而产生修饰的细胞；和d)将所述修饰的细胞引入所述对象。
60.如权利要求48、50、52或59中任一项所述的方法，其特征在于，步骤b)和d)可以 省略，且其中所述多核苷酸可通过单核细胞特异性载体而体内引入单核细胞。
61.一种权利要求9、10、14或20中任一项所述的多核苷酸。
62.一种权利要求四-37中任一项所述的多核苷酸。
63.一种包含权利要求61所述多核苷酸的载体。
64.一种包含权利要求62所述多核苷酸的载体。
65.如权利要求63所述的载体，其特征在于，所述载体是单核细胞特异性载体。
66.一种包含权利要求61所述多核苷酸的宿主细胞。
67.一种包含权利要求62所述多核苷酸的宿主细胞。
68.如权利要求66或67所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
69.如权利要求66所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是单核细胞、巨噬细胞 或泡沫细胞。
70.如权利要求66或67所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是动脉平滑肌细 胞、血管平滑肌细胞或内皮细胞。
71.如权利要求66所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是心肌细胞、冠脉脂肪 细胞或心脏成纤维细胞。
72.一种包含权利要求61或62所述多核苷酸的非人生物。
73.如权利要求72所述的非人生物，其特征在于，所述生物是非人灵长类、小鼠、牛、 猪、羊、马、大鼠、兔、狗、猫或豚鼠。
74.—种包含权利要求9或10所述多核苷酸的载体。
75.—种制造PAI-I配体或聚合配体多肽的方法，所述方法包括将权利要求74所述的 载体转染入宿主细胞并在适合于产生至少一个PAI-I配体或聚合配体多肽拷贝的条件下 培养该转染的宿主细胞。
76.一种抑制对象心肌组织PAI-I的方法，包括将权利要求74所述载体注射到对象的 心脏组织内。
77.一种治疗或预防动脉粥样硬化的方法，该方法包括a)鉴定患有血管损伤或有血管损伤风险的对象；b)分离所述对象的单核细胞；c)将权利要求74所述载体转染入所述单核细胞从而产生修饰的细胞；和d)将所述修饰的细胞引入所述对象。
78.一种治疗、预防或缓解涉及固定巨噬细胞群的纤维变性疾病的方法，包括以下步骤a)鉴定患有纤维变性疾病或有发生纤维变性疾病风险的对象；b)分离所述对象的单核细胞；c)将权利要求74所述载体转染入所述单核细胞，其中，权利要求8或9所述的多核苷 酸连接于固定巨噬细胞群的特异性调控元件，从而产生修饰的细胞；d)将所述修饰的细胞引入所述对象。
79.—种产生PAI-I活性降低的转基因对象的方法，包括将权利要求74所述载体注射 到受精卵中。
全文摘要
本发明涉及哺乳动物PAI-1配体和调节剂。本发明具体涉及多肽、多肽组合物以及编码PAI-1配体和/或调节剂多肽的多核苷酸。本发明也涉及调节PAI-1活性的聚合配体(polyligand)，所述聚合配体是同质聚合配体(homopolyligand)或异质聚合配体(heteropolyligand)。本发明也涉及位于细胞区域内的配体和聚合配体。本发明也涉及可用于为PAI-1配体和聚合配体提供空间调控的定位束缚子(tether)和启动子序列。本发明还涉及可用于为PAI-1配体和聚合配体提供时序调控的可诱导基因开关。本发明还涉及治疗或预防动脉粥样硬化的方法。本发明还涉及治疗或预防纤维化的方法。
文档编号A61K38/00GK102123721SQ200980108863
公开日2011年7月13日 申请日期2009年1月9日 优先权日2008年1月9日
发明者B·L·梅伦涅克, C·C·瑞德, C·L·贝尔, E·塔舍瓦, J·卡森, J·马扎瑞利索普琴斯基, R·E·彼得森, T·D·瑞德 申请人:英特瑞克斯顿股份有限公司