专利名称：焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
硫嘌呤是6-巯基嘌呤咪唑衍生物，为具有免疫抑制作用的抗代谢剂。可产生烷基化作用抑制核酸的生物合成，防止细胞的增生，并可引起的DNA损伤。通过抑制T淋巴细胞而影响免疫，可抑制迟发过敏反应。临床上主要用于急慢性白血病、绒毛膜上皮癌和器官移植。巯嘌呤甲基转移酶(TPMT)參与巯嘌呤和咪唑硫嘌呤的甲基化作用，与其化疗效果和毒性关系密切。TPMT的活性受到遗传多态性的影响，它可以通过TPMT改变巯嘌呤的代谢率。TPMT的活性在患者间个体差异明显，86. 6%的野生型TPMT*1人群TPMT活性较高，而
11.I %具有中等活性，有O. 3%活性缺失。其中3个(TPMT*2，*3A和*3C[G460A])占中等和低活性状况的80-95%。TPMT*3A的患者TPMT活性完全丧失，TPMT*3B和TPMT*3C患者的TPMT催化活性分别降低9和I. 4倍。区分ΤΡΜΤ*1/*3 (中等代谢者)和TPMT*3B/*3C (低代谢者)。研究表明，TPMT中等活性和较低活性的患者只能接受10% 50%的平均巯嘌呤化疗剂量。人群中约O. 3%的TPMT活性缺失，11%的人群活性中等，都面临着患骨髄抑制增加的风险。TPMT基因的遗传变异对于急性淋巴细胞性白血病化疗反应的疗效和毒副作用具有重要意义。TPMT活性与上述嘌呤类药物的治疗效果及毒副作用密切相关，是目前FDA批准修改药物说明书增加基因遗传变异警示的有限的几种药物之一，临床医生应结合TPMT基因型慎重使用嘌呤类药物。综上所述，TPMT (rsll42345)基因多态性是影响硫嘌呤需求剂量差异性的主要因素，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测TPMT (rsll42345)基因多态性的试剂盒将为硫嘌呤的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是ー种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
TPMT (rsll42345)基因多态性是影响巯嘌呤剂量个体差异的最主要因素。本发明提供一种检测影响临床巯嘌呤个体化用药治疗的用药基因TPMT (rsll42345) (SEQ IDNO. I)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测巯嘌呤个体化用药相关基因SNP。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为
一种焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒，包括如下引物
(I)扩增引物TPMT (rsll42345)上游引物5、TGG GGA ATT GAC TGT CTT TTT GA~3r (SEQ IDNO. 2)；
TPMT (rsll42345)下游引物5、TCC ATT ACA TTT TCA GGC TTT AGCHT (SEQ IDNO. 3)；
其中，下游引物的5,进行生物素标记；
(2)测序引物
TPMT (rsll42345)测序引物5r - GAC TGT CTT TTT GAA AAG TT -3, (SEQ ID NO. 4)；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤 (O DNA提取；
(2)聚合酶链反应
配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10XPCR buffer 5. Ομ I, dNTP 3·0μ1，上游引物
O.5 μ 1，下游引物O. 5 μ 1，rTaqO. 5μ 1，水39. 5μ 1，模板Ι.Ομ I ;按照下面的循环參数设置扩增仪95 0C 5min预变性；然后依次在95°C 30S, 55°C 30S, 72°C 30S，进行35个循环；再在72°C保持5min，最终保持在4 °C，得扩增产物；
(3)焦磷酸测序单链样本纯化；
(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对TPMT (rsl 142345)目标序列进行分析和检测野生型AGTTATATCTAC (SEQ ID NO. 5)和突变型 AGTTATGTCTAC (SEQ ID NO. 6)，扩增出的片段长度为 132bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于对他莫昔芬个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临床上他莫昔芬个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明TPMT (rsll42345) AA焦磷酸测序結果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :
TPMT (rsll42345)上游引物5、TGG GGA ATT GAC TGT CTT TTT GA~3r (SEQ IDNO. 2)；
TPMT (rsll42345)下游引物5、TCC ATT ACA TTT TCA GGC TTT AGCHT (SEQ IDNO. 3)；
TPMT (rsll42345)测序引物:5,- GAC TGT CTT TTT GAA AAG TT -3, (SEQ ID NO. 4)；
I.DNA提取
I.I实验前试剂材料准备与检查工作如下(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加こ醇，并在瓶上相应标识处打勾V; (2)异丙醇(如无，可用无水こ醇替代)和75%こ醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本卩隹一性标识做好标记；
I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6盖上Eppendorf管盖，室温孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室温离心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；· I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管ロ弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；
1.11移取30011しNuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；
I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析
出；
I. 15 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管ロ弃去上清；
I. 17移取300uL 75%こ醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管ロ弃去上清；
I.20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；
I. 21目测沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度測定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入こ醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24保存核酸标本至4°C冰箱；
2.聚合酶链反应
2.I在试剂准备区配制50 μ I PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
权利要求
1.焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物 (1)扩增引物上游引物5、TGG GGA ATT GAC TGT CTT TTT GA~3r ；下游引物:5,-TCC ATT ACA TTT TCA GGC TTT AGCHT ；其中，下游引物的5,进行生物素标记； (2)测序引物5r~GAC TGT CTT TTT GAA AAG TT -3、
2.ー种应用权利要求I所述的试剂盒检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的方法，包括如下步骤 (O DNA提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 μ I PCR 扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP 3. O μ 1，上游引物O.5 μ 1，下游引物 O. 5 μ 1，rTaqO. 5μ 1，水 39. 5μ 1，模板 I. Ομ I ;循环程序为:95 0C 5min预变性；依次在95°C 30S, 55°C 30S, 72°C 30S,进行35个循环；72°C保持5min，最终保持在4 °C，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测巯嘌呤个体化用药基因多态性的试剂盒及方法。具体是指TPMT(rs1142345)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQIDNO.3—6所示的引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量TPMT(rs1142345)的检测，从而达到对巯嘌呤用药实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102676667SQ20121013536
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏