一种评价转GmDREB1抗逆小麦非预期效应的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及评价转GmDREBI抗逆小麦非预期效应的方法。
【背景技术】
[0002] 转基因植物已经广泛用于农业和食品工业，通过将外源基因引入，很多作物可W 提高其产量、抗逆性、营养成分等。尽管到目前为止，一直没有检测到由于种植转基因作物 或者消费转基因产品而带来的非预期的不良效应，但从转基因作物来源的食品却经常收到 人们的贬低，其部分原因是人们担屯、转基因食品可能存在非预期不良效应，会给人类健康 带来危害。非预期效应可能会由外源基因表达产生的次级或者其它多重效应引起，也可能 由于外源基因引入到植物基因组的插入效应引起。外源基因插入植物基因组是一个随机的 过程，该过程可能引起的非预期效应包括:物理性破坏，修饰或者沉默某些基因，失活内源 基因，激活沉默基因，形成融合蛋白，调控其它基因或者生物化学过程等。
[0003] 非生物逆境胁迫的抗逆性远比现在已经商业化的性状，如抗虫、抗除草剂等性状 要复杂的多，因为植物抗逆可能设及很多基因、设及几个信号传导途径、或者多个逆境相关 蛋白和酶等。抗逆性状的复杂性可能会增加抗逆转基因植物非预期效益发生的可能性。因 DREB转录因子调控系列重要的逆境响应基因的表达，它在提高植物抗逆性研究方面备受关 注并取得了很大的进展。自从DRE顺式作用原件首次从拟南芥发现W来，已从20多类植物中 发现40多个DR邸基因。应对逆境胁迫，DR邸基因调控下游系列逆境相关基因，形成复杂的调 控网络。但不同的DREB基因，其调控网络的成员并不相同，转DREB基因的转基因植物，其抗 逆效果也各不相同。所W外源DREB基因的引入和表达非常复杂，转DR邸基因的抗逆转基因 植物的非预期效应的检测非常重要和必要，且具有个案特点。
[0004] 关于非预期效益的检测方法，目前应用比较广泛的是组学的方法，如基因组，转录 组，蛋白质组，代谢组等。组学的方法对分子表达谱的分析更具有整体性和综合性，运就增 加了检测到非预期效应的可能性。在转基因拟南芥、水稻、玉米、大豆、西红柿、±豆、大麦 (优质）、小麦等作物的非预期效应评价中都有应用。
[0005] 虽然小麦是第二大粮食作物，随着环境不断恶化，抗逆小麦需求不断加大，抗逆转 基因小麦的研究也有了很大的进展，但抗逆转基因小麦的非预期效应评价还未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明一个目的是提供一种评价抗逆性转GmDREBI植物是否具有非预期效应的方 法。
[0007] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[000引1 )、对正常条件下培养转GmDREBI植物、逆境条件下培养转GmDREBI植物、正常条件 下培养受体植物和逆境条件下培养受体植物进行RNA-seq测序分析，得到正常条件下培养 转GmDREBI植物表达基因谱、逆境条件下培养转GmDREBI植物表达基因谱、正常条件下培养 受体植物表达基因谱和逆境条件下培养受体植物表达基因谱；
[0009] 2)、比较所述正常条件下培养转GmDREBl植物表达基因谱和所述逆境条件下培养 转GmDREBl植物表达基因谱，有差异的表达基因，记作转GmDREBl植物环境效应引起的差异 表达基因组；
[0010] 比较所述正常条件下培养受体植物表达基因谱和所述逆境条件下培养受体植物 表达基因谱，有差异的表达基因，记作受体植物环境效应引起的差异表达基因组；
[0011] 比较所述正常条件下培养转G血REB1植物表达基因谱和在所述正常条件下培养受 体植物表达基因谱，有差异的表达基因，记作正常环境转GmDREBl植物转基因效应差异表达 基因组；
[0012] 比较所述逆境条件下培养转G血REB1植物表达基因谱和所述逆境条件下培养受体 植物表达基因谱，有差异的表达基因，记作逆境环境转G血REB1植物转基因效应差异表达基 因组；
[0013] 由所述转GmDREBl植物环境效应引起的差异表达基因组和所述受体植物环境效应 引起的差异表达基因组组成环境效应引起的差异表达基因谱；
[0014] 由所述正常环境转GmDREBl植物转基因效应差异表达基因组和所述逆境环境转 GmDREBl植物转基因效应差异表达基因组组成转基因效应相关差异表达基因谱；
[0015] 比对所述转基因效应相关差异表达基因谱和所述环境效应引起的差异表达基因 谱，选取二者的差异表达基因且隶属于所述转基因效应相关差异表达基因谱的基因，记作 转基因效应引起的特异差异表达基因；
[0016] 比对所述转GmDREBl植物环境效应引起的差异表达基因组和所述受体植物环境效 应引起的差异表达基因组:将种类相同的差异表达基因记作逆境胁迫下所述转GmDREBl植 物和所述受体植物共同差异表达基因组;将种类不相同且隶属于所述受体植物环境效应引 起的差异表达基因组的差异表达基因，记作逆境胁迫下所述受体植物单独变化的环境效应 引起差异表达基因组;将种类不相同且隶属于所述转GmDREBl植物环境效应引起的差异表 达基因的差异表达基因，记作逆境胁迫下所述转GmDREBl植物单独变化的环境效应引起差 异表达基因组；
[0017] 3)分析所述转基因效应引起的特异差异表达基因、所述逆境胁迫下转GmDR邸1植 物和受体植物共同差异表达基因组、所逆境胁迫下受体植物单独变化的环境效应引起差异 表达基因组、所述逆境胁迫下转GmDREBl植物单独变化的环境效应引起差异表达基因组，
[0018] 若满足如下A或A+化C，则所述转GmDREBl植物存在非预期效应；
[0019] 若不满足A或A+化C，则所述转GmDREBl植物不存在非预期效应；
[0020] 所述A为转基因效应引起的特异差异表达基因在转GmDR邸1植物和受体植物之间 存在差异表达且该转基因效应引起的特异差异表达基因与致敏因子或毒性因子的产生相 关：
[0021] 所述B为从逆境胁迫下转GmDR邸1植物和受体植物共同差异表达基因组中选取在 逆境胁迫下在转GmDREBl植物和受体植物为同一表达模式且表达倍数不同的差异基因的功 能与抗逆无关，且能引起致敏或毒性因子的产生；
[0022] 同一表达模式为如下1)或2):
[0023] 1)共同差异表达基因组中的某基因在受到逆境胁迫后在转基因植物中的表达为 上调，且在受到逆境胁迫后在受体植物中的表达为上调；
[0024] 2)共同差异表达基因组中的某基因在受到逆境胁迫后在转基因植物中的表达为 下调，且在受到逆境胁迫后在受体植物中的表达为下调。
[0025] 所述C为所述逆境胁迫下转GmDR邸1植物单独变化的差异表达基因组和所述逆境 胁迫下所述受体植物单独变化的差异表达基因组所有基因中至少一个基因的功能与抗逆 无关，且能引起致敏或毒性因子的产生。
[00%]上述方法中，
[0027] 步骤2)中，所述比较用火山图展示或DESeq;
[0028] 所述比对采用Ven图分析；
[0029] 所述检测基因是否与抗逆无关采用GO功能分析；
[0030] 所述检测基因是否能引起致敏或毒性因子的产生采用GO功能分析或比对致敏因 子或毒性因子数据库；
[0031] 所述A中转基因效应引起的特异差异表达基因在转GmDR邸1植物和受体植物之间 存在差异表达是通过巧光定量PCR和半定量PCR确定。
[0032] 上述方法中，
[0033] 所述抗逆性为抗盐性；
[0034] 所述逆境胁迫为盐胁迫。
[0035] 上述方法中，
[0036] 所述植物为双子叶植物或单子叶植物；
[0037] 所述转GmDREBl植物为将GmDREBl基因（序列1)导入受体植物中得到的转GmDREBl 植物。
[0038] 上述方法中，所述单子叶植物为小麦。
[0039] 本文中的术语和定义如下：
[0040] 转基因植物:将外源基因导入受体植物中得到的转基因植物；
[0041 ] 转基因受体Transgenic acceptor:与转基因品种对应的转基因受体品种。
[0042] 非预期效应化intended effects :由于外源基因转入引起的预期之外的不良效 应，在本实施例中，非预期效应为GmDREBl基因导入受体植物产生的非抗逆且为致敏或毒性 的效应。
[0043] 环境效应Effects of envircmment:由于环境变化引起的转基因小麦与受体植物 之间的基因表达差异。
[0044] 转基因效应Effects of single gene insedion:由于外源基因转入引起的转基 因小麦与受体植物之间的基因表达差异。
[0045] 逆境胁迫响应Stress response of plants:转基因小麦或受体植物在某一逆境 条件下的基因表达变化。
[0046] 植物材料:转基因抗逆小麦及其受体植物品种在正常生长条件及逆境条件下收获 的种子。
[0047] 本发明的实验证明，本研究选择的转GmDREBl基因的抗逆转基因小麦T349,已经报 道和受