基因的数量远远超过由于转基因效应引起的 差异表达基因的数量。
[0086] (3)确定转基因效应引起的特异差异表达基因
[0087] 采用R软件（version 2.9.0)(Jonathan Swinton,Venn diagrams in R with 1:he Vennerable package，2009)对小麦T349环境效应引起的差异表达基因谱、济麦19环境效应 引起的差异表达基因谱、正常环境小麦T349转基因效应差异表达基因谱和盐胁迫环境小麦 T349转基因效应差异表达基因谱运4个差异表达基因谱进行Ven图分析。
[0088] 结果如图2所示，可W看出，上述(2)鉴定的转基因效应差异表达基因谱中有34个 与环境效应基因基因组重叠，仅1个(Gene id:TRAES3BF099900090Cra_g，提交日：22-AUG- 2012)，D3N/J19N的log2fold为1.0833)不重叠，认为其为转基因效应引起的特异差异表达 基因。
[0089] (4)、转基因效应引起的特异差异表达基因的差异表达及功能验证
[0090] 检测(3)获得的转基因效应引起的特异差异表达基因在转基因小麦和受体小麦之 间是否存在差异表达，统计学上P值小于0.05为显著差异；
[0091] 若所述转基因效应引起的特异差异表达基因在所述转GmDREBl植物和所述受体植 物之间的表达满足如下条件A:存在差异表达且该转基因效应引起的特异差异表达基因与 致敏因子或毒性因子的产生相关（与致敏因子或毒性因子数据库，网址：http:// WWW. ifr.化src. ac. uk/protal 1，致敏性评价方法参考文献:赵宏杰等，转基因作物标记蛋 白潜在致敏性的生物信息学预测，中国烟草学报，2010,16(3):76-79)比对），则所述转 GmDREBl植物存在非预期效应；若所述转基因效应引起的特异差异表达基因在所述转 GmDREB 1植物和所述受体植物之间的表达不满足所述条件A，则所述转GmDREB 1植物不存在 非预期效应。
[0092] 本实验检测上述（3)获得的转基因效应引起的特异差异表达基因 （Gene id: TRAES3BF099900090Cra_g，提交日：22-AUG-2012)，D3N/J19N的log2fold为 1.0833)在转基 因小麦和受体小麦中的表达量差异，具体如下：
[0093] 采用巧光定量PCR和半定量PCR(本实验二者引物相同。巧光定量PCR用巧光定量 PCR仪通过巧光信号的强弱检测目的基因表达量的高低，比较敏感;而半定量PCR是通过普 通PCR仪扩增目的基因，通过凝胶检测目的基因条带亮度，检测其表达量的高低。通常大家 用巧光定量PCR检测，优点是灵敏可靠；同时辅助半定量检测，优点是结果直观可视)检测， 具体如下：
[0094] 设计扩增Gene id:TRAES3邸099900090〔尸0_邑基因的引物如下：
[00M ] TRAE-F:GTGCACCTACCACAACCCCCCCG，
[0096] TRAE-R:CGTCCTCCTCCTCCTCTTCAGCCTCTTT 〇
[0097] 分别W正常培养转基因小麦T349(D3N)与其正常培养受体济麦19(化19N)根部的 RNA，反转录得到cDNA为模板，用上述引物进行巧光定量PCR和半定量PCR。
[0098] 结果如图3所示，A为巧光定量PCR，B为半定量PCR，可W看出，该基因在正常条件下 转基因小麦T349与其受体济麦19的根中表达量并没有显著差异(p〉0.05);表明在转基因小 麦T349根中过表达GmDREBl基因并没有引起了346538。099900090〔。0_旨基因的差异表达，说 明转基因小麦和受体小麦相比，不存在非预期效应。
[0099] 二、环境效应引起的差异表达基因的功能分析
[0100] 由于转基因小麦T349转入GmDREBl基因，其抗逆性高于其非转基因的受体小麦济 麦19，二者在应对逆境胁迫过程中，其基因表达也可能存在差异，运种差异的存在也可能引 起非预期效应的发生。因此对二者在应对逆境胁迫过程产生的差异表达基因谱进行比较和 功能分析，判断转基因小麦是否存在非预期效应，具体如下：
[0101] 比较小麦T349环境效应引起的差异表达基因谱和济麦19环境效应引起的差异表 达基因谱的差异基因，将基因种类相同的差异基因记作逆境胁迫下小麦T349和济麦19共同 差异表达基因组;不相同的基因种类且隶属于济麦19环境效应引起的差异表达基因，记作 逆境胁迫下济麦19单独变化的差异表达基因组;不相同的基因种类且隶属于转GmDREBl植 物(小麦T349)环境效应引起的差异表达基因，记作逆境胁迫下小麦T349单独变化的差异表 达基因组。
[0102] 从逆境胁迫下小麦T349和济麦19共同差异表达基因组中的选取逆境胁迫下同一 表达模式且表达倍数不同的差异基因进行功能分析，若满足条件B:逆境胁迫下同一表达模 式且表达倍数不同的差异基因的功能不与抗逆相关，且该基因能引起致敏或毒性因子的产 生，则转基因小麦存在非预期效应，若不满足条件B，则转基因小麦不存在非预期效应；
[0103] 对逆境胁迫下小麦T349单独变化的差异表达基因组和逆境胁迫下济麦19单独变 化的差异表达基因组所有基因的进行功能分析，若所述所有基因满足条条件C:至少一个基 因的功能与抗逆无关，且能引起致敏或毒性因子的产生，则所述转GmDREBl植物存在非预期 效应;若所述所有基因不满足所述条件C，则所述转GmDREBl植物不存在非预期效应。
[0104] 具体如下：
[0105] 1、差异表达基因的种类
[0106] 采用R软件（version 2.9.0)(Jonathan Swinton,Venn diagrams in R with 1:he Vennerable package ,2009)对小麦T349环境效应引起的差异表达基因谱的3198个差异基 因、济麦19环境效应引起的差异表达基因谱的3756个差异基因进行Ven图分析，得到W下Ξ 组基因：
[0107] 相同基因种类的基因，记作逆境胁迫下小麦T349和济麦19共同差异表达基因组；
[0108] 不相同的基因种类且隶属于济麦19环境效应引起的差异表达基因，记作逆境胁迫 下济麦19单独变化的差异表达基因组；
[0109] 不相同的基因种类且隶属于转GmDREBl植物(小麦T349)环境效应引起的差异表达 基因，记作逆境胁迫下小麦T349单独变化的差异表达基因组。
[0110] 结果如图4所示，转基因小麦T349及其受体济麦19在盐胁迫下共同变化的差异基 因有2707个，其中上调表达1234个，下调表达1473个，即为逆境胁迫下小麦T349和济麦19共 同差异表达基因组；
[0111] 转基因小麦T349盐胁迫下单独变化的差异基因有491个，其中上调表达257个，下 调表达234个，即为逆境胁迫下小麦T349单独变化的差异表达基因组；
[0112] 受体济麦19盐胁迫下单独变化的差异基因有1049个，其中上调表达305个，下调表 达744个，即为逆境胁迫下济麦19单独变化的差异表达基因组。
[0113] 2、盐胁迫下共同变化的差异基因分析
[0114] 1)表达模式
[0115] 依据差异表达基因的log2(Fold化ange)值，用Excell软件对转基因小麦T349和受 体济麦19盐胁迫下共同变化的2707个差异基因进行基因表达变化趋势分析。
[0116] 结果如图5所示，应对高盐胁迫，2707个共同变化的差异表达基因中，1234个基因 在转基因小麦及其受体中都表现上调，1473个基因在转基因小麦及其受体中都表现下调， 所有共同变化的差异基因变化趋势一致。
[0117] 2)表达量倍数
[0118] 依据差异表达基因的l〇g2(Fold化ange)值，用SigmaPlot软件对上述1确定的转基 因小麦T349和受体济麦19盐胁迫下共同变化的2707个差异基因进行表达量倍数检测。
[0119] 结果如图6所示，盐胁迫下转基因小麦和受体植物上调表达基因的平均变化倍数 接近，转基因小麦下调表达基因的平均变化倍数小于受体济麦19,二者之间存在差异。
[0120] 3)功能检测
[0121] 用WEG0软件对胁迫下转基因小麦和受体植物共同下调但平均下调倍数存在差异 的1473个差异基因进行生物过程GO功能分析。
[0122] 结果如图7所示，运些下调表达基因参与的生物过程主要是氧化还原过程 (oxidation-reduction process)、对氧化胁迫反应的过程（response to oxidative stress)、转录过程（translation)等，运些过程已经证明在植物应对逆境胁迫过程中发挥 非常重要的作用。逆境胁迫下，参与运些过程的基因下调倍数较小，说明植物对逆境胁迫的 耐受能力相对较高，运是转基因小麦的预期效应。
[0123] 3、盐胁迫下单独变化的差异基因分析
[0124] 因为是单独变化的基因