鼻咽癌游离ebv-dna荧光pcr检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001 ]本发明设及核酸巧光PCR检测试剂盒，尤其设及鼻咽癌游离邸V-DNA巧光PCR检测 试剂盒及其使用方法，属于鼻咽癌体外诊断领域。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌是华南和东南亚的高发肿瘤，具有种族和地域特性，我国主要集中在广东、 广西、湖南、福建等华南省份，其发病率高达25/10万/年(25人每10万人每年），平均死亡率 达2.88/10万/年，在头颈部肿瘤中高居首位，严重危害人民生命健康。研究表明EB病毒感染 与鼻咽癌密切相关。
[0003] EBV是一种瘤疹类病毒，在人群的携带率高达90%，人一旦感染后，就可能终身携 带，EBV主要感染人上皮细胞和B淋己细胞。EBV可W通过唾沫传播，其感染途径一般为:首先 在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋己细胞。运些被感染的B淋己细胞大量进入血液循 环而造成全身性感染，并可长期潜伏在人体淋己组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的 EBV活化形成复发感染。
[0004] 目前，针对鼻咽癌的临床诊断主要依靠体格检查、纤维鼻咽镜、鼻咽部CT或MRI，远 处转移主要依靠 PET/CT、胸腹部CT或胸片、腹部B超、骨扫描等检查手段，但其项目繁多而费 用昂贵，普适性较差，在此背景下，实验室诊断成为鼻咽癌诊断重要的组成部分。根据EBV与 鼻咽癌的密切关系，检测人体中EBV的存在对鼻咽癌的早期诊断有很大的价值。由于EBV分 离培养困难，目前临床一般用免疫学方法和分子生物学两种方法来辅助诊断，采用酶联免 疫吸附试验巧LISA)或免疫组化法检测血浆中特异性邸V抗体，用PCR技术对样本中邸V-DNA 载量进行检测，W确定EBV的感染。
[0005] 血浆中游离的细胞外DNA(Cell-打ee DNA，cfDNA)最早发现于1948年，Mandel等人 在健康人和患病个体中均发现了运些游离物质的存在，从而推翻了 W往认为只有细胞中才 含有遗传物质的观点。1977年，Leon首次发现肿瘤患者血清游离DNA显著高于正常人，由此 开辟了游离DNA与恶性肿瘤关系研究的新领域。基于W上认识，结合邸病毒在鼻咽癌病因和 发病中的特殊地位，Mutirangura运用巢式PCR技术在既往邸病毒感染的健康患者和确诊鼻 咽癌患者的血浆中进行游离邸V-DNA化BV-C巧NA)检测，前者均呈阴性，而后者血浆中则发 现31 %的检出率，统计显示，治疗前血浆邸VDNA的浓度与肿瘤细胞调亡呈统计学正相关，提 示血浆EBVDNA主要来源于肿瘤细胞调亡，该研究首次掲示了外周血游离EBV-DNA和鼻咽癌 的关系。chan进一步证实外周血邸V-DNA的10%-90% W82-18化P的小分子片段形式存在， 并且运种小片段邸V-DNA占总邸V-DNA的比例与鼻咽癌癌体的大小W及是否复发转移有关， 从而认为其成因是肿瘤细胞崩解后基因组DNA发生碎裂，并释放入血。总之，目前的观点认 为治疗前外周血游离EBVDNA被认为和肿瘤的坏死、调亡和增殖均相关，可W间接反映体内 肿瘤的负荷;治疗后外周血游离邸VDNA与病灶残留、复发或远处转移有关。
[0006] 随着研究的进步，2013版《头颈部鱗癌综合治疗：中国专家共识》将血浆邸V-DNA载 量检测作为鼻咽癌诊断和分期的指标之一。研究表明，鼻咽癌患者血浆邸V-DNA主要W细胞 游离DM化BV-rfDNA)的形式存在，并且邸V-cf DM已成为鼻咽癌特异性肿瘤标志物。
[0007]国内已有多种基于实时巧光定量PCR技术定量检测邸VDNA的试剂盒，但是都是检 测的EBV病毒粒子DNA，而不是EBV-cfDNA，并且运些试剂盒所提供的DNA提取方法主要是煮 沸裂解法、酪-氯仿法和膜亲和层析，有很多不足之处:煮沸裂解法要反复加热、容易爆管产 生污染;酪-氯仿法是操作繁琐，对于设备和人员操作要求高，低病毒载量的标本检出率低， 且所用试剂具有一定的毒性;膜亲和层析法需高速离屯、，还需要频繁更换离屯、管，用时长， 特异性较差;并且，运种方法对于片段大小在82-18化P的小分子片段，抽提效果不好。扩增 区域和探针类型也有差别，运导致现有方法检测灵敏度和特异性欠佳。
[000引虽然巧光实时定量PCR(FQ-PCR)是目前最适合也最常用的检测游离邸V-DNA的手 段。然而，该技术定量结果的影响因素众多，包括游离DNA的抽提、目的基因的选取、引物和 探针的设计，PCR设备、预混酶试剂的成分、循环数、标准品的选择等多个方面，需要将各个 影响因素进行优化，W达到最佳的检测效果。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于解决现有EBV巧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快 速、方法简便、检测灵敏度高的EBV-cfDNA巧光定量PCR检测试剂盒，应用该试剂盒，可W对 血清和/或血浆样品中的EBV-cfDNA进行快速检测，为鼻咽癌的诊断和治疗疗效观察提供参 考依据。
[0010] 本发明实施例中提供了一种鼻咽癌游离EBV-DNA化BV-C巧NA)巧光PCR检测试剂 盒，包括W下各组分:核酸释放剂，标准品，PCR反应液，EBV阳性对照W及EBV阴性对照，其 中，所述核酸释放剂为Tri S-HC1和/或抓TA，其中Tri S-HC1浓度为0.8mo 1/L~1.2mo 1/L， 邸ΤΑ浓度为0.1mol/L~1. Omol/L;
[0011] 所述标准品为包含EBV-EBER区域为扩增区域的质粒，其中，所述质粒的浓度为 5.00E；+07copies/mL~5.00E；+04copies/mL。
[0012] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述PCR反应液包括用于扩增祀多核巧酸的上 下游引物，W及用于祀多核巧酸检测的探针，其中，所述用于祀多核巧酸扩增的上下游引物 及用于祀多核巧酸检测的探针的碱基对序列分别为：
[0013] 上游引物：5 '-GAGAGGCTTCCCGCCTAGA-3 ' ；
[0014] 下游引物:5 ' -AAATAGCGGACAAGCCGAATA-3 ' ；
[0015] 探针：5 'FM-TCTCCCAGAGGGATTAGA-B册13 '。
[0016] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述用于祀多核巧酸扩增的上下游引物W及用 于祀多核巧酸检测的探针的浓度分别为0.2ymol/L~0.4ymol/L和0.2ymol/L~0.4ymol/L。
[0017] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述PCR反应液还包括5XPCR反应缓冲液， 0.8mmol/L脱氧核糖核巧Ξ憐酸，511/化~洲/μL Tth DNA聚合酶和lU/yL~7υ/μΙ H-Taq DNA聚合酶。
[001引优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述标准品的浓度为5.00E+04copies/mL， 5.00E；+05copies/mL，5.00E；+06copies/mL和/或 5.00E；+07copies/mL。
[0019]优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述邸V阳性对照为阴性血清稀释的B958细胞 的培养上清，其浓度为1.00~5.00化05copies/mL。
[0020] 优选的，上述的检测试剂盒，其中，所述邸V阴性对照为阴性血清。
[0021] 本发明实施例中还提供了使用上述的检测试剂盒用于检测样本中游离邸V-DNA的 方法，其包括如下步骤：
[0022] (1)制备待测样本
[0023] 制备血浆样本:选用抓TA抗凝全血，于抽血后1.5~2.5小时内在1800~2200巧m/ min的条件下离屯、2~4分钟，吸取上清，并移至干净EP管中，在18000~22000巧m/min条件下 高速离屯、8~12分钟去除细胞碎片，随后将上清转移于一新的EP管中备用;和/或
[0024] 制备血清样本:选用新抽取的静脉血，常溫放置25~35分钟后，于1800~2000巧m/ min条件下离屯、2~4分钟，吸取上清，并移至干净EP管中备用；
[0025] (2)处理样本和配置PCR反应体系
[00%] (a)取化L~如L核酸释放剂和祉L~12化步骤（1)中制备的待测样本，充分混合均 匀，于室溫放置3~5分钟，备用；
[0027] (b)分别取化L~祉L核酸释放剂和化L~lOul阴性对照，6化~祉L核酸释放剂和化 L~10化阳性对照W及化L~10化核酸释放剂和化L~10化标准品，充分混合均匀，于室溫放 置3~5分钟，备用；
[002引（C)根据待测样本，阴性对照，阳性对照和标准品的数量，配置PCR反应液，其中， PCR反应液包括5 X PCR反应缓冲液，0.8mmol/L脱氧核糖核巧Ξ憐酸，5UAiL~洲AiL Tth DM聚合酶，lU/yL~7υ/μΙ H-Taq DM聚合酶，0.2ymol/L~0.4ymol/L用于扩增祀多核巧酸 的上游引物W及下游引物，0.2皿ol/L~0.4ymol/L用于祀多核巧酸检测的探针，其中PCR反 应缓冲液包括Tris-HCl，其浓度为lOOmmol/L，抑8，KC1，其浓度为15mmol/L，W及MgCl2,其