一种水稻核苷酸片段人工加接头的方法与流程

本发明属于水稻基因工程领域，可直接应用于水稻转基因载体构建。

背景技术：

基因工程中，将目的片段连接到工程载体上是最基础的步骤。目前，在水稻基因工程中，将目的片段连接到载体上的比较常用的方法是同源重组法。该方法需要在目的片段的两端加上重组位点的同源序列和线性化质粒酶切位点序列，长度为16bp左右。这段16bp的序列就是基因工程操作中的接头。通常人工加接头的方法是将扩增目的片段的前后引物的5’端连上这16bp序列一起合成，然后进行PCR扩增。但是用这种传统加接头的方法对于大片段(5000bp以上)成功率较低。

技术实现要素：

针对上述现有技术中存在的不足之处，本发明提供了一种可以显著提高人工加接头成功率的水稻核苷酸片段人工加接头的方法。该方法可以有效解决传统方法加接头成功率低的问题，有力推进载体构建进程。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

一种水稻核苷酸片段人工加接头的方法，该方法包括如下步骤：

1)以含目的片段的水稻基因组或者cDNA为模板，该片段用P1表示，模板用D1表示，用扩增目的片段的前后引物、高保真酶进行PCR扩增，该前后引物分别用S1F和S1R表示；经1％琼脂糖胶电泳检测胶回收与预期大小一致的条带，胶回收产物用P2表示；

2)将S1F和S1R分别与包含有重组位点同源序列、线性化质粒酶切位点序列的接头连接，进行人工合成，前后引物的接头分别用J1和J2表示；合成的带接头的引物用S2F和S2R表示；

3)以P2为模板，S2F和S2R为引物，用高保真酶进行PCR扩增；经1％琼脂糖胶电泳检测、胶回收与预期大小一致的条带，胶回收产物用P3表示；

4)P3就是在目标片段两侧加上接头的目的产物，用它与线性化的质粒连接，进行后面的基因工程操作。

本发明的有益效果是：可以显著提高给水稻核苷酸片段人工加接头的成功率，加快载体构建进程。

附图说明

图1为一种水稻核苷酸片段人工加接头的方法的流程图；

图2为实例扩增的P1产物(B泳道，7421bp)和带有接头的P3产物(A泳道，7453bp)的示意图。

具体实施方式

一种水稻核苷酸片段人工加接头的方法，其流程如图1所示，该方法包括如下步骤：

1)以含目的片段的水稻基因组或者cDNA为模板，该片段用P1表示，模板用D1表示，用扩增目的片段的前后引物、高保真酶进行PCR扩增，该前后引物分别用S1F和S1R表示；经1％琼脂糖胶电泳检测胶回收与预期大小一致的条带，胶回收产物用P2表示；

2)将S1F和S1R分别与包含有重组位点同源序列、线性化质粒酶切位点序列的接头连接，进行人工合成，前后引物的接头分别用J1和J2表示；合成的带接头的引物用S2F和S2R表示；

3)以P2为模板，S2F和S2R为引物，用高保真酶进行PCR扩增；经1％琼脂糖胶电泳检测、胶回收与预期大小一致的条带，胶回收产物用P3表示；

4)P3就是在目标片段两侧加上接头的目的产物，用它与线性化的质粒连接，进行后面的基因工程操作。

实施例

水稻日本晴LOC_OS10g31910基因含启动子及3’端全长7500bp左右，传统方法很难将如此大的片段一次性加上接头。采用了本发明所述方法：

1、以引物S1F：TCTACACACGTAAACTTTCAACT和S1R：TGGCACATTGTAGCTGTAGAC扩增日本晴，目标克隆水稻LOC_OS10g31910基因上游启动子区(1545bp，[001]段序列)、LOC_OS10g31910序列(5004bp，[002]段序列)和下游872bp([003]段序列)，目标片段全长7421bp。经第1轮PCR(Tm＝58℃)，顺利扩增并胶回收P2(图2中的B泳道)。

2、以引物对S2F：TCTACACACGTAAACTTTCAACT(下划线部分为EcoRI酶切位点，斜粗体序列为接头J1)和S2R：TGGCACATTGTAGCTGTAGAC(下划线部分为BamHI酶切位点，斜粗体序列为接头J2)，P2为模板，经第2轮PCR(Tm＝58℃)顺利扩增出含接头的P3(图2中的A泳道，7453bp)。

3、将P3与线性化的空载质粒2300连接，进行互补载体构建。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

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