一种尿嘧啶dna糖苷酶、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种尿嘧啶DNA糖苷酶、制备方法及其 应用。
【背景技术】
[0002] 核酸体外扩增技术作为分子生物学和基因工程技术的基石，极大的促进了现在生 命科学研究的发展。PCR作为一种最为常见的高效核酸扩增技术，其出现使得体外快速制备 特定DNA分子成为可能，目前广泛应用于各种核酸扩增与检测领域，极大地促进了核酸诊 断技术、现代基因工程、重组蛋白质工程的发展。为了进一步改善PCR性能，目前开发了多 种新型PCR扩增技术。其中PCR反应体系优化，例如通过加入二甲基亚砜（DMSO)、优化镁离 子浓度等，能够在一定程度上改善PCR性能，但也存在通用性、重复性差等问题，特别是更 换目的基因片段后，通常需要重新优化这些PCR反应条件。另外，热启动DNA聚合酶通过抑 制常温下的酶活性，减弱非特异性扩增产物和引物二聚体等副产物，增加目的DNA扩增产 量。
[0003] 在PCR过程中，高温会使4种脱氧核苷三磷酸中的脱氧胞嘧啶核苷三磷酸（dCTP) 水解脱氨，生成脱氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP)，其被DNA聚合酶掺入新合成的DNA分子中后 以尿嘧啶碱基形式存在，尿嘧啶碱基严重抑制B型DNA聚合酶活性，最终降低DNA有效扩增 长度和扩增产量。鉴于各种高忠实性的B型DNA聚合酶在PCR中广泛使用，因此必须解决 这一问题，从而提高B性DNA聚合酶的扩增性能。
【发明内容】
[0004] 为了克服B型DNA聚合酶活性受尿嘧啶碱基严重抑制的问题，本发明的目的在于 提供一种尿嘧啶DNA糖苷酶、制备方法及其应用；本发明的尿嘧啶DNA糖苷酶使其广泛应用 于各种B型DNA聚合酶的PCR扩增实例中。该PCR扩增技术具有通用性广、综合性能优良 等特点；不仅能显著提高多种商品化DNA聚合酶的PCR产量，还可以增加 PCR扩增片段有效 扩增长度。
[0005] 本发明对各种B型DNA聚合酶的PCR扩增技术的改善原理在于：尿嘧啶DNA糖苷 酶能将DNA分子中的尿嘧啶碱基从脱氧核糖上水解切除，从而消除DNA中尿嘧啶对DNA聚 合酶的抑制作用，提高PCR产量和DNA有效扩增长度。
[0006] 本发明的技术方案具体如下。本发明提供一种尿嘧啶DNA糖苷酶，其为嗜热微生 物的尿啼啶DNA糖苷酶；所述嗜热微生物为火球菌（Pyrococcus furiosus)或敏捷气热菌 (Aeropyrum pernix);其中：火球菌的尿啼啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所 示；敏捷气热菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0007] 本发明还提供一种编码上述尿嘧啶DNA糖苷酶的基因，编码火球菌的尿嘧啶DNA 糖苷酶的基因如SEQ ID NO: 1所示；编码敏捷气热菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的基因如SEQ ID NO: 2所示。
[0008] 本发明进一步提供一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，具体步骤如下：
[0009] (1)构建尿嘧啶DNA糖苷酶的重组表达质粒
[0010] 基于嗜热微生物编码的尿嘧啶DNA糖苷酶基因序列，设计引物，扩增基因，并将基 因克隆到原核表达载体PET28,构建尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒；
[0011] (2)重组表达尿嘧啶DNA糖苷酶
[0012] 将构建的尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21 (DE3)，得 到尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行菌尿嘧啶DNA糖苷酶诱导表 达；
[0013] (3)亲和纯化表达的尿嘧啶DNA糖苷酶
[0014] 离心收集诱导表达尿嘧啶DNA糖苷酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂 解液，超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌自身蛋白，离心收集含有尿嘧啶DNA糖苷酶的大 肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中分别纯化尿嘧啶DNA糖 苷酶；
[0015] (4)检测尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和热稳定性。
[0016] 将纯化后尿嘧啶DNA糖苷酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出95°C下特异 性切除尿嘧啶碱基的酶活性半衰期不低于30分钟的尿嘧啶DNA糖苷酶。
[0017] 上述步骤（1)中，所述嗜热微生物为火球菌或敏捷气热菌。
[0018] 上述步骤（2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将尿嘧啶DNA糖苷 酶重组表达菌株培养至〇D6。。= 0. 4-1. 0,再加入0. 5mM诱导剂IPTG在37°C温度下培养3小 时或22°C温度下培养12小时进行诱导表达。
[0019] 上述步骤⑶中，所述非变性蛋白裂解液的组成如下：20mM pH值为8.0的 Tris-HCl, 300mM NaCl，0.5mM DTT，10vol%甘油。
[0020] 本发明还进一步提供上述的尿嘧啶DNA糖苷酶于B型DNA聚合酶的PCR扩增技术 中的应用；优选的，所述B型DNA聚合酶为Pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶或Vent DNA聚 合酶。
[0021] 上述应用时的具体方法如下：在B型DNA聚合酶催化的PCR反应体系中加入尿嘧 啶DNA糖苷酶，扩增目标基因。利用1 %琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果，测定尿嘧啶DNA糖 苷酶对PCR的改良效果。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0023] (1)通用性好，由于尿嘧啶DNA糖苷酶针对DNA中尿嘧啶碱基对DNA聚合酶活性的 抑制缺陷，进行改良设计；因此能够显著改善所有B型DNA聚合酶的PCR扩增性能，并不局 限于某一 DNA聚合酶，能够显著改良多种商品化B型DNA聚合酶的PCR扩增产量和DNA有 效扩增长度。
[0024] (2)尿嘧啶DNA糖苷酶不仅能够增加 PCR扩增产量，还能够增加 DNA有效扩增长 度，特别适用于长片段DNA的PCR扩增。
【附图说明】
[0025] 图1是火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活测定图。
[0026] 图2是火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶的热稳定性图。
[0027] 图3是火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶对Pfu DNA聚合酶催化PCR的促进作用图示。
[0028] 图4是火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶对KOD DNA聚合酶催化PCR的促进作用图示。
[0029] 图5是敏捷气热菌尿嘧啶DNA糖苷酶对Vent DNA聚合酶催化PCR的促进作用图 不。
【具体实施方式】
[0030] 以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本 发明的限定。
[0031 ] 实施例1火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶的制备
[0032] 第一步，设计合成火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶基因，并插入pET28表达载体，构建尿 嘧啶DNA糖苷酶的重组表达质粒。重组火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶N端带有来源于pET28载 体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化。
[0033] 火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶的基因序列如SEQ ID NO :1所示。
[0034] 第二步，重组表达火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶。将火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶重组表 达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21 (DE3)，得到火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株。将 表达菌株培养至0D6。。= 0. 6,加入0. 5mM诱导剂IPTG，在37°C温度下培养3小时，诱导尿嘧 啶DNA糖苷酶表达。
[0035] 火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶重组蛋白的氨基酸序列（氮端一碳端）如SEQ ID NO: 3 所示