。
[0036] 第三步，火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶亲和纯化。将步骤二诱导后的大肠杆菌离心 收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液（20mM Tris-HCl，pH 8.0,300mM NaCl，0.5mM DTT， IOvol %甘油）。超声波破碎菌体，70°C温度下加热失活大肠杆菌蛋白，离心收集含有火球菌 尿嘧啶DNA糖苷酶的菌体裂解上清液。利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化火球菌尿嘧啶 DNA糖苷酶。
[0037] 第四步，检测火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和热稳定性。利用含尿嘧啶碱基 的寡核苷酸作为底物，测定火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶水解尿嘧啶与脱氧核糖间糖苷键的活 性。具体活性结果见图1。结果表明火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶具有高效水解尿嘧啶与脱氧 核糖间糖苷键的活性，Sng的尿嘧啶DNA糖苷酶就可以在5分钟内完全去除寡核苷酸上的尿 嘧啶碱基。
[0038] 在此基础上，检测火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶的热稳定性。将火球菌尿嘧啶DNA糖 苷酶在不同温度保温30分钟，然后测定其剩余的酶活性大小。火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶重 组蛋白的热稳定性结果见图2,结果表明其在95°C保温30分钟后的剩余活性为65%，能够 在PCR中去除DNA中的尿嘧啶碱基。
[0039] 实施例2基于火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶和Pfu DNA聚合酶的高效PCR扩增技术
[0040] 利用纯化的火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶改善Pfu DNA聚合酶催化的PCR反应，建立 Pfu DNA聚合酶的高效PCR扩增技术。扩增目的基因为大肠杆菌核酸酶IV基因，PCR反应缓 冲液：20mM Tris-HCUpH 8.8)，IOmM(NH4)2SO4, IOmM KC1，0. lmg/mL BSA，0. 1% (v/v)Triton X-100, 2mM MgSO4;其它组分为0. 2mM dNTP，0. 3 μ M引物，20ng大肠杆菌基因组DNA，2. 5单 位Pfu DNA聚合酶，0, 50, 200ng尿嘧啶DNA糖苷酶。PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图片 见图3,结果表明火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶使PCR扩增产量增加3-4倍。
[0041 ] 实施例3基于火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶和KOD DNA聚合酶的高效PCR扩增技术
[0042] 利用纯化的火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶改善KOD DNA聚合酶催化的PCR反应，建立 KOD DNA聚合酶的高效PCR扩增技术。扩增目的基因为大肠杆菌外切核酸酶III基因，PCR 反应缓冲液：20mM Tris-HCUpH 8. 8)，IOmM(NH4)2SO4, IOmM KCl，0.1mg/mL BSA，0.1% (v/ v)Triton X-100,2mM MgSO4;其它组分为(X2mM dNTP，(X3yM 引物，20ng 大肠杆菌基因组 DNA，2. 5单位KOD DNA聚合酶，200ng尿嘧啶DNA糖苷酶。PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳 图片见图4,结果表明火球菌尿嘧啶DNA糖苷酶使PCR扩增产量增加5-6倍。
[0043] 实施例4基于敏捷气热菌尿嘧啶DNA糖苷酶和KOD DNA聚合酶的高效PCR扩增技 术
[0044] 按照实施例1的工艺，制备敏捷气热菌尿嘧啶DNA糖苷酶，该蛋白氨基酸序列（氮 端一碳端）如SEQ ID N0:4所示，编码该酶蛋白的基因序列如SEQ ID N0:2所示。利用纯 化的敏捷气热菌尿嘧啶DNA糖苷酶改善Vent DNA聚合酶催化的PCR反应，建立Vent DNA 聚合酶的高效PCR扩增技术。扩增目的基因选择长片段基因一一大肠杆菌ung基因，PCR反 应缓冲液：20mM Tris-HCUpH 8. 8)，IOmM(NH4)2SO4, IOmM KCl，0.1mg/mL BSA，0.1% (v/v) Triton X-100,2mM MgSO4;其它组分为0. 2mM dNTP，0. 3μΜ引物，20ng大肠杆菌基因组DNA， 2. 5单位Vent DNA聚合酶，200ng尿嘧啶DNA糖苷酶。PCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳图片 见图5,结果表明敏捷气热菌尿嘧啶DNA糖苷酶使长度为0. 6kb的大肠杆菌ung基因的PCR 扩增产量约增加2-3倍。
【主权项】
1. 一种尿嘧啶DNA糖苷酶，其特征在于，其为嗜热微生物的尿嘧啶DNA糖苷酶；所述嗜 热微生物为火球菌或敏捷气热菌；其中：火球菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQ IDNO: 3所示；敏捷气热菌的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。2. -种编码权利要求1所述尿嘧啶DNA糖苷酶的基因，其特征在于，编码火球菌的尿嘧 啶DNA糖苷酶的基因如SEQIDNO: 1所示。3. -种编码权利要求1所述尿嘧啶DNA糖苷酶的基因，其特征在于，编码敏捷气热菌的 尿嘧啶DNA糖苷酶的基因如SEQIDNO: 2所示。4. 一种尿嘧啶DNA糖苷酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下： (1) 构建尿嘧啶DNA糖苷酶的重组表达质粒 基于嗜热微生物编码的尿嘧啶DNA糖苷酶基因序列，设计引物，扩增基因，并将基因克 隆到原核表达载体PET28,构建尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒； (2) 重组表达尿嘧啶DNA糖苷酶 将构建的尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21 (DE3)，得到尿 嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行菌尿嘧啶DNA糖苷酶诱导表达； (3) 亲和纯化表达的尿嘧啶DNA糖苷酶 离心收集诱导表达尿嘧啶DNA糖苷酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解 液，超声波破碎菌体，加热失活大肠杆菌自身蛋白，离心收集含有尿嘧啶DNA糖苷酶的大肠 杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中分别纯化尿嘧啶DNA糖苷 酶； (4) 检测尿嘧啶DNA糖苷酶的酶活性和热稳定性。 将纯化后尿嘧啶DNA糖苷酶进行酶活性和热稳定性检测，从中筛选出95°C下特异性切 除尿嘧啶碱基的酶活性半衰期不低于30分钟的尿嘧啶DNA糖苷酶。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（1)中，所述嗜热微生物为火球 菌或敏捷气热菌。6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)中用诱导剂IPTG进行诱导 培养的具体条件为：先将尿嘧啶DNA糖苷酶重组表达菌株培养至0D_= 0. 4-1. 0,再加入 0. 5mmol/L诱导剂IPTG在37°C温度下培养3小时或22°C温度下培养12小时进行诱导表 达。7. -种权利要求1所述的尿嘧啶DNA糖苷酶于B型DNA聚合酶的PCR扩增技术中的应 用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述B型DNA聚合酶为PfuDNA聚合酶、 KODDNA聚合酶或VentDNA聚合酶。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，具体为一种尿嘧啶DNA糖苷酶、制备方法及其应用。本发明中提供的尿嘧啶DNA糖苷酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO:3或SEQ？ID？NO:4所示。本发明的有益效果在于：技术通用性好，尿嘧啶DNA糖苷酶可以切除DNA中的尿嘧啶碱基，解除其对B型DNA聚合酶的抑制作用，改善所有B型DNA聚合酶的PCR，能提高PCR扩增产量2-6倍，增加DNA片段有效扩增长度2-3倍。反应体系兼容性好，尿嘧啶DNA糖苷酶和DNA聚合酶均为热稳定性蛋白，二者的热稳定性相一致，能够最大地发挥2种酶的活性，达到最佳的PCR扩增效果。
【IPC分类】C12N15/56, C12N9/24, C12N15/10
【公开号】CN105176946
【申请号】
【发明人】刘喜朋, 杜飞
【申请人】苏州旷世骏弛生物科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月16日