一种菊粉酶突变体及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种菊粉酶及其制备方法。
【背景技术】：
[0002] 低聚果糖（Fructooligosaccharides)，简称F0S，又称寡果糖或鹿果三糖族低聚 糖，分子式为：G-F-Fn，n= 1~3(G为葡萄糖，F为果糖）。它是由β-D-果糖基通过β-2, 1 糖苷键连接而成的直链低聚糖。目前，工业上生产低聚果糖的两种方法，酶法转化蔗糖合成 的蔗果低聚糖和由菊粉部分水解得到的全果糖低聚糖。二者在结构上稍有不同，但生理功 能基本一样。都具有很多对人体有益的功能，如它热量低，促进矿物质吸收，不引起龋齿，降 血脂，润肠通便，是双歧杆菌的增殖因子等，不易引起血糖波动，作为糖尿病人甜味剂等，被 誉为营养、保健、疗效三位一体的21世纪健康新糖原。所以低聚果糖的工业化生产对促进 我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。
[0003] 菊粉（Inulin)又称菊糖，主要来源于菊芋、菊苣等植物，是由D-呋喃果糖分子经 β -2, 1糖苷键脱水聚合而成的线性直链多糖，其还原端含有一个葡萄糖残基，呈直链结构， 聚合度通常在2~60,分子量为3000~5000碳单位，是一种功能性果聚糖和水溶性膳食纤 维。菊粉作为一种纯天然的功能性食品配料，已被世界20多个国家批准为营养增补剂，广 泛运用于乳制品、饮料、低脂低热量食品、焙烤食品、保健食品等。2009年，中国卫生部批准 菊粉为新资源食品。
[0004] 目前报道产菊粉酶的微生物包括鲁维酵母属、海洋酵母属、青霉属、曲霉属、芽孢 杆菌属、梭状芽孢杆菌属、节杆菌属、放线菌属等。但是通过野生型筛选、理化诱变和工艺条 件优化的手段得到的菊粉酶普遍活力不高。基因工程手段是提高菊粉酶活性的有效途径之 一。利用重组DNA技术菊粉酶基因酵母菌进行克隆和表达，实现菊粉酶的高效表达。目前 国内江门量子高科、山东保龄宝、武汉盛世天元等单位生产低聚果糖所用的酶均来自国外 少数几个酶制剂厂，进口价格昂贵。因此，菊粉酶制剂国产化对于低聚果糖的生产和应用显 得非常重要。
[0005] 酶法转化蔗糖工业化大规模合成的蔗果低聚糖，反应的副产物葡萄糖是酶的抑制 剂，反应进行不彻底，混合物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖占总量< 55%~60% (干 基），且工艺复杂、生产成本高。而本专利所涉及到的菊粉酶，可高效水解菊粉长链为低聚 糖，还不增加单糖副产物，低聚果糖含量高达95. 78%以上，工艺简单，是一种生产低聚果糖 的新工艺。
【发明内容】
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[0006] 本发明解决上述问题所采用的技术方案之一，是提供一种通过基因工程手段获得 的酶活性显著提高的菊粉酶突变体，其氨基酸序列如核苷酸序列表SEQ ID NO :5所示。本 发明以黑曲霉NRRL3135总RNA为模板逆转录扩增出菊粉酶基因，经密码子优化后，继而利 用易错PCR等体外分子定向进化技术，对菊粉酶基因 inul进行分子改良，并对获得的突变 位点进行定点突变组合，以期获得酶活力提高或酶学性质改善的优良突变体。目前报道的 文献中，未有采用此方法来提高菊粉酶酶活。
[0007] 本发明解决上述问题所采用的技术方案之二，是提供一种生产方案一所述菊粉酶 突变体的基因工程菌。
[0008] 在本发明中采用如下定义：
[0009] 1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0010] 使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认 IUPAC命名法。
[0011] 2、菊粉酶突变体的标识
[0012] 采用"原始氨基酸位置替换的氨基酸"来表示菊粉酶突变体中突变的氨基酸。如 Thrl02Ser，表示位置102位的氨基酸由亲本菊粉酶的Thr替换成Ser，位置的编号对应于 SEQ ID N0:3中菊粉酶的氨基酸序列编号。如Thrl02Ser/Thr204Ser，表示位置102和位置 204的氨基酸都发生了突变。
[0013] 在本发明中，inul表示菊粉酶的原始氨基酸序列（如SEQ ID NO :3所示），inul' 表示菊粉酶突变体的氨基酸序列（如SEQ ID NO :5所示）。
[0015] 用于表达所述的菊粉酶及其突变体的克隆载体和表达载体为PPIC9K ;用于所述 的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母GS115。
[0016] 本技术方案的实验步骤概述如下：
[0017] (1)采用PCR技术以黑曲霉NRRL3135总RNA为模板，逆转录合成第一链CDNA，并 以第一链cDNA为模板设计引物，扩增获取菊粉酶基因，插入pPIC9K克隆载体上构建重组质 粒，转入E. coli JM109,测序鉴定菊粉酶基因 inul ;
[0018] (2)以上述构建正确的重组质粒为基础优化菊粉酶编码基因 inul，并通过全基因 合成技术获得密码子优化的菊粉酶编码基因 inul' ；
[0019] (3)在体外利用易错PCR技术向密码子优化的黑曲霉菊粉酶基因 inul'引入核苷 酸突变；
[0020] (4)将易错PCR产物及其PPIC9K表达载体用EcoR I和Not I双酶切后连接，连接 产物转入E. coli JM109构建易错PCR突变体库，采用抗生素筛选突变质粒；
[0021] (5)将突变质粒经限制性内切酶Sal I线性化后，电转化毕赤酵母GS115感受态细 胞，构成突变文库；
[0022] (6)采用BMMYI平板和96孔板筛选菊粉酶活性较高的菌株；
[0023] (7)通过定点突变的方法，对上述酶活较高菌株的突变位点进行组合，将含有上述 突变位点组合的基因与载体PPIC9K连接，电转化毕赤酵母GS115,以获得菊粉酶高效分泌 表达的菌株。
[0024] 本发明解决上述问题所采用的技术方案之三，是提供一种技术方案一所述菊粉酶 突变体的生产方法，具体如下：
[0025] 以技术方案二所获菌株为生产菌株；
[0026] 种子培养：二级种子培养，OD6。。测定为10时，用于发酵罐接种；
[0027] 发酵罐准备：以BSM培养基为发酵培养基，添加微量元素 PTMl母液，接种量2%~ 10%，pH 4.0~7. 5,发酵温度为25~37°C，DO维持20%以上。
[0028] 菌体生长阶段：发酵培养基中甘油耗尽后，DO快速上升，随即进入补料生长阶段；
[0029] 补料生长阶段：流加50 %甘油，每升甘油中事先添加了 12mL微量元素 PTMl母液， 初始流加速度为3. 0~9. OmL/min ;当DO低于20 %时停止流加，待甘油再次耗尽，DO快速 上升后，使菌体保持饥饿状态lh，然后进入诱导产酶阶段；
[0030] 诱导产酶阶段：流加甲醇，每升甲醇中事先添加了 12mL微量元素 PTMl母液，初始 流加速率为1. 2~3. 6mL/min，当DO低于20%时停止流加，待甲醇耗尽，DO快速上升后，重 新开始流加，流加速率提高至3. 6~7. 3mL/min，2h后流加甲醇速率提高至7. 3~10. 9mL/ min，诱导70~96h后发酵结束。
[0031] 本发明的有益效果如下：
[0032] 1、本发明中采用密码子优化、易错PCR及定点突变技术在体外对菊粉酶编码基因 inul进行定向进化，筛选出菊粉酶活性显著提高的突变体，突变体KMt值为出发菌株菊粉 酶的3. 1倍。
[0033] 2、本发明所述酶的制备过程易于实施且产酶效率高，30m3体系下发酵液酶活达 60000-65000U/mL〇
【附图说明】：
[0034] 图1不同Mn2+浓度下的易错PCR ;
[0035] 其中，M-GeneRuler I kb DNA Ladder ; 1-对照；2-7 :分别为不同 Mn2+浓度下 (0· 05mmol/L, 0. lmmol/L, 0. 15mmol/L, 0. 2mmol/L, 0. 25mmol/L, 0. 3mmol/L)的 PCR 产物
[0036] 图2重组质粒的单酶切（Nco I)验证；
[0037] M-GeneRuler Ikb DNA Ladder
[0038] 图3以重组菌的基因组为模板进行的PCR验证；
[0039] 其中，M-GeneRuler Ikb DNA Ladder ;1_