一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法。

背景技术：

目前主要通过敲除鸭疫里默氏杆菌的基因来研究该基因的功能，进而研究鸭疫里默氏杆菌的致病机理。将细菌某个基因敲除后通常会引起它的表型发生改变，但有些表型变化可能是由于被敲除的基因影响了其它基因的转录表达所导致。因此，我们在敲除某个基因时，还需要对这个基因进行回补，来确定该基因的功能。对于像大肠杆菌等细菌可以通过氯化钙转化法直接将重组质粒导入细菌细胞内。但鸭疫里默氏杆菌要求比较严格，目前主要通过结合转移的方法导入重组质粒。这种方法需要利用大肠杆菌作为供体菌，且步骤繁琐、耗时过长等给鸭疫里默氏杆菌研究带来诸多不便。基于此技术背景，因此急需一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，该方法简单，周期短。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，构建含有目的基因的重组穿梭质粒，然后加入含有MgCl₂的活化的鸭疫里默氏杆菌菌液中，37℃孵育30分钟，然后加入含MgCl₂的GCB培养基孵育7小时，然后涂布在含对应抗性固体GCB培养基上，37℃培养箱培养18-24h至单克隆长出，即获得鸭疫里默氏杆菌回补菌株；所述穿梭质粒为能够在鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌中稳定存在的质粒。

本发明中，所述穿梭质粒为含有鸭疫里默氏杆菌复制起始基因的质粒。

进一步，所述穿梭质粒为pLMF03，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明中，所述MgCl₂的浓度为5mM。

本发明中，活化鸭疫里默氏杆菌的方法如下：从-80℃取出鸭疫里默氏杆菌在血平板上复苏至菌落长出，用接种环挑取单克隆菌落接种至GCB液体培养基中培养过夜；调整OD600＝1，得活化鸭疫里默氏杆菌。

本发明中，所述目的基因为鸭疫里默氏杆菌RA0C_1193基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明中，所述重组穿梭质粒由以下方法制备：将SEQ ID NO.4所示序列经NcoI和XbaI酶切位点连入pLMF03质粒NcoI和XbaI酶切位点制得。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，该方法载体重组后不需要转入供体菌，直接可以进入宿主菌并发挥相关基因功能；并且培养周期短，一般情况下18小时就能分离到回补候选株克隆；所需成本较低，为研究鸭疫里默氏杆菌基因功能提供了有力的工具。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为穿梭质粒pLMF03图谱。

图2为PCR鉴定穿梭质粒pLMF03转入ATCC11845后长出来的转化子的电泳图(第1-9泳道为随机选取的9个转化子，质粒pLMF03为阳性对照，ATCC11845野生株为阴性对照；)

图3为PCR扩增出的RA0C-1193基因片段的电泳图(第1泳道DNA marker；第二泳道RA0C-1193基因片段)。

图4为用限制性内切酶NcoI和XbaI酶切质粒pLMF03和RA0C-1193基因片段，回收酶切产物的电泳图(第1泳道为酶切后的质粒pLMF03，第2泳道为酶切后的RA0C-1193基因片段)。

图5为载体pLMF03与目的基因RA0C-1193连接后转入DH5α长出来的转化子的鉴定电泳图(第1-6泳道为随机挑取的6个转化子，7泳道为阳性对照；ATCC11845野生株为阳性对照)。

图6为重组质粒酶切后的电泳图。

图7为自然转移长出来的转化子鉴定的电泳图(1-5为转化子为模板；6为质粒pLMF03为模板；7为鸭疫里默氏杆菌ATCC11845为模板)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

穿梭质粒的准备：首先从-80℃取出带有穿梭质粒pLMF03(图1，SEQ ID NO.7)的宿主菌DH5α(本实验室保存)在LB平板上，待其生长起来后，用接种环挑取单克隆菌落接种至4ml液体LB培养基中培养过夜；然后用质粒小提试剂盒(购自天根)对过夜培养的菌液进行质粒的提取，并测浓度。

受体菌的制备：首先从-80℃取出鸭疫里默氏杆菌ATCC11845野生株(本实验室保存)在血平板上复苏，待其生长起来后，用接种环挑取单克隆菌落接种至10ml液体GCB培养基培养过夜；将其调整为OD600＝1，并加入5mMMgCl₂混匀备用。

自然转移：取两个1.5ml无菌离心管，一个作为实验组，一个作为对照组，分别加入300μl(含5mM MgCl₂)上述菌液，其中实验组分别加入1μg的穿梭质粒pLMF03，对照组不加。封口胶密封并置于37℃培养箱孵育30分钟；取出孵育30分钟的实验组和对照组，分别向其中加入700μl含有5mM MgCl₂的GCB培养基，即定容至1ml，封口胶密封，37℃培养箱孵育7小时。

培养基的制备：4个含头孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)抗性的GCB固体培养基。

从实验组和对照组分别取出100μl菌液，分别用一次性涂布棒涂在含头孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)的GCB固体培养基上，将培养基置于37℃培养箱培养18h至单克隆长出。

阳性结合子的筛选及鉴定：经观察发现，在含头孢西丁抗性的培养基上，实验组长出了明显的单克隆菌落，而对照组没有，挑取9个单克隆分离在新的含头孢西丁抗性的GCB固体培养基上，37℃培养箱培养过夜。

将挑取的单克隆进行PCR扩增cfxA部分片段(SEQ ID NO.1)，PCR鉴定引物如下：

cfx p1：5’-ggtgctgcaatgttgatg-3’(SEQ ID NO.2)；

cfx p2：5’-ccgctaaggtataactg-3’(SEQ ID NO.3)；

PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；再72℃后延伸8min；16℃保存；同时以质粒pLMF03为阳性对照，ATCC11845野生株为阴性对照，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。结果显示，穿梭质粒pLMF03能够成功导入鸭疫里默氏杆菌ATCC11845野生株。

实施例2、回补鸭疫里默氏杆菌RA ATCCΔRA0C-1193

构建重组质粒：在NCBI上查找RA ATCC11845株的RA0C-1193基因(约861bp)，序列如SEQ ID NO.4所示：然后设计扩增目的基因的引物，具体引物如下：

p1：5’-catgccatggatgagccaaaccataaatac-3’(SEQ ID NO.5)，下划线表示NcoI；

p2：5’-ctagtctagattagaaagtgattttgtaagtgcctg-3’(SEQ ID NO.6)下划线表示XbaI；

然后以鸭疫里默氏杆菌ATCC11845基因组为模板，p1和p2为引物扩增目的基因片段，PCR扩增程序如下：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；再72℃后延伸10min；最后16℃保存；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。结果显示，扩增获得约861bp大小条带，PCR产物大小与预期大小相符。

用限制性内切酶NcoI和XbaI酶切质粒pLMF03和目的基因片段，回收酶切产物，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。结果显示，酶切产物成功回收。

用T4连接酶连接载体片段pLMF03与目的基因片段，然后将连接产物转化至DH5α，从转化长出来的单克隆菌落随机挑取6个进行PCR鉴定。以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为特异性引物，ATCC11845野生株为阳性对照进行PCR扩增；PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；再72℃后延伸10min，最后16℃保存。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。结果显示，随机选取的6个转化子均扩增出了目的基因。使用质粒提取试剂盒(购自天根)提取阳性克隆质粒，然后用限制性内切酶NcoI和XbaI鉴定，结果图6所示。

受体菌的制备：首先从-80℃取出鸭疫里默氏杆菌RA ATCCΔRA0C-1193(RA ATCC ΔRA0C-1193菌株参见Liao H B,Cheng X J,Zhu D K,et al.TonB energy transduction systems of Riemerella anatipestifer are required for iron and hemin utilization[J].PloS one,2015,10(5):e0127506)，在血平板上复苏，待其生长起来后，用接种环挑取单克隆菌落接种至10ml液体GCB培养基培养过夜；将其调整为OD600＝1，并加入5mM MgCl₂混匀备用。

自然转移：准备两个1.5ml无菌离心管，一个作为实验组，一个作为对照组，分别加入300μl(含5mM MgCl₂)上述菌液，其中实验组加入1μg的重组质粒，对照组不加。封口胶密封并置于37℃培养箱孵育30分钟；取出孵育30分钟的实验组和对照组，分别向其中加入700μl含有5mM MgCl₂的GCB培养基，即定容至1ml，封口胶密封，37℃培养箱孵育7小时。

从实验组和对照组分别取出100μl菌液，分别用一次性涂布棒涂在含头孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)和壮观霉素(80μg/ml)(Spectinomycin，SPC)的GCB固体培养基上；将培养基置于37℃培养箱培养18h至单克隆长出。

阳性结合子的筛选及鉴定：培养后发现在含头孢西丁抗性和壮观霉素抗性的培养基上实验组均长出了明显的单克隆菌落，而对照组没有，随机挑取5个单克隆分离在新的抗性的GCB固体培养基上，37℃培养箱培养过夜；以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为模板PCR扩增目的基因cfxA，并以质粒pMM47为阳性对照，ATCC11845野生株为阴性对照。

PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；循环30次；再72℃后延伸8min；最后16℃保存。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示。结果显示，5个转化子均能扩增出cfxA，表明重组质粒能够成功导入鸭疫里默氏杆菌ATCC11845。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

<110> 四川农业大学

<120> 一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法

<160> 7

<210> 1

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cfxA部分序列

<400> 1

ggtgctgcaa tgttgatgaa tcgtttgttt actgaaggtc ttatcgatga tgagaaacaa 60

agtttcatta agaatacgtt aaaagaatgc aaaacaggtg tagataggat agcagctcca 120

cttcttgata aagaaggggt tgttatagcg cataagacag gttcaggtta tgttaatgaa 180

aatggtgttc ttgcagctca caatgatgtt gcctatatat gtctgcctaa taatatcagt 240

tataccttag cgg 253

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物cfx p1

<400> 2

ggtgctgcaa tgttgatg 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物cfx p2

<400> 3

ccgctaaggt ataactg 17

<210> 4

<211> 861

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RA0C_1193基因序列

<400> 4

atgagccaaa ccataaatac atcggaaaga aaagaccaaa tcaaaagtgc catcatcaca 60

tttttgatta gccttttggt attcttagct ttgtattttt attcgtttac tagagaactt 120

ccaaaggagg aagtcgtaag cacgatgctc atcaattttg gagaccaaaa cgagggtaac 180

ctgcctgaag aaccccaaaa ccaagagggc agtctatccg ccaccgaagc acctacacca 240

atacaagaaa tacaacctac acctgtagaa cctcagccca aaaaagaagt ggtaaaggag 300

aaaattatca cagggcaaaa taccaaaaca agtgctgaaa aggtggaaaa agtaacctct 360

aaacctacaa aagaaagcac agcaaacacc caaaagaaag aaaccacgac acctaaaaaa 420

agcagtacca ctacacaaaa taaaaccgtg accaaccaag gtgatggcag aggtaacgag 480

gctattggca acctcatcag agggcgaggt gccaacaaag gagctcaagg aaactcccaa 540

aacacttccg gcaattcagg agacccacta ggtggcgata gcaatggcga tagtaaaatc 600

ggcatagacc gaaagttaat cggatttata cctggaacta tggggcgtgg tggttcacag 660

ccgacccacc agtgttctgc ctcaggcacc attagcatct cttatgtggt agataaagcg 720

ggcaatgtaa tttcggctag acgaagtggc ggtattacag acccttgtgc cgtaaacaca 780

accatagagt gggtaaagaa atatgtaaaa gcagaaagag ctagcacttc ttctacaggc 840

acttacaaaa tcactttcta a 861

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物p1

<400> 5

catgccatgg atgagccaaa ccataaatac 30

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物p2

<400> 6

ctagtctaga ttagaaagtg attttgtaag tgcctg 36

<210> 7

<211> 6733

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLMF03质粒序列

<400> 7

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 60

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 120

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 180

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 240

ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 300

agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 360

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 420

ttgggctatt taggcattag ccctcttttt aacctgactt aaaaaataat taaatcataa 480

gatattaaat atcaagtgat tatgatttac tatgctatac ataatatcac ccagtgttag 540

aaaattcttg ctatgctttt tgtttgtttt ttttcattcg tgaactttta gaatactttt 600

aaaataaact caaatttata aactattgat tttcaatatt atacaaaacc aaacttatta 660

acattaaact tatttctatt acctttaaaa taaactacta aaagacaaat ctaccaatcc 720

tcggaactat ttaataaata ggaagttata taaaaataat gaacttttag aatactttat 780

tagtcttttt agctccaaaa atgaactttt agaatacttt ttttgaactt ttagaatact 840

tttttaaact tgctttttag taagttcatt ttttatatat ttgtattcta aaagtgcatt 900

ttatattcat aactctctat atatggcaaa agtagataat aaactaatgt ttcagtccta 960

tatttttact acggctaaat atgatttttc agtctatgaa aagcgtatac tatataggca 1020

aatagaaata gaacaggcat tgctaaataa tgaggcgttg aaagattgta tcaaaataga 1080

tactaaccta tggggggata aaaaatatac aattccaatt tctatgctgt tagctaatga 1140

tgaagataaa aattattata aaattaaaaa agcattcaaa gacctaaaat caaagaacat 1200

tgagtacgaa gatgaaaaag aatacgcttg ctttggtgtt attgataagt tttggattga 1260

taaatatgga agaaatgtta cttggcaatc tgacaaaaga attgttgaag cggtaatgga 1320

ttttacaaga ggatggagaa aatatgaatt gaagattgct atgcagtttg agactattta 1380

tgcaatgcgt ttttacgaac tgatagctaa taaaaccaaa ccaataacat atgaagtgtc 1440

atttcttgaa aaaatgtttc aattggaaaa taagtacagg aaccctcagg gtaatcttaa 1500

tatcagtatg tttaaacgcc gtgtattaga ccccgctaaa aacgagttag ataaatgttc 1560

tccatacact tttgattata ctctttcaaa ggataaaaaa attatttctc taattcctat 1620

tttccaagaa caatttgcag atgaaagtat gaagatgatc aaaatagaag aggaaaaaga 1680

tatacactct gtattaactc aaagagaaat tgatgttttt acaaacgaat ttggttttac 1740

acaacaaggt ttattaaaca actatgccct attcaaagat tgtaaggcta cacttccatc 1800

aaactattct ttcttccttt ttcaagagat aagaaaaagt cggactaaga aaggaaaaat 1860

atctcctgct tatgtgattg ggattataag aaatatgctt aaagatttca aaaaagaaca 1920

acaataggct tatgaaaaaa tatacaacaa aagaaatcgc agagcttttt ggcgtcagcg 1980

aacggacaat ccagcgacac ataacgacac taagcgacaa catatcaaat accgacagaa 2040

agggcttttc aataccagaa gacattgttt tctttcttgc cgagcgacac cattacgaca 2100

ttttagcgac aacgaacgac aacgaacgac aggataaaaa tgaagaattt cctcatattg 2160

aatacttcac agaagaggaa taccaagagt ttaaaaaaag gatcacagag tacccttttt 2220

tgaaagagca aattaaactg tctaatgaac atttggatac tctaaaaaca caaatagaat 2280

atttcagact atcttacaat aagcaattgg atattcacga aaaattaatc ggagcgttcc 2340

gagaaagaaa ctttattgaa gctaaagaaa aggggatgga taaatagctc ctaataatta 2400

aagaagtatt agaaaaaaaa tgctatataa aaacttaatc gagctctata cgagatctgt 2460

tccaatgcat tggctgcagg tcgacatttc aaaaatttaa cttaaaccac tgatttacaa 2520

aaatgtttat ttgcaaaact attttacaaa gatattacaa taatttttct agcacaaatt 2580

tatttctcac catatctttg ccttgttcaa gtgagtgaac agagtaacaa acaaaaaaag 2640

aaacaaattt aaaaaaatta tttaaaattc catggctcta gaactcgagc atcatcatca 2700

tcatcattga actagtggag ttgcttctct tttcgggagt ggaaaactga aagaactgga 2760

acgtgccaac gaaaaactgc aagacgaggt ttcaaaacgg aacaccaata ttgaaaaatt 2820

gcagagccaa gtacagcaga tgcagaaaca gcatgatacg caaatccaca atctcagaga 2880

aatgcacagg caggaacttg acatgaaaga aaaagaactg tcacggctcg ccagaatcat 2940

agacaaggct ttcaggtggt ttccgatgtt cagggaaatg ctgcgcatgg aaaagttttg 3000

tgccatgctg ggattctcta aagaaatgac tgaaagtctt atagtcaaaa aagaagccct 3060

gaaatgtagc ggtaaaatct attccgagca acacaggcgg aactttgata taaaggatga 3120

tattttaagg gtggaaaatg accctgacga tgaaagcagg ctgaacctga caataaacag 3180

gaagccgatt gccgactggt tcagggagca atggcacagg cttagatatg gagcaagagt 3240

gccgcaacag gaagaaagaa aaagtagagg attcaaatta taatagaagc aatttgatta 3300

gtaatctaaa agcactccga taacgattag agtgctttta gattgtttat cattaattat 3360

caaagcaagt gcagtttaag attttactga agtttgcatt aataaagaat atactacagc 3420

tgatatatgc gcaacatatt gtgacgcttg tgatttattt cccttgaaat ccttaacaaa 3480

taccgctaag gtataactga tattattagg cagacatata taggcaacat cattgtgagc 3540

tgcaagaaca ccattttcat taacataacc tgaacctgtc ttatgcgcta taacaacccc 3600

ttctttatca agaagtggag ctgctatcct atctacacct gttttgcatt cttttaacgt 3660

attcttaatg aaactttgtt tctcatcatc gataagacct tcagtaaaca aacgattcat 3720

caacattgca gcaccaagag gagatgtata gttagagtaa gccttgttat ggtcagccga 3780

catttcctct tccgtataag ctatctgaaa acttgaacga ggaatgagtg tggctataaa 3840

actatctgtt tgagcgacat taaccatatc cttaaacata aggttgcttg cattgttgtc 3900

actctgagta agagtataac gcagcaaatc tctcactgtc aatgatatga ctggccctga 3960

ataatctttc agcataggac tccaagtctt tgggtcaagt ttatccctat ttatatttac 4020

taaggtatca agtgaaattc ctttattgtc aaagtcatta caaagagcta atgcctgatg 4080

aaccttaaac acactcatca taggataaac actcttatta ttgaccttaa ccgtatctct 4140

gttattaaca ataaccgcca caccaatttc gccaggacaa gctgagacaa tttgagaaat 4200

gctatcagtc aaaacatttg ttaaaggagg atttgcgcta tcttttgtcg ctgatttatg 4260

gaacaatgaa aataccaaga tgaaaatgca aactaaagct atactcaaaa ctacgatttg 4320

tttttttctg tttttttcca tgttttatat tatttatatt tgtttgacga gaatatcttt 4380

atttgccgac aaaggtacat aactaaagtt tcccacccaa ataaatagat agaaaaataa 4440

cagtttgtcg aattttcttt gtaaattagt aatcgctaaa gaactgattt tggggatccc 4500

cgggtaccga gctcgaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 4560

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 4620

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 4680

ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 4740

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 4800

gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 4860

gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 4920

aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 4980

acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 5040

atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 5100

tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 5160

gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 5220

gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 5280

gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 5340

ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 5400

tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 5460

acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 5520

cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 5580

catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 5640

cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 5700

ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 5760

ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 5820

ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 5880

atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 5940

gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 6000

atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 6060

tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 6120

cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 6180

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 6240

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 6300

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 6360

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 6420

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 6480

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