一种利用短芽胞杆菌制备脑钠肽前体抗原表位的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用高效表达分泌型蛋白表达系统制备人源纤维连接蛋白(Fn3)展示抗原脑钠肽前体N端(NT-BNP)线性表位的方法。

背景技术：

在ELISA检测试剂盒制备过程中，需要将相应的抗原作为标准品。其中，蛋白质类抗原占有很大的比例。如何高效生产蛋白质类抗原，是该类产品的一个技术关键。本发明采用人源纤维连接蛋白(Fn3)展示蛋白质类抗原线性表位，尝试建立一个利用短芽胞杆菌高效生产分泌型蛋白质类线性表位的通用平台。

NT-BNP是当心肌受到刺激或损失时被释放到人的血浆中，在血浆中半衰期长，浓度高，体外更加稳定。因此，NT-BNP作为标准检测抗原目前被广泛地应用于心血管疾病的诊断治疗及预后应用中。NT-BNP作为标准检测抗原的来源包括化学合成、大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)重组、人细胞重组和心衰患者血浆分离等。由于其它几种来源成本较高，或者稳定性较差，目前主要来源为大肠杆菌重组获得。但大肠杆菌重组表达的融合蛋白，上游的蛋白表达需要IPTG诱导，下游的蛋白纯化需要破碎细胞等一系列的步骤，比较复杂。

短芽孢杆菌(Bacillus brevis，B.brevis)表达系统是能够高效表达分泌型和优良蛋白质的表达系统，尤其适用于生产分泌型蛋白质。该系统具有如下的优点：(1)没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体，蛋白跨越细胞膜后，被加工和直接释放到培养基中而不发生聚集，回收和纯化蛋白较为简单；(2)几乎不向胞外分泌蛋白酶，利于目的蛋白的稳定性；(3)对于真核起源的分泌型蛋白质，一般具有S-S键结构，据研究其发酵液中存在着可以促进蛋白中二硫键形成的因子，可以促进外源蛋白的折叠。

本发明采用短芽孢杆菌表达人源纤维连接蛋白(Fn3)展示抗原脑钠肽前体线性表位，通过该途径可以将表达的外源蛋白直接分泌到培养液中，从而大大简化下游外源蛋白的分离纯化过程。可实现采用短芽胞杆菌分泌表达纤维连接蛋白所展示抗原的一个或多个表位，来生产具有和抗原蛋白等效的高稳定的抗原蛋白替代物。

技术实现要素：

本发明提供一种利用分泌型蛋白表达系统短芽胞杆菌制备重组人源Fn3-N-端脑钠肽前体抗原表位(NT-BNP_12-21)的方法，降低生产成本，实现快速、大规模分离制备人重组N-端脑钠肽前体抗原表位。

本发明的技术方案为：将能与脑钠肽前体抗体结合的抗原表位核苷酸序列置换人纤维连接蛋白Fn3的编码FG区核苷酸序列，再将以上融合基因构建到穿梭载体pNCMO₂上，利用短芽胞杆菌表达系统高效表达重组人源Fn3-N-端脑钠肽前体抗原表位Fn3-BNP_12-21。具体步骤如下：

1.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21线性表位融合蛋白表达载体构建：

(1)将NT-BNP_12-21线性表位设计在Fn3的FG区，在FG loop区引入编码BNP线性表位的短肽序列，构成人纤维连接蛋白Fn3与NT-BNP_12-21线性表位融合基因Fn3-BNP_12-21，合成Fn3展示NT-BNP_12-21线性表位的基因片段，在融合基因5′末端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签，便于分离纯化；

(2)将上述融合基因Fn3-BNP_12-21通过NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点构建到穿梭载体pNCMO₂的P2强启动子下游，形成融合表达载体pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21；

2.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21线性表位融合蛋白的表达：

(1)将融合表达载体pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21转化至大肠杆菌中，在氨苄青霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆，氨苄青霉素在LB培养基的终浓度为100μg/ml，LB培养基配方为每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化钠10g和15g琼脂粉；

(2)将鉴定过的阳性转化子转化至短芽孢杆菌中，在新霉素抗性的MT平板上筛选阳性克隆，新霉素在MT培养基终浓度为10μg/ml，MT培养基配方为每升培养基中含葡萄糖20g、多价胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO₄·7H₂O 10mg、MnSO₄·4H₂O 10mg、ZnSO₄·7H₂O1mg，pH＝7.2-7.4；

(3)将鉴定过的阳性转化子接种在含有新霉素抗性的MT或2SY液体培养基中，新霉素在液体培养基终浓度为50μg/ml，过夜培养，收集上清培养液，利用SDS-PAGE电泳及Western Blot法检测目的蛋白条带，2SY培养基配方为每升培养基中含葡萄糖20g、大豆胨40g、酵母提取物5g、CaCl₂·2H₂O 0.15g，pH＝7.2-7.4；

3.融合蛋白的分离纯化：

收集上清培养液，用镍柱纯化带有His-Tag标签的融合蛋白，该蛋白即为重组人源Fn3融合N-端脑钠肽前体抗原表位BNP_12-21蛋白。

本发明的有益效果是：本发明采用的表达载体为pNCMO₂，该载体是在B.brevis和E.coli间的穿梭质粒。在E.coli中构建表达质粒后，转入B.brevis进行蛋白质表达。宿主菌细胞壁蛋白质的P2启动子作为pNCMO₂的表达启动子，由于P2启动子在E.coli中不起作用，有利于目的基因的克隆；但在B.brevis中则是呈指数级别的强启动子，可高效的表达目的蛋白。

本发明采用短芽孢杆菌表达人源纤维连接蛋白(Fn3)展示抗原脑钠肽前体线性表位，通过该途径可以将表达的外源蛋白直接分泌到培养液中，从而大大简化下游外源蛋白的分离纯化过程，从而快速、简单、高效的制备人重组N-端脑钠肽前体抗原表位。

本发明不仅适用于分泌型人纤维连接蛋白-脑钠肽前体抗原表位的制备，也适用于其它重组蛋白质的制备。因此，本发明在大规模制备人源Fn3-BNP_12-21重组蛋白和其它重组多肽的生产中具有较高实用价值。

附图说明

附图1为本发明的Fn3-BNP_12-21基因结构图。

附图2为本发明的pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21融合表达载体图谱。

附图3为本发明的Fn3-BNP_12-21重组蛋白在不同培养基中表达的SDS-PAGE电泳图，其中：条带1、2、3为阳性转化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21菌株在MT培养基中培养24h，离心所得上清样品，4、5、6为阳性转化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21菌株在2SY培养基中培养24h，离心所得上清样品，M为标准蛋白质。

附图4为本发明的Fn3-BNP_12-21重组蛋白Western Blot检测图结果图。其中，条带1为实施例一中的Western Blot检测图结果，条带2为实施例二中Western Blot检测图结果。

附图5为本发明的Fn3-BNP_12-21重组蛋白经镍柱纯化后SDS-PAGE电泳图，其中，条带1、2、3分别为实施例一至三所得的镍柱纯化后的Fn3-BNP_12-21融合蛋白，M为标准蛋白质。

附图6为本发明的重组Fn3-BNP_12-21蛋白与鼠源抗BNP_12-21氨基酸残基的单克隆抗体13G12结合能力分析。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护范围。

实施例一

1.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21线性表位融合蛋白表达载体构建：

(1)采用人纤维连接蛋白III型结构域蛋白(Fn3)为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)，将NT-BNP_12-21线性表位设计在Fn3的FG区，在FG loop区引入编码BNP抗原表位的短肽序列(CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，编码BNP的12-21氨基酸残基LETSGLQEQR)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司按照序列表[1]合成Fn3-BNP_12-21基因，在融合基因5′末端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签，便于分离纯化；形成的融合基因结构见附图1；

(2)将上述融合基因Fn3-BNP_12-21通过NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点构建到穿梭载体pNCMO₂的P2强启动子下游，形成融合表达载体pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21，其核苷酸序列如序列表[2]所示，载体图谱见附图2；

2.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21线性表位融合蛋白的表达：

(1)将融合表达载体pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21根据宝生物工程(大连)有限公司JM109感受态细胞说明书转化到JM109大肠杆菌菌株中，在含有氨苄青霉素(100μg/ml)抗性的LB培养基平板上，37℃培养24h。LB培养基配方：每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化钠10g和琼脂粉15g；

(2)挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(100μg/ml)抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm培养过夜，提取质粒，经过NcoⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定为阳性后，将重组质粒pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21按照宝生物工程(大连)有限公司短芽胞杆菌表达系统HB200中的NTP法说明，转化至短芽胞杆菌表达系统HB116中，在新生霉素抗性(10μg/ml)MT培养基中，30℃培养过夜，提取质粒，取经过NcoⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定为阳性的转化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP₁₂-21进行融合蛋白的表达。MT培养基配方：每升培养基中含葡萄糖20g、多价胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO₄·7H₂O 10mg、MnSO₄·4H₂O 10mg、ZnSO₄·7H₂O 1mg，pH＝7.2-7.4；

(3)将鉴定过的阳性转化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP₁₂-21菌株接种到5ml新生霉素抗性(50μg/ml)的MT培养基中，在200rpm、30℃条件下，震荡培养24h。将菌液离心力为12000g，离心10min，收集上清液，加入SDS-PAGE上样缓冲液，热裂解后，进行SDS-PAGE电泳，结果见附图3；

(4)将步骤2(3)中获得的上清液湿转至PVDF膜上，经过封闭液封闭后，加入一抗(1∶2500稀释，抗BNP单克隆抗体，购自HyTest公司)进行室温孵育，二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000稀释)孵育清洗后，进行Western-Blot发光检测，结果见附图4；

3.融合蛋白的分离纯化：

将步骤2(3)获得的上清液经过镍柱纯化后得到目的融合蛋白Fn3-BNP_12-21，通过SDS-PAGE电泳进行蛋白纯度检测，SDS-PAGE电泳图见附图5，采用ELISA方法测定免疫血清的效价。融合蛋白经逐级稀释后包被96孔酶标板，经过封闭液封闭后，加入HyTest公司生产的鼠源抗NT-proBNP_12-21氨基酸残基的单克隆抗体13G12(1:2500稀释),用血清白蛋白作空白对照。二抗为辣根过氧化酶标记羊抗小鼠IgG抗体(1∶4000稀释)，底物为TMB，显色10min后用2M的硫酸终止反应。测定波长450nm处的OD值。结果如附图6所示,融合蛋白Fn3-BNP_12-21具有良好的与鼠源抗BNP_12-21氨基酸残基的单克隆抗体13G12结合能力。

实施例二

1.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21线性表位融合蛋白表达载体构建：

(1)采用人纤维连接蛋白III型结构域蛋白(Fn3)为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)，将NT-BNP_12-21线性表位设计在Fn3的FG区，在FG loop区引入编码BNP抗原表位的短肽序列(CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，编码BNP的12-21氨基酸残基LETSGLQEQR)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司按照序列表[1]合成Fn3-BNP_12-21基因，在融合基因5′末端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签，便于分离纯化；形成的融合基因结构见附图1；

(2)将上述融合基因Fn3-BNP_12-21通过NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点构建到穿梭载体pNCMO₂的P2强启动子下游，形成融合表达载体pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21，其核苷酸序列如序列表[2]所示，载体图谱见附图2；

2.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21线性表位融合蛋白的表达：

(1)将融合表达载体pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21根据宝生物工程(大连)有限公司JM109感受态细胞说明书转化到JM109大肠杆菌菌株中，在含有氨苄青霉素(100μg/ml)抗性的LB培养基平板上，37℃培养24h。LB培养基配方：每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化钠10g和琼脂粉15g；

(2)挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(100μg/ml)抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm培养过夜，提取质粒，经过NcoⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定为阳性后，将重组质粒pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21按照宝生物工程(大连)有限公司短芽胞杆菌表达系统HB200中的NTP法说明，转化至短芽胞杆菌表达系统HB116中，在新生霉素抗性(10μg/ml)MT培养基中，30℃培养过夜，提取质粒，取经过NcoⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定为阳性的转化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21进行融合蛋白的表达。MT培养基配方：每升培养基中含葡萄糖20g、多价胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO₄·7H₂O 10mg、MnSO₄·4H₂O 10mg、ZnSO₄·7H₂O 1mg，pH＝7.2-7.4；

(3)将鉴定过的阳性转化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21菌株接种到5ml新生霉素抗性(50μg/ml)的2SY培养基中，在200rpm、30℃条件下，震荡培养24h。将菌液离心力为12000g，离心10min，收集上清液，加入SDS-PAGE上样缓冲液，热裂解后，进行SDS-PAGE电泳，结果见附图3。2SY培养基配方如下：每升培养基中含葡萄糖20g、大豆胨40g、酵母提取物5g、CaCl₂·2H₂O 0.15g，pH＝7.2-7.4；

(4)将步骤2(3)中获得的上清液湿转至PVDF膜上，经过封闭液封闭后，加入一抗(1∶3000稀释，抗BNP单克隆抗体，购自HyTest公司)进行室温孵育，二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶4000稀释)孵育清洗后，进行Western-Blot发光检测，结果见附图4；

3.融合蛋白的分离纯化：

将步骤2(3)获得的上清液经过镍柱纯化后得到目的融合蛋白Fn3-BNP_12-21，通过SDS-PAGE电泳进行蛋白纯度检测，SDS-PAGE电泳图见附图5，采用ELISA方法测定免疫血清的效价。融合蛋白经逐级稀释后包被96孔酶标板，经过封闭液封闭后，加入HyTest公司生产的鼠源抗NT-proBNP_12-21氨基酸残基的单克隆抗体13G12(1:3000稀释),用血清白蛋白作空白对照。二抗为辣根过氧化酶标记羊抗小鼠IgG抗体(1∶4000稀释)，底物为TMB，显色10min后用2M的硫酸终止反应。测定波长450nm处的OD值。结果如附图6所示,融合蛋白Fn3-BNP_12-21具有良好的与鼠源抗BNP_12-21氨基酸残基的单克隆抗体13G12结合能力。

实施例三

1.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21线性表位融合蛋白表达载体构建：

(1)采用人纤维连接蛋白III型结构域蛋白(Fn3)为模式基因(EMBL登入号码AJ320527)，将NT-BNP_12-21线性表位设计在Fn3的FG区，在FG loop区引入编码BNP抗原表位的短肽序列(CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，编码BNP的12-21氨基酸残基LETSGLQEQR)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司按照序列表[1]合成Fn3-BNP_12-21基因，在融合基因5′末端引入编码6个组氨酸的分离纯化标签，便于分离纯化；形成的融合基因结构见附图1；

(2)将上述融合基因Fn3-BNP_12-21通过NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点构建到穿梭载体pNCMO₂的P2强启动子下游，形成融合表达载体pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21，其核苷酸序列如序列表[2]所示，载体图谱见附图2；

2.人纤维连接蛋白Fn3展示NT-BNP_12-21线性表位融合蛋白的表达：

(1)将融合表达载体pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21根据宝生物工程(大连)有限公司JM109感受态细胞说明书转化到JM109大肠杆菌菌株中，在含有氨苄青霉素(100μg/ml)抗性的LB培养基平板上，37℃培养24h。LB培养基配方：每升培养基中含胰蛋白胨10克、酵母提取物5g、氯化钠10g和琼脂粉15g；

(2)挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(100μg/ml)抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm培养过夜，提取质粒，经过NcoⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定为阳性后，将重组质粒pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21按照宝生物工程(大连)有限公司短芽胞杆菌表达系统HB200中的NTP法说明，转化至短芽胞杆菌表达系统HB116中，在新生霉素抗性(10μg/ml)MT培养基中，30℃培养过夜，提取质粒，取经过NcoⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定为阳性的转化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21进行融合蛋白的表达。MT培养基配方：每升培养基中含葡萄糖20g、多价胨10g、肉浸粉5g、酵母提取物20g、FeSO₄·7H₂O 10mg、MnSO₄·4H₂O 10mg、ZnSO₄·7H₂O 1mg，pH＝7.2-7.4；

(3)将鉴定过的阳性转化子HB116-pNCMO₂-Fn3-BNP_12-21菌株接种到5ml新生霉素抗性(50μg/ml)的2SY培养基中，在200rpm、30℃条件下，震荡培养48h。将菌液离心力为10000g，离心10min，收集上清液，加入SDS-PAGE上样缓冲液，热裂解后，进行SDS-PAGE电泳，结果见附图3。2SY培养基配方如下：每升培养基中含葡萄糖20g、大豆胨40g、酵母提取物5g、CaCl₂·2H₂O 0.15g，pH＝7.2-7.4；

(4)将步骤2(3)中获得的上清液湿转至PVDF膜上，经过封闭液封闭后，加入一抗(1∶2500稀释，抗BNP单克隆抗体，购自HyTest公司)进行室温孵育，二抗为辣根酶标记羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释)孵育清洗后，进行Western-Blot发光检测，结果见附图4；

3.融合蛋白的分离纯化：

将步骤2(3)获得的上清液经过镍柱纯化后得到目的融合蛋白Fn3-BNP_12-21，通过SDS-PAGE电泳进行蛋白纯度检测，SDS-PAGE电泳图见附图5，采用ELISA方法测定免疫血清的效价。融合蛋白经逐级稀释后包被96孔酶标板，经过封闭液封闭后，加入HyTest公司生产的鼠源抗NT-proBNP_12-21氨基酸残基的单克隆抗体13G12(1:2500稀释)，用血清白蛋白作空白对照。二抗为辣根过氧化酶标记羊抗小鼠IgG抗体(1∶5000稀释)，底物为TMB，显色10min后用2M的硫酸终止反应。测定波长450nm处的OD值。结果如附图6所示,融合蛋白Fn3-BNP_12-21具有良好的与鼠源抗BNP_12-21氨基酸残基的单克隆抗体13G12结合能力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，按照本领域的普通技术知识和通用方法，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

<110> 大连大学

<120> 一种利用短芽胞杆菌制备脑钠肽前体抗原表位的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

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<210> 2

<211> 5530

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catcatcgca tctgttatac gacgagcgct tcggtcttaa ctgaagcagt taagcaatca 3000

gatcttcctt caggttatga ccatctgtgc cagttcgtaa tgtctggtca actttccgac 3060

tctgagaaac ttctggaatc gctagagaat ttctggaatg ggattcagga gtggacagaa 3120

cgacacggat atatagtgga tgtgtcaaaa cgcataccat tttgaacgat gacctctaat 3180

aattgttaat catgttggtt acgtatttat taacttctcc tagtattagt aattatcatg 3240

gctgtcatgg cgcattaacg gaataaaggg tgtgcttaaa tcgggcctgc atgacgaaag 3300

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gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg 4560

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ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 4680

tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 4740

ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 4800

tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 4860

cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 4920

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