本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法。
背景技术：
体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)又称体细胞克隆，是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，重新组成一个新的胚胎，不经精子穿透等有性过程即被激活、分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制,经过体外培养后，将发育良好的胚胎移植到动物体内的技术。用体细胞核移植的方法最终得到的产物，我们称之为克隆动物。哺乳动物细胞核移植研究经历时间不长，以1997年英国Roslin研究所Wilmut实验室“多利羊”的诞生为标志，揭开了体细胞核移植的序幕。体细胞核移植技术在拯救珍稀濒危动物、进行异体器官移植、应用在克隆性治疗上及生产药用蛋白等方面，具有广阔的应用前景，尤其与基因工程、干细胞技术结合无疑会对自然界及人类社会产生极其深远的影响。
利用SCNT生产转基因动物的过程是首先将外源DNA转染体外培养的体细胞，然后筛选出转基因体细胞作为核供体，将转基因体细胞核移入去核卵母细胞中再通过胚胎移植获得转基因动物，减少转基因动物建系时间，且所需动物数量比原核显微注射法大幅度降低。但是，利用SCNT技术生产转基因猪面临两个重大瓶颈问题，一是至今没有真正分离到具有种系嵌合能力的猪胚胎干细胞系；二是核移供体采用的体细胞，转染大片段目的基因后筛选困难，而且筛选过程中携带选择标记，这也不符合国家转基因生物安全要求。针对以上技术瓶颈问题，本研究者发明一种制备转基因动物的新方法，即将目的基因通过显微注射直接注入体细胞核移植重组胚的供体细胞内，通过一步电融合激活，构建重组胚胎，获取转基因后代。该技术很好的解决了以上两大瓶颈问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，该方法避免采用猪胚胎干细胞作为供体细胞，同时大片段目的基因转染、筛选，以及细胞筛选过程中的标记基因删除，提高了转基因效率，节约时间，扩大了转基因应用范围。需要特别注意的是，在核移植操作过程中，采用透明带下注射体细胞，易于显微注射外源目的基因。
其具体技术方案为：
一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，包括以下步骤：
步骤1、目的基因的制备
获取目的基因，构建表达载体；
步骤2、供体细胞的分离培养
从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS冲洗；在直径100mm细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上；用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15mL细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100％、体积分数为5％CO2培养箱；待培养6～8h后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块；培养5d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或者冷冻保存；
步骤3、受体细胞的制备
猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢，采用10mL注射器抽吸直径为3～6mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置15～20min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体COCs，转移到DPBS液滴中，冲洗3～5遍，用CO2培养箱内平衡2h以上mTCM199培养基再洗3遍，然后放在39℃，100％湿度，5％CO2培养箱中培养；在0～22h添加10IU/mL PMSG和hCG，后22～44h不加激素；间隔24h调换约1/2～2/3的培养液；COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到质量分数为0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第Ⅰ极排出作为卵母细胞成熟的主要标准，作为受体细胞；
步骤4、显微操作
将供体细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴，39％，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜DM2500Leica上，用固定吸管(内径为25～30μm，外径100～120μm)吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，从去核切口注入卵周间隙，此时，再将已经构建好外源基因的载体注入到胎儿成纤维细胞内，将重构卵转移到NCSU-23+4mg/mL BSA中，在39％，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复0.5～1h，然后对完整的存活卵进行激活操作；
将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，洗涤3～5遍后，每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽(BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽)中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加60μs、1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重构卵用NCSU-23+4mg/mL BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5％CO2及相对湿度为100％条件下培养0.5～1h后判定融合；
步骤5、胚胎培养与移植
转基因克隆胚胎体外培养1～2天后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植150～250枚胚胎；胚胎移植后，对未返情的受体于28～30d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至转基因克隆猪出生。
进一步，步骤4中固定吸管的内径为25～30μm，外径100～120μm。
进一步，步骤4中融合槽为BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明致力于生产转基因动物的方法，通过显微注射技术直接将外源目的基因导入重组胚的供体细胞中，避免体细胞转染大片段目的基因后筛选的困难，而且生产的转基因后代不携带任何选择性标记，也符合国家转基因生物安全的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1.本发明大致由三部分组成，目的基因构建、体细胞核移植以及显微注射技术。在获取目的基因之后，构建表达载体，利用显微操作去除卵母细胞的细胞核，然后将体细胞(成纤维细胞)注入去核的卵母细胞间隙，再将外源基因直接注入体细胞，通过一步电融合激活，构建重组胚胎移植给代孕母猪获取转基因后代。
2.本发明与一般核移植转基因实验的不同之处在于，避免大片段的基因转染细胞、筛选，获得的转基因后代不携带任何选择标记，提高了转基因效率，节约时间，扩大了转基因应用范围。需要特别注意的是，在核移植操作过程中，采用透明带下注射体细胞，易于显微注射外源目的基因。
3.重组胎体外培养，1-cell和2-cell期核移植重组胚经过胚胎移植技术植入代孕母畜输卵管内，8-cell期及以上的重组胚胎移入代孕母畜子宫内。在胚胎移植时，用孤雌激活胚与核移植注射基因胚胎共同移植，这样有利于提高代孕母畜的受孕率。
实施例1
一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，包括以下步骤：
步骤1、目的基因的制备
获取目的基因，构建表达载体；
步骤2、供体细胞的分离培养
从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS冲洗；在直径100mm细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上；用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15mL细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100％、体积分数为5％CO2培养箱；待培养6h后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块；培养5d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或者冷冻保存；
步骤3、受体细胞的制备
猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢，采用10mL注射器抽吸直径为3mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置15min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体COCs，转移到DPBS液滴中，冲洗3遍，用CO2培养箱内平衡2h以上mTCM199培养基再洗3遍，然后放在39℃，100％湿度，5％CO2培养箱中培养；在0～22h添加10IU/mL PMSG和hCG，后22h不加激素；间隔24h调换约1/2的培养液；COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到质量分数为0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第Ⅰ极排出作为卵母细胞成熟的主要标准，作为受体细胞；
步骤4、显微操作
将供体细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴，39％，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜DM2500Leica上，用固定吸管(内径为25～30μm，外径100～120μm)吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，从去核切口注入卵周间隙，此时，再将已经构建好外源基因的载体注入到胎儿成纤维细胞内，将重构卵转移到NCSU-23+4mg/mL BSA中，在39％，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复0.5～1h，然后对完整的存活卵进行融合激活操作；
将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，洗涤3遍后，每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽(BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽)中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加60μs、1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重组卵用NCSU-23+4mg/mL BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5％CO2及相对湿度为100％条件下培养0.5h后判定融合；
步骤5、胚胎的培养与移植
转基因克隆胚胎体外培养24h后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植约250枚胚胎；胚胎移植后，对未返情的受体于28d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至转基因克隆猪出生。
实施例2
一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，包括以下步骤：
步骤1、目的基因的制备
获取目的基因，构建表达载体；
步骤2、供体细胞的分离培养
从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS冲洗；在直径100mm细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上；用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15mL细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100％、体积分数为5％CO2培养箱；待培养7h后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块；培养5d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或者冷冻保存；
步骤3、受体细胞的制备
猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢，采用10mL注射器抽吸直径为4mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置18min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体COCs，转移到DPBS液滴中，冲洗4遍，用CO2培养箱内平衡2h以上mTCM199培养基再洗3遍，然后放在39℃，100％湿度，5％CO2培养箱中培养；在0～22h添加10IU/mL PMSG和hCG，后230h不加激素；间隔24h调换约2/3的培养液；COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到质量分数为0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第Ⅰ极排出作为卵母细胞成熟的主要标准，作为受体细胞；
步骤4、显微操作
将供体细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴，39％，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜DM2500Leica上，用固定吸管(内径为25～30μm，外径100～120μm)吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，从去核切口注入卵周间隙，此时，再将已经构建好外源基因的载体注入到胎儿成纤维细胞内，将重构卵转移到NCSU-23+4mg/mL BSA中，在39％，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复0.8h，然后对完整的存活卵进行激活操作；
将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，洗涤4遍后，每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽(BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽)中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加60μs、1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重构卵用NCSU-23+4mg/mL BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5％CO2及相对湿度为100％条件下培养0.8h后判定融合；
步骤5、胚胎的培养与移植
转基因克隆胚胎体外培养2天后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植约250枚胚胎；胚胎移植后，对未返情的受体于29d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至转基因克隆猪出生。
实施例3
一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法，包括以下步骤：
步骤1、目的基因的制备
获取目的基因，构建表达载体；
步骤2、供体细胞的分离培养
从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS冲洗；在直径100mm细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上；用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15mL细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100％、体积分数为5％CO2培养箱；待培养8h后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块；培养5d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80％汇合时，进行传代培养或者冷冻保存；
步骤3、受体细胞的制备
猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢，采用10mL注射器抽吸直径为6mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置20min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体COCs，转移到DPBS液滴中，冲洗5遍，用CO2培养箱内平衡2h以上mTCM199培养基再洗3遍，然后放在39℃，100％湿度，5％CO2培养箱中培养；在0～22h添加10IU/mL PMSG和hCG，后44h不加激素；间隔24h调换约2/3的培养液；COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到质量分数为0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第Ⅰ极排出作为卵母细胞成熟的主要标准，作为受体细胞；
步骤4、显微操作
将供体细胞和脱去卵丘的卵母细胞转移到显微操作液滴，39％，5％CO2，100％湿度平衡15min，然后在配有Eppendorf显微操作系统和恒温台的倒置显微镜DM2500，Leica上，用固定吸管(内径为25～30μm，外径100～120μm)吸住卵母细胞，将卵母细胞极体调整到“1”点或“5”点钟的位置，用内径25～30μm去核/注射针从“3”点钟处进针，吸取极体和其附近20％～30％的细胞质，选择直径20～30μm，圆形、光滑的供体细胞，从去核切口注入卵周间隙，此时，再将已经构建好外源基因的载体注入到胎儿成纤维细胞内，将重构卵转移到NCSU-23+4mg/mL BSA中，在39％，5％CO2，100％湿度培养箱中恢复1h，然后对完整的存活卵进行激活操作；
将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3min，洗涤5遍后，每批5个放入已经铺满融合液，电极宽度为1mm的融合槽(BTX ECM2001电融合仪配套电激活槽)中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001融合仪施加60μs、1.2kV/cm，2次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重构卵用NCSU-23+4mg/mL BSA洗涤5遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5％CO2及相对湿度为100％条件下培养1h后判定融合；
步骤5、胚胎的培养与移植
转基因克隆胚胎体外培养1～2天后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，自然发情第1或第2天的后备母猪用作受体，受体为二元后备母猪，移植方法为手术法输卵管深部移植，每头受体移植约250枚胚胎；胚胎移植后，对未返情的受体于30d，进行超声波妊娠检测，对怀孕母猪，调整饲养管理，直至转基因克隆猪出生。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。