一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母及其构建方法，属于微生物技术领域 和分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 酿酒酵母在无氧条件下利用糖酵解途径来产能并采用乙醇发酵来维持糖酵解途 径的进行。乙醇发酵包含两个步骤：首先丙酮酸在丙酮酸脱羧酶（roc)的作用下转化为乙 醛，然后在乙醇脱氢酶（ADH)的作用下，还原乙醛生成乙醇同时NAD +再生。在有氧条件下， 酿酒酵母利用线粒体中的电子传递链来产能。
[0003] 在有氧条件下，癌细胞能够利用葡萄糖作为碳源经糖酵解代谢途径产生大量的乳 酸。糖酵解途径对于肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移是必需的。乳酸脱氢酶（LDH)主要是定 位于细胞质中，可逆地催化丙酮酸转化为乳酸同时NADH被氧化为NAD+。因此，乳酸发酵对 于维持肿瘤细胞糖酵解途径的进行以及NAD +的再生是必需的。来源于人的LDH有三个亚 基组成，分别为LDHA、LDHB和LDHC。LDHA主要存在于厌氧组织，比如骨骼肌；LDHB主要是 在有氧组织中表达，比如心肌；LDHC则是专门在睾丸中表达。
[0004] LDH是癌细胞增殖和转移的关键酶，在酿酒酵母中异源表达的人的乳酸脱氢酶将 可以作为一种潜在的抗癌药物的筛选工具，研宄人员可以根据药物对异源表达的人的乳酸 脱氢酶的作用情况，对药物性能进行初步评价。此外将人基因文库中的基因导入到LDH酵 母人源化系统可以筛选能够调节LDH活性的相关基因。
[0005] 本发明将酿酒酵母编码PDC的基因 H)C1，PDC5和roC6敲除掉，在酿酒酵母中表达 来源于人的LDH并用抗霉素 A来阻断电子链传递，使得人源化的乳酸发酵来代替乙醇发酵 来维持糖酵解的进行。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母，所述酿酒酵母缺失 了丙酮酸脱羧酶基因，且表达人的乳酸脱氢酶。
[0007] 所述缺失的丙酮酸脱羧酶基因是H)C1、PDC5和H)C6。
[0008] 所述roCl、PDC5和roC6,在本发明的一种实施方式中，分别是NCBI上Gene ID为 850733、850825、852978 的基因。
[0009] 所述人的乳酸脱氢酶是LDHA、LDHB或LDHC。
[0010] 所述人的乳酸脱氢酶LDHA、LDHB或LDHC，在本发明的一种实施方式中，分别是 NCBI 上 Gene ID 为 3939、3945、3948 的基因。
[0011] 本发明的第二个目的是一种所述乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母的构建方法。
[0012] 所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，是：（1)构建H)C1、PDC5和H)C6三基 因缺失菌一酿酒酵母口此1八1)(1(35八1)(1(36八；（2)将人的乳酸脱氢酶0)撤、0)耶或0)!1(：连接 到酵母表达质粒上，然后转化到酿酒酵母pdcl Apdc5 Apdc6 Δ中，筛选正确的转化子，即 为乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母。
[0013] 所述三基因缺失菌，在本发明的一种实施方式，是以酿酒酵母W303-1A为出发菌 株构建得到的。
[0014] 所述构建方法，在本发明的一种实施方式，具体是：（1)以酿酒酵母W303-1A为 出发菌株，通过同源重组的方法，依次敲出其roci、PDC5、roce三个基因得到酿酒酵母 pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ ; (2)将LDHA、LDHB或LDHC连接到pRS424TEF质粒上，得到重组质粒 PRS424TEF-LDHA，pRS424TEF-LDHB 和 pRS424TEF-LDHC，然后通过醋酸锂 /PEG 的转化方法将 重组质粒导入酿酒酵母pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ中，筛选，测序验证。
[0015] 本发明的第三个目的是提供一种利用所述乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母表达人的 乳酸脱氢酶的方法。
[0016] 所述方法是在SD-Trp培养基中培养乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母，并用抗霉素 A来 阻断电子链传递，使得人源化的乳酸发酵来代替乙醇发酵来维持糖酵解的进行。
[0017] 所述方法，在本发明的一种实施方式是：挑取酵母单菌落培养至OD66tl= 0. 8-1. 0 后，洗涤细胞并重悬于新鲜培养基中，细胞生长至I. 5 X IO7-L 7 X IO7个/mL时加入抗霉素 A，继续培养22-26h。
[0018] 所述方法，在本发明的一种实施方式，具体是：挑取酵母单菌落在SD-Trp培养基 中生长至OD 66tl= I. 0后，细胞用无菌水洗涤后，重新悬浮新鲜SD-Trp培养基并使细胞数为 I. 6 X IO7个/mL并加入终浓度为10 μ g/mL的抗霉素 A，继续培养24h。
[0019] 本发明还要求保护乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母生产的乳酸脱氢酶，以及其在筛选 抗癌药物、筛选能够调节乳酸脱氢酶活性的基因等方面的应用。
[0020] 本发明的有益效果：采用基因同源重组的方法敲除负责编码酿酒酵母丙酮酸脱 羧酶基因，将表达人的乳酸脱氢酶的重组质粒转化到酿酒酵母丙酮酸脱羧酶缺陷型菌株， 28°C~32°C培养长出酿酒酵母单菌落，实现了人的乳酸菌脱氢酶的异源表达，在酿酒酵母 pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ三缺陷菌株中表达LDHA或LDHC，加入抗霉素 A后，能够生长并检测到 乳酸的产生。乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母将可以作为一种潜在的筛选抗癌药物以及能够调 节乳酸脱氢酶活性相关基因的工具。
【附图说明】
[0021] 图1 :乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母在含有抗霉素 A的平板上的生长情况；
[0022] 图2 :乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母产乳酸情况的测定；
[0023] 图 3 :表达产物的 western blot。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1 :pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ三基因缺陷菌株的构建
[0025] 乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母的构建，包括以下步骤：
[0026] (l)pdc6 Δ缺陷型菌株的构建
[0027] 酿酒酵母roce基因序列设计引物如下：
[0028] 上游引物HX0556 (序列如SEQ ID NO. 1所示）：
[0029] AGTATAAATAAAAAACCCACGTAATATAGCAAAAACATATTGCCAACAAACGGATCCCCGGGTTAATT AA
[0030] 下游引物HX0557(序列如SEQ ID NO. 2所示）：
[0031] TAAGTTTATTTATTTGCAACAATAATTCGTTTGAGTACACTACTAATGGCGAATTCGAGCTCGTTTAA AC
[0032] 利用上游引物和下游引物扩增得到roC6基因，将来源于质粒pFA6a-HIS3MX6的 His片段插入roce基因片段内部，获得含酿酒酵母roce基因上下游序列的敲除片段，通过 醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的His片段导入到酿酒酵母W303-1A单倍体细胞 中，并进行筛选；将转化菌株涂布到SD-His缺陷型平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的 菌落提取基因组，并进行PCR验证，并以野生型菌株的基因组进行对比，获得pdc6 Λ缺陷型 菌株。
[0033] (2) pdc6 Δ pdc5 Δ双缺陷菌株的构建
[0034] 根据酿酒酵母H)C5基因序列设计引物如下：
[0035] 上游引物HX0552 (序列如SEQ ID NO. 3所示）：
[0036] CATAATCAATCTCAAAGAGAACAACACAATACAATAACAAGAAGAACAAATGTACTGAGAGTGCACCA TA
[0037] 下游引物HX0553(序列如SEQ ID NO. 4所示）：
[0038] AAAGTAAAAAAATACACAAACGTTGAATCATGAGTTTTATGTTAATTAGCATTTCACACCGCATATCG AC
[0039] 利用上游引物和下游引物扩增得到H)C5基因，将来源于质粒PRS305的Leu片段 插入rocs基因片段内部，获得含酿酒酵母rocs基因上下游序列的敲除片段，通过