醋酸锂 /PEG的转化方法将PCR扩增得到的Leu片段分别导入到酿酒酵母W303-lApdc6 Δ缺陷型 菌株，并进行筛选；将转化菌株涂布到SD-Leu-His缺陷型平板上，待长出菌落后，挑取一 定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验证，并以野生型菌株的基因组进行对比，从而得到 pdc6Apdc5A双缺陷菌株。
[0040] (3) pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ三缺陷菌株的构建
[0041] 由于酿酒酵母pdclApdc5Apdc6A三缺陷菌株生长比较慢，将把H)C5基因克隆 到pRS316TEF(带有强启动子TEF的pRS316质粒）得到的重组质粒pRS316TEF-PDC5转化 pdc6 Λ Pdc5 Λ双缺陷型菌株，得到相应的酿酒酵母重组菌株，并在此重组菌株的基础上敲 除PDCl基因。
[0042] 根据酿酒酵母roci基因序列设计引物如下：
[0043] 上游引物HX0548 (序列如SEQ ID NO. 5所示）：
[0044] TATTTTCTACTCATAACCTCACGCAAAATAACACAGTCAAATCAATCAAACGGATCCCCGGGTTAATT AA
[0045] 下游引物HX0549 (序列如SEQ ID NO. 6所示）：
[0046] TACATAAAAATGCTTATAAAACTTTAACTAATAATTAGAGATTAAATCGCGAATTCGAGCTCGTTTAA AC
[0047] 利用上游引物和下游引物扩增得到I3DC1基因，将来源于质粒pFA6a_kanMX6的 Kan片段插入到roci基因内部，获得含酿酒酵母roci基因上下游序列的敲除片段，通 过醋酸锂/PEG的转化方法将PCR扩增得到的Kan片段导入到酿酒酵母pdc6 Δ pdc5 Δ / PRS316TEF-PDC5缺陷型菌株，并进行筛选；将转化菌株涂布到含有G418抗生素的 SD-Leu-His缺陷型平板上，待长出菌落后，挑取一定数目的菌落提取基因组，并进行PCR验 证，并以野生型菌株的基因组进行对比，从而得到pdc 1 Δ pdc6 Δ pdc5 Δ /pRS316TEF-PDC5 三缺陷菌株。最后在含有SOOμg/ml 5-氟乳清酸的SD培养基消除掉pRS316TEF-PDC5质 粒，得到口此1八口(1〇5八。(1〇6八三缺陷菌株。
[0048] 实施例2 :乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母的构建
[0049] 将通过PCR扩增的LDHA，LDHB和LDHC基因分别插入到pRS424TEF质粒上，得到 重组质粒 pRS424TEF-LDHA，pRS424TEF-LDHB 和 pRS424TEF-LDHC。通过醋酸锂 /PEG 的转化 方法分别将重组质粒PRS424TEF-LDHA，pRS424TEF-LDHB和pRS424TEF-LDHC转到酿酒酵母 pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ三缺陷菌株，将转化菌株涂布在SD-Trp培养基中，30°C培养长出单菌 落，经测序验证，即得到分别表达LDHA、LDHB、LDHC的乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母。
[0050] 实施例3 :人的乳酸脱氢酶在pdcl Apdc5 Apdc6 Δ三缺陷菌株中的表达
[0051] (1)将表达LDHA、LDHB、LDHC的乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母，在含有和不含有抗霉 素 A的平板上划线后培养，以导入pRS424TEF的三缺陷菌株为对照，结果如图1所示。结果 显示，加入抗霉素 A后，LDHA或LDHC能够维持酿酒酵母pdcl Apdc5Apdc6A三缺陷菌株 的生长，LDHB不能弥补酿酒酵母pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ三缺陷菌株的生长。
[0052] (2)挑取乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母单菌落在SD-Trp培养基中生长至00_约 为I. 〇后，细胞用无菌水洗涤后，重新悬浮在5mL新鲜配置的SD-Trp培养基并使细胞数 为I. 6 X IOVmL并加入终浓度为10 μ g/mL的抗霉素 A。继续培养24h后，将培养液在转速 2, 100 X g下离心5min，上清液经0. 45 μ m滤膜过滤后，用HPLC进行检测乳酸的产生。HPLC 检测条件：Aminex HPX-87H 分析柱（300mmX 7. 8mm，Bio-Rad)，流动相为 5mM H2SO4，流速为 0. 6mL/min，柱温为50°C，二极管阵列检测器，检测波长为210nnuHPLC检测结果如图2所示， 结果表明，在酿酒酵母Pdcl Λ Pdc5 Λ Pdc6 Λ三缺陷菌株中表达LDHA或LDHC，加入抗霉素 A后，能够检测到乳酸的产生。同时对乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母表达产物进行了 western blot检测，结果显示，LDHA、LDHB、LDHC都能得到正常表达（如图3)。
[0053] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母，其特征在于，所述酿酒酵母缺失了丙酮酸脱羧酶 基因，且表达人的乳酸脱氢酶。2. 根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述缺失的丙酮酸脱羧酶基因是 PDC1、H)C5和H)C6;所述人的乳酸脱氢酶是LDHA、LDHB或LDHC。3. 根据权利要求2所述的酿酒酵母，其特征在于，所述roci、roc5和roC6分别是NCBI 上登录号为850733、850825、852978的基因；所述人的乳酸脱氢酶是LDHA、LDHB或LDHC分 别是NCBI上登录号为3939、3945、3948的基因。4. 一种权利要求1-3任一所述酿酒酵母的构建方法，其特征在于，所述方法是：（1)构 建roCl、PDC5和H)C6三基因缺失菌一酿酒酵母pdclApdc5Apdc6A; (2)将人的乳酸脱氢 酶LDHA、LDHB或LDHC连接到酵母表达质粒上，然后转化到酿酒酵母pdclApdc5Apdc6A 中，筛选正确的转化子，即为乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：（1)以酿酒酵母 W303-1A为出发菌株，通过同源重组的方法，敲除其roCl、PDC5、H)C6三个基因得到酿酒酵 母pdclApdc5Apdc6A; (2)将LDHA、LDHB或LDHC连接到pRS424TEF质粒上，得到重组质 粒PRS424TEF-LDHA、pRS424TEF-LDHB或pRS424TEF-LDHC，然后通过醋酸锂/PEG的转化方 法将重组质粒导入酿酒酵母pdclApdc5Apdc6A中，筛选，测序验证。6. -种利用权利要求1所述酿酒酵母表达人的乳酸脱氢酶的方法，其特征在于，所述 方法是在SD-Trp培养基中培养乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母，并用抗霉素A来阻断电子链传 递，使得人源化的乳酸发酵来代替乙醇发酵来维持糖酵解的进行。7. 权利要求1-3任一所述乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母生产的乳酸脱氢酶。8. 权利要求7所述乳酸脱氢酶在筛选抗癌药物方面的应用。9. 权利要求7所述乳酸脱氢酶在筛选调节乳酸脱氢酶活性的基因的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母及其构建方法，属于微生物技术领域和分子生物学技术领域。本发明采用基因同源重组的方法将酿酒酵母编码PDC的基因PDC1，PDC5和PDC6敲除掉，在酿酒酵母中表达来源于人的LDH并用抗霉素A来阻断电子链传递，使得人源化的乳酸发酵来代替乙醇发酵来维持糖酵解的进行。本发明顺利实现了人的乳酸脱氢酶的异源表达。本发明得到的乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母能够表达人的乳酸脱氢酶，在酿酒酵母pdc1Δ pdc6Δ pdc5Δ三缺陷菌株中表达LDHA或LDHC，加入抗霉素A后，能够生长并检测到乳酸的产生。本发明的乳酸脱氢酶人源化酿酒酵母将可以作为一种潜在的筛选抗癌药物以及能够调节乳酸脱氢酶活性相关基因的工具。
【IPC分类】C12N9/04, C12N15/53, C12N1/19, C12R1/865, C12N15/81
【公开号】CN104911118
【申请号】CN201510369294
【发明人】高晓冬, 中西秀树, 李子杰
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月29日