一种金龟子绿僵菌固体培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物发酵方法领域，涉及一种真菌的固体培养方法，特别是涉及一种金 龟子绿僵菌的固体培养方法。
【背景技术】
[0002] 20世纪中期以来，由于化学杀虫剂无限制地使用，严重污染了环境和农林牧产品， 危害了人畜健康，同时使自然生态系统遭到破坏。生物防治日益被人们所重视，利用昆虫病 原微生物防治害虫是生物防治的重要手段之一。真菌杀虫剂由于具有良好的扩散效果、较 长的宿存能力、独特的体壁入侵方式，以及对害虫不产生抗药性和易大量生产等特点，使得 真菌杀虫剂在森林害虫、土壤害虫和刺吸式口器害虫的生物防治中具有明显的优势。其中， 金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae)是世界性分布的杀虫真菌，能寄生8个目30个 科昆虫，利用金龟子绿僵菌防治害虫的研宄与实践已逾百年，其具有致病力强、对人、畜、作 物无害、不杀伤天敌、不污染环境、持效期长等特点，是一种可持续防治害虫的优良制剂，也 是当今用于生物防治的主要菌剂之一，可替代化学药剂的使用，在生物防治中具有重要的 应用价值。
[0003] 金龟子绿僵菌大量培养是满足生产上应用的基础。目前国内外金龟子绿僵菌固体 培养一般采用单一的浅盘式、框架式或者塑料袋培养法，培养过程中对湿度要求高，环境因 子调控困难，同时设备复杂、发酵周期长，污染率高，产品质量不稳定，生产效率较低，这些 因素制约了绿僵菌的生产应用和防治效果。
[0004]
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种发酵周期短、产量高且产品质量稳定的 金龟子绿僵菌固体培养方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种金龟子绿僵菌固体培养 方法，将金龟子绿僵菌液体菌种接种到固体培养基后装入可堆叠的、底面具有通孔的发酵 箱中，进行固体培养，包括两个时期，菌丝生长期（包含菌丝生长延滞期、对数生长期和生 长稳定期）和产孢期（菌丝生长衰退期）；
[0007] 所述的菌丝生长期为：在18~22°C环境中，将盛有接种过金龟子绿僵菌的固体培 养基的发酵箱在空发酵箱上逐层堆叠4~8层，最上层的发酵箱盖上盖体，进行密闭式发酵 3~4天，所述空发酵箱的底面不具有通孔；
[0008] 所述的产孢期为：菌丝生长期后，打开最上层的发酵箱的盖体并将所有发酵箱隔 开，或将发酵箱错开堆叠，在温度为23~27°C、湿度为80 %的环境中进行开放式发酵3~ 4天。
[0009] 本发明的有益效果在于：在固体培养前期堆叠 4~8个发酵箱进行发酵（不包括 底部的空发酵箱），这可有效保证在菌丝生长期所需求的高湿度，使菌丝迅速长满整个培养 基，同时极大降低培养过程中的污染几率；固体培养后期分离、隔开堆叠的发酵箱，采用开 放式发酵，可有效改善培养基的通气性能，促进分生孢子的产生。同时，堆叠式发酵箱轻巧、 移动方便、组装快捷、不受场地限制、容易清洗，可根据实际需要增减发酵箱数量，易实现规 模化生产。使用本发明的金龟子绿僵菌的发酵过程中基本不用调控环境湿度，发酵周期平 均< 8天，发酵产物的产孢水平均多I X IOltl孢子/g发酵物。本发明的发酵质量稳定、污染 率低，且不需要复杂的设备，对发酵室环境湿度要求低，降低了金龟子绿僵菌的生产技术门 槛，可实现金龟子绿僵菌的规模化生产。
【附图说明】
[0010] 图1为实施例1发酵过程固体料温度变化图。
[0011] 图2为实施例2发酵过程固体料温度变化图。
[0012] 图3为实施例1~5的发酵箱的立体图。
[0013] 图4为实施例1~5的空发酵箱的立体图。
[0014] 图5为实施例1~5固体培养前期发酵箱堆叠状态示意图。
[0015] 图6为实施例1~5固体培养后期发酵箱隔开状态示意图。
【具体实施方式】
[0016] 为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附 图予以说明。
[0017] 本发明最关键的构思在于：固体培养前期采用4~8个发酵箱堆叠进行密闭式发 酵，保证在菌丝生长期所需求的高湿度，使菌丝迅速长满整个培养基，同时极大降低培养过 程中的污染几率；固体培养后期采用开放式发酵，可有效改善培养基的通气性能，促进分生 孢子的产生。
[0018] 请参照图3~6,本发明提供一种金龟子绿僵菌固体培养方法，该方法将金龟子绿 僵菌液体菌种接种到固体培养基后装入底面具有通孔的、可堆叠的发酵箱中，进行固体培 养，包括两个时期，菌丝生长期和产孢期；
[0019] 所述的菌丝生长期为：在18~22°C环境中，将盛有接种过金龟子绿僵菌的固体培 养基的发酵箱在底层空发酵箱上逐层堆叠4~8层，最上层的发酵箱盖上盖体，进行密闭式 发酵3~4天，所述空发酵箱的底面不具有通孔；
[0020] 所述的产孢期为：菌丝生长期后，打开最上层的发酵箱的盖体并将所有发酵箱隔 开，或将发酵箱错开堆叠，在温度为23~27°C、湿度为80 %的环境中进行开放式发酵3~ 4天。
[0021] 从上述描述可知，本发明的有益效果在于：在固体培养的前3~4天（接种后第1 天为金龟子绿僵菌生长的延滞期，第2天为金龟子绿僵菌生长的对数生长期，第3~4天为 菌丝生长稳定期，此3个时期为金龟子绿僵菌菌丝生长期），在此期间采用4~8个发酵箱 堆叠进行发酵（不包括底部的空发酵箱），这可有效保证在菌丝生长期所需求的高湿度，使 菌丝迅速长满整个培养基，同时极大降低了培养过程中的污染几率；固体培养的后期（为 绿僵菌菌丝生长的衰退期，也是绿僵菌的产孢期）分离、隔开堆叠的发酵箱，采用开放式发 酵，可有效改善培养基的通气性能，促进分生孢子的产生。同时，堆叠式发酵箱轻便、移动方 便、不受场地限制、容易清洗，可根据实际需要增减发酵箱数量，易实现规模化生产。本发明 固体培养工艺简单，不需要复杂设备，发酵期间基本不需要调控湿度，发酵周期短，产品质 量稳定，降低了金龟子绿僵菌的生产技术门槛。
[0022] 进一步的，进行固体培养前，先配制固体培养基，按体积份将麦麸3份、谷壳3份、 米粉1份和玉米粉1份混合后得到固体培养料，每500g固体培养料混合后加入400~500g 水得到所述固体培养基。
[0023] 由上述描述可知，固体培养基配方中农副产品麦麸和谷壳占比大，并加入了米粉 和玉米粉等，配制简单，原料价廉、来源广泛，降低了生产成本。
[0024] 进一步的，固体培养基接种前，将固体培养基蒸汽高温灭菌30~50min，冷却后用 于金龟子绿僵菌的固体培养。所述发酵箱中的接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的厚度为 3~5cm，所述发酵箱的内部高度为15cm~25cm。所述的发酵箱采用PP材质，所述通孔的 直径为4~5謹。
[0025] 由上述描述可知，堆叠时按照逐个累叠的方式进行，基层为空发酵箱（不打孔）， 顶部用塑料盖盖好，以保证固体培养基的水分不会散失，故此过程中对环境湿度无要求；保 持固体培养基的厚度为3~5cm，发酵箱内部高度15cm-25cm，底部密布4~5_的通孔，培 养温度设定为18~22°C。实验中发现当通孔过小的情况下影响发酵容器中的温湿度分散 的均一性，将导致各箱层间的湿度相差大，发酵不均匀；而通孔过大后会出现培养基质漏到 下层的情况，不利于生产。箱体高度太低会导致发酵时所产生的热量无法及时扩散，出现 "烧料"现象，不利于菌种繁殖；箱体过高，会造成空间浪费，空间利用率下降，也会导致水蒸 气和温度扩散范围过广达不到发酵的温湿要求。选择合适的范围，既能保证菌丝生长快速， 又能避免发酵产热出现"烧料"现象。
[0026] 本发明的【具体实施方式】有：
[0027] 一种金龟子绿僵菌固体培养方法，包括如下步骤：
[0028] 1液体菌种的培养
[0029] I. 1菌种：产孢良好的金龟子绿僵菌。一般以斜面低温保存。
[0030] 1. 2斜面菌种：预先将金龟子绿僵菌菌种用试管斜面在25土 rc条件下传代培养、 活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为微生物培养中所通用的马铃薯葡萄 糖琼脂（PDA)培养基。
[0031] 1. 3液体培养基：为通用的马铃薯葡萄糖培养基，每