6] 发酵过程中固体料温度见图2。从图中可以清晰地看出绿僵菌固体发酵过程中的 不同生长时期，其中前12-24h为生长延滞期，固体料的温度与室温无明显差异，而延滞期 后，菌丝开始迅速生长，固体料温度也随之快速上升，显著的高于室温，即菌丝的对数生长 期，约1天后，固体料温度达到一个较高值，随后稳定在一个较高的温度范围，26~28°C，菌 丝大量生长，固体料完全被白色菌丝占据，此过程约2~3天。当固体料温度逐渐下降至 24°C以下时，表层菌丝开始出现绿色孢子时，标志着进入菌丝生长衰退期，此时，将前期堆 叠的发酵箱分隔、支起，固体料的温度迅速降低，孢子生长时期固体料中的生物活动没有对 数生长期和生长稳定期剧烈，固体的温度与室温差异不大。随着通气条件的变化，固体培养 基内的菌丝逐渐长出绿色的孢子。此过程约3~4天。随后即可进行干燥，干燥后，即成绿 僵菌固体发酵产物。
[0077] 请参照图3~6，本发明的实施例3~5为：
[0078] 以下实施例中所使用的菌株均为公知菌株。其区别于在于这些菌株自身生物学特 性存在一定的区别以及防治对象不同。
[0079] 表1为其他实施例配比与发酵产物情况。
[0080] 表 1
[0081]
[0083] 实施效果：
[0084] 使用本发明的金龟子绿僵菌的发酵周期均< 8天，发酵产物的产孢水平均 多IXlOici孢子/g发酵物。发酵产品已应用于多种林业主要害虫的防治中，取得了良好的 防治效果；本发明的发酵质量稳定、污染率低，且不需要复杂的设备，对发酵室环境湿度要 求低，降低了金龟子绿僵菌的生产技术门槛，可实现金龟子绿僵菌的规模化生产。
[0085] 综上所述，本发明提供的金龟子绿僵菌固体培养方法有益效果有：
[0086] 1、根据金龟子绿僵菌生长特性，在固体培养前期（绿僵菌生长的延滞期、对数生 长期和菌丝生长稳定期，菌丝生长期），使用发酵箱堆叠培养，培养空间密闭，因发酵产热 散发出来固体培养基中的水分可有效地保持在培养容器中，保证了培养环境始终保持较高 的湿度，从而满足菌丝生长需要的高湿度，克服了开放式培养中湿度无法控制的缺点；本发 明中发酵前期使用发酵箱堆叠发酵培养，使得培养料与外界隔绝，大大降低了传统浅盘或 框架式发酵过程中早期杂菌污染几率，同时由于菌丝在高湿度下生长迅速，绿僵菌菌丝很 快长满整个培养基，成为优势菌群，杂菌滋生的可能性大大降低，且即使出现污染的情况， 由于每发酵箱的培养空间独立，不会扩散蔓延；在绿僵菌生长后期（菌丝生长衰退期，产孢 期），对环境湿度要求没有菌丝生长期高，只需发酵室内湿度保持在80%左右即可，甚至过 高的湿度，会使得孢子二次萌发，或使得杂菌滋生，从而影响产孢的进程，故在此过程中，采 用开放式培养，增加通气量，可促进金龟子绿僵菌更快产孢，因此，本发明金龟子绿僵菌固 体培养过程中，基本不用调控环境湿度；
[0087] 2、本发明用于培养金龟子绿僵菌的固体培养基配方简单，原料主要为农副产品麦 麸和谷壳以及米粉和玉米粉，且麦麸和谷壳的占比高，廉价易得，成本低，制作简单，不仅使 农业废弃物得以有效利用，同时，固体培养基的间隙度、疏松度合适，通气性良好，培养过程 中无需额外通气；
[0088] 3、本发明的金龟子绿僵菌固体培养方法，工艺简单，不需要复杂设备，发酵周期 短，极大地提高了生产效率，同时堆叠式发酵箱轻便、装卸方便、机动灵活、可根据生产量增 减发酵箱数量，不受场地限制，生产可实现规模化，易控制，成功率高，产品质量稳定，可为 生产单位提供优质的金龟子绿僵菌菌剂，具有显著的社会和经济效益。
[0089] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括 在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：将金龟子绿僵菌液体菌种接种到固 体培养基后装入可堆叠的、底面具有通孔的发酵箱中，进行固体培养，包括两个时期，菌丝 生长期和产孢期； 所述的菌丝生长期为：在18~22°C环境中，将盛有接种过金龟子绿僵菌的固体培养基 的发酵箱在空发酵箱上逐层堆叠4~8层，最上层的发酵箱盖上盖体，进行密闭式发酵3~ 4天，所述空发酵箱的底面不具有通孔； 所述的产孢期为：菌丝生长期后，打开最上层的发酵箱的盖体并将所有发酵箱隔开，或 将发酵箱错开堆叠，在温度为23~27°C、湿度为80%的环境中进行开放式发酵3~4天。2. 根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：进行固体培养前， 先配制固体培养基，即按体积份将麦麸3份、谷壳3份、米粉1份和玉米粉1份混合后得到 固体培养料，每500g固体培养料混合后加入400~500g水搅拌后得到所述固体培养基。3. 根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：固体培养基接种 前，将固体培养基蒸汽高温灭菌30~50min，冷却后用于金龟子绿僵菌的固体培养。4. 根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：所述发酵箱的内 部高度为15~25cm。5. 根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：所述发酵箱中的 接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的厚度为3~5cm。6. 根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：所述的发酵箱采 用PP材质，所述通孔的直径为4~5mm〇7. 根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：一种金龟子绿僵 菌固体培养方法，包括如下步骤： 步骤1、液体菌种的培养：将金龟子绿僵菌菌种用盛有斜面培养基的试管在25±1°C条 件下传代培养、活化，当所述斜面培养基的斜面长满孢子时于无菌操作台中，从所述斜面培 养基的斜面挑取少量孢子及菌苔接入经蒸汽高温灭菌并冷却至室温的的液体培养基中；接 种后的液体培养基在恒温振荡箱24~26°C恒温培养60-72h，待长成粘稠菌丝体后即得所 述液体菌种； 所述斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基按重量份 包括200份马铃薯、20份葡萄糖和20份琼脂；所述液体培养基为马铃薯葡萄糖培养基，所 述马铃薯葡萄糖培养基按重量份包括200份马铃薯和20份葡萄糖； 步骤2、固体培养：按体积份将麦麸3份、谷壳3份、米粉1份和玉米粉1份混合后得到 固体培养料，每500g固体培养料混合后加入400~500g水搅拌后得到所述固体培养基，将 所述固体培养基进行蒸汽高压灭菌30~50min，冷却后将所述液体菌种按每100g固体培养 基中倒入10~20mL液体菌种的接种量接种到固体培养基中并搅拌，搅拌后将接种过金龟 子绿僵菌的固体培养基装入经过消毒的底部具有直径为4~5_通孔的PP材质的发酵箱 中，进行固体培养，包括两个时期，菌丝生长期和产孢期； 所述的菌丝生长期为：在18~22°C环境中，将盛有接种过金龟子绿僵菌的固体培养基 的、可堆叠的发酵箱在空发酵箱上逐层堆叠4~8层，最上层的发酵箱盖上盖体，进行密闭 式发酵3~4天，所述空发酵箱的底面不具有通孔； 所述的产孢期为：菌丝生长期后，打开最上层的发酵箱的盖体并将所有发酵箱隔开，或
【专利摘要】本发明提供一种金龟子绿僵菌固体培养方法，将金龟子绿僵菌液体菌种接种到固体培养基后装入底面具有通孔的发酵箱中进行固体培养，固体培养前期，在18～22℃环境中，将盛有接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的发酵箱在底面不具有通孔的空发酵箱上逐层堆叠4～8层，最上层的发酵箱盖上盖体，进行密闭式发酵3～4天；固体培养后期，打开最上层的发酵箱的盖体并将所有发酵箱隔开或将发酵箱错开堆叠，在温度为23～27℃、湿度为80％的环境中开放式发酵3～4天。本发明的有益效果在于：发酵过程中基本不需要进行湿度调控，发酵周期均≤8天，发酵产物的产孢水平均≥1×1010孢子/g发酵物，发酵质量稳定、污染率低，易于规模化生产。
【IPC分类】C12R1/645, C12N1/14
【公开号】CN104911111
【申请号】CN201510353627
【发明人】蔡守平, 何学友, 曾丽琼, 黄金水, 汤陈生
【申请人】南京林业大学, 福建省林业科学研究院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月24日