一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属微流控芯片技术领域，具体涉及一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法。
【背景技术】
[0002]自从1990年瑞士 Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer [I]首次提出微型全分析系统(μ-TAS)以来，微流控芯片以其体积小、液流可控、分离效率高、试剂和样品用量少、分析速度快、操作易自动化、低耗以及集成度高等等优点引起了国内外分析化学和生物医药等领域专家的广泛关注，在其方法学研宄迅速发展的基础上，微流控芯片在生物医学研宄、临床诊断、药物分析、食品安全、环境监测、法医和军事等领域显示了良好的应用前景[2-4]，是发展生物医药等领域高通量、多组分和低成本检测技术的理想平台。目前制约其广泛应用的瓶颈之一就是其较高的价格和较低的产量。
[0003]微流控芯片以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，以生命科学研宄为目前主要应用对象，是当前芯片实验室领域发展的重点。微流控芯片是把生物、医学、化学、食品、药品和环境监测等分析过程中的采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块几个平方厘米大的芯片上，自动完成分析全过程，具有广泛的适用性。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大应用潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等多学科交叉的崭新研宄领域。
[0004]微流控芯片微流通道尺寸在微米级，是纳升到微升级小体积样品的理想操作和分析平台，特别适用于生物医药分析和临床检测中小体积样品的酶法和免疫法分析，其最重要用途之一蛋白质的酶解和分析[5]。蛋白质酶解是蛋白组学中蛋白质分析的一个关键步骤，待测样品中的蛋白通过凝胶电泳分离后用蛋白水解酶水解成肽，然后用质谱测定其分子量得肽质量图谱，经检索有关蛋白质数据库后完成蛋白鉴定。传统的溶液酶解耗时(12小时以上)，加上蛋白水解酶自身酶解产生的肽也会干扰目标蛋白的鉴定，所以溶液酶解时蛋白和酶的比例通常要求在20~40:1 [5]，以降低游离蛋白酶自身酶解的干扰，但由于使用蛋白酶浓度较低，酶解效率不高，所以建立高效快速的新型蛋白质酶解方法具有重要意义。解决上述溶液酶解问题的主要途径就是使用固定化酶技术，通常使用的微流控芯片酶反应器是将蛋白酶如胰蛋白酶通过溶胶-凝胶包埋[6，7]技术固定在微流控芯片通道内表面。存在的问题是由于酶不是通过共价键固定，容易流失，影响酶解效果。此外，使用的微流控芯片采用微机电加工技术制作，成本较高。研制低成本的微流控芯片酶反应器具有重要的实际意义。
[0005]本发明将滤纸切成条状或需要的形状，通过热压封装在两片热塑性透明塑料片之间得纸芯微流控芯片，具有纸纤维填充通道。纸芯不仅是热压印时形成通道的模板，也是通道中的多孔填充材料，可用于蛋白酶等生物大分子的固定。经检索国内外有关数据库，未发现纸芯微流控芯片的报道。由于纸芯中的纤维素中的糖链含有邻二羟基和羟甲基，通过化学处理可引入多种基团，可用于蛋白酶等生物大分子的固定。
[0006]本发明采用高碘酸氧化法氧化纸芯微流控芯片中的纤维素得含有醛基的氧化纤维素，胰蛋白酶等蛋白酶水解酶通过氨基与通道中氧化纸纤维上的醛基形成共价键从而获得固定。由于酶通过共价键固定，其自身酶解被抑制，故可以使用较大的酶量，使酶解效率大幅提高。该反应器可将蛋白质的酶解时间从传统的溶液酶解的12小时以上大幅度降低到18秒以内，大大节约了酶解时间，提高了工作效率。本发明可为蛋白组学中蛋白的高效酶解和高通量鉴定提供新的技术手段，提出的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器具有制作简便、酶解时间短、样品用量少、价格低廉和稳定性好的优点。
[0007]参考文献
[1]ManzA, Graber N, Widmer HM.Sens.Actuators B 1990, I, 244-248.[2]Dittrich,PS, Tachikawa K, Manz A.Anal.Chem.2006, 78, 3887-3908.[3]AurouxPA, 1ssifidis D, Reyes DR, et al.Anal.Chem.2002, 74,2637-2652.[4]VerpoorteE.Electrophoesis 2002, 23, 677-712.[5]Liu S, Bao HM, Zhang LY, et al.Journal of Proteomics, 2013, 82, 1-13.[6]Qu HY, Wang H., Huang Y, et al.Anal.Chem.2004，76，6426-6433.[7]WuHL, Tian YP, Liu BH, et al.J.Proteome Res.2004, 3, 1201-1209.。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提出一种能够批量低成本生产，且可提高蛋白酶解效率的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法。
[0009]本发明提出的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，具体步骤为:
(1)将滤纸切成宽度为0.5-3毫米的长条状或其他需要的形状，用水润湿后贴在裁成芯片大小的热塑性透明塑料片上，晾干后盖上另外一片同样尺寸的钻有溶液连接孔的透明塑料片，夹于两片玻璃片间后用夹具加压；然后，连同夹具一起置于一温度为110-180°C的烘箱中加热5-15分钟，纸芯被封装在两片塑料片间，得具有纸纤维填充通道的纸芯微流控芯片，纸纤维填充通道宽度为0.5-3毫米；溶液连接孔位于纸纤维填充通道的末端；
(2)将高碘酸溶液注入纸纤维填充通道，使纸芯中纤维素糖链中的邻二羟基氧化生成醛基，用乙二醇水溶液清洗后，注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，酶分子中的游离氨基与氧化纤维素中的醛基反应形成席夫(Schiff)碱，从而实现蛋白酶的共价键固定，得蛋白酶解微流控芯片。
[0010]本发明中，步骤(I)中所述的滤纸可通过割字机、刀片、打花器和纸张模切机进行切割。切割的滤纸形状可为需要长度的长条状，也可为单十字交叉状、栅栏状、多角形状、螺旋状等其他形状。
[0011]本发明中，步骤(I)中所述的透明塑料片材质可为有机玻璃、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或聚氯乙烯等热塑性塑料。
[0012]本发明的步骤(I)中热压封装温度为110-180°c，热压封装时间为5-15分钟。
[0013]本发明的步骤(I)中使用的滤纸为厚度为100-300微米的定性或定量滤纸。
[0014]本发明的步骤(I)中，可使用长尾票价、金属文具夹和其他能产生压力的夹具对夹有纸芯的两片塑料片施加压力，使用的压力为1-15公斤/平方厘米。
[0015]本发明步骤(I)中，所述的纸芯微流控芯片中纸纤维填充通道的末端位置的溶液连接孔为直径1~3毫米的圆形小孔。
[0016]本发明步骤(2)中，所述蛋白酶可为胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白水解酶。
[0017]本发明步骤(2)中，所述高碘酸溶液的浓度为0.01-0.5 mol/L，蛋白酶的浓度为
0.5-10晕克/晕升。
[0018]本发明步骤(2)中，所述高碘酸溶液氧化纸纤维填充通道的时间为10-60分钟，温度为 10-40 °C。