[0019]本发明步骤(2)中，所述蛋白酶溶液与通道内的氧化纤维素的反应时间为10-60分钟，温度为0-20 °C。
[0020]本发明提出的一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器的制备方法，进一步详述如下:
将厚度为0.1-2毫米的热塑性透明塑料板裁成需要制备的芯片尺寸的小片2或4，一般长30-100毫米，宽10-20毫米。塑料片材质可为有机玻璃、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚氯乙烯等热塑性塑料。将厚度为100-300微米的定性或定量滤纸通过割字机、刀片、打花器或纸张模切机切成宽度为0.5-3毫米的条状，或其他需要的形状，如单十字交叉、栅栏、多角形、螺旋等。如图1所示，滤纸条或其他需要形状的滤纸片I可用水润湿后贴在裁成芯片大小的热塑性透明塑料片2 (下塑料片)上，晾干后盖上另外一片同样尺寸的钻有直径为1~3毫米的溶液连接孔的透明塑料片4 (上塑料片)，夹于玻璃片3和6间后用夹具施加外压5。然后，将该装置置于一温度为110-180°C的烘箱中加热5-15分钟，纸芯被封装在两片塑料片2和4间，可得具有纸纤维填充通道7的纸芯微流控芯片，含有纸芯的通道7的宽度为0.5-3毫米。纸芯微流控芯片中纸纤维填充通道7的末端与溶液连接孔9连接。可使用长尾票价、金属文具夹和其他能产生压力的夹具对夹有纸芯的两片塑料片2和4施加压力，封装使用的压力为1-15公斤/平方厘米。本发明的制备的芯片可为单通道(图2A)、多通道(图2B)、单十字交叉(图4A)、栅栏式(图4B)、多角形和螺旋纸芯微流控芯片。
[0021]将含有0.01-0.5 mol/L高碘酸的100mmol/L乙酸盐缓冲溶液(pH 4.0)溶液通过溶液连接孔9注入纸纤维填充通道7，在室温下反应10-60分钟，使纸芯中纤维素糖链中的邻二羟基氧化生成醛基，用0.2 mol/L乙二醇水溶液清洗后，注入0.5-10毫克/毫升蛋白酶溶液，在0-20°C反应10-60分钟。酶分子中的游离氨基与氧化纤维素中的醛基反应形成席夫(Schiff)碱，从而实现蛋白酶的共价键固定(反应式见图5)，得蛋白酶解微流控芯片。蛋白酶可为胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白组学和蛋白质分析中常用的蛋白水解酶，其中最常用的是胰蛋白酶。
[0022]将本发明制备的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器14通过硅橡胶连接管12与注射泵10相连接，构成纸芯微流控芯片蛋白酶解系统(见图6)，蛋白质样品溶液11用20毫摩尔/升碳酸氢铵水溶液(pH 8.1)制备，通过注射泵10注入纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器14，流速为5-50微升/分钟。流出的酶解液收集在小离心管中。质谱分析时，样品点在质谱点样板15上，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定，可得蛋白样品酶解液的肽质量图谱16，经检索有关蛋白质数据库后完成蛋白鉴定。
[0023]本发明首次提出了一种纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法，通过热压封装纸芯的方法制备纸芯微流控芯片，在纸纤维填充通道中通过共价键固定蛋白酶后得蛋白酶解反应器。由于纸纤维填充通道为多孔材料，表面积大，可提高蛋白酶的固定量。纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器提高了酶试剂的使用效率，节约了蛋白酶，不仅降低了蛋白酶解的成本，也大幅提高了蛋白酶解的效率。本发明中提出的纸芯微流控芯片制备方法，不需要使用昂贵的微机电加工技术和设备，具有快速简便、设备简单和成本低廉的优点，在微流控芯片的批量低成本生产方面有良好的应用前景。本发明中制备的纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器，在蛋白质研宄、临床诊断、环境监测、生命科学研宄和食品分析等领域有良好的应用前景。
【附图说明】
[0024]图1为本发明中热压封装法制备纸芯微流控芯片流程示意图。其中，(A)将滤纸条或其他需要形状的滤纸片1，用水润湿后贴在裁成芯片大小的热塑性透明塑料片2上；(B)盖上另外一片同样尺寸的钻有溶液连接孔的透明塑料片4 ; (C)夹于两片玻璃片3和6间后用夹具施加外压5 ; (D)该装置于烘箱中加热5-15分钟，纸芯被封装在两片塑料片2和4间；(E)移去玻璃片3和6后得具有纸纤维填充通道7的纸芯微流控芯片8。
[0025]图2为采用本发明中热压封装技术制备的(A)单通道和(B)Il通道纸芯微流控芯片的实物照片以及(C)通道末端连接有纸纤维填充通道7的溶液连接孔9的显微镜照片。
[0026]图3为本发明制备的纸芯微流控芯片中纸纤维填充通道7断面的显微镜照片的显微镜照片。其中，(A)为放大10倍，(B)为放大50倍。
[0027]图4为(A)采用本发明中热压封装技术制备的(A)单十字交叉和(B)栅栏式纸芯微流控芯片的实物照片。
[0028]图5为本发明中纸芯微流控芯片中纸纤维高碘酸氧化形成氧化纤维素及其胰蛋白酶与氧化纤维素固定化反应实现共价键固定的反应式。
[0029]图6为图5为本发明中蛋白微流控芯片酶解系统示意图。
[0030]图7为使用本发明制备的纸芯微流控芯片酶反应器酶解牛血清白蛋白(A)和溶菌酶(B)产物的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图。流速10微升/分钟，酶解时间〈18秒，蛋白质溶液浓度200纳克/微升(溶于20毫摩尔/升碳酸氢铵水溶液(pH 8.1)中)，所有匹配的肽段用标出。
[0031 ] 图中标号:I为滤纸条或其他需要形状的滤纸片，2为下塑料片，3为下玻璃片，4为上塑料片，5为外压，6上玻璃片，7为纸纤维填充通道，8为纸芯微流控芯片，9为溶液连接孔，10注射泵，11为待酶解的蛋白质样品溶液，12为硅橡胶连接管，13为蛋白酶解液收集孔，14为纸芯微流控芯片酶反应器，15为质谱点样板，16为蛋白样品酶解后获得含肽段的酶解液基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图示意图。
【具体实施方式】
[0032]下面通过实施例和附图进一步描述本发明:
1、单通道纸芯微流控芯片蛋白酶解反应器及其制备方法
将厚度为I毫米的有机玻璃板裁成需要制备的芯片尺寸(60毫米X 16毫米X I毫米)的小片2或4。将厚度为200微米的定性滤纸通过刀片切成长度为54毫米宽度为2毫米的纸条I。如图1所示，用水润湿后贴在裁成芯片大小的有机玻璃片2上，晾干后盖上另外一片同样尺寸的钻有直径为2毫米的溶液连接孔的有机玻璃片4，夹于玻璃片3和6 (76.2毫米X 25毫米X 1.2毫米)间后用弹簧驱动加压装置施加外压5，压力为6公斤/平方厘米。然后，将该装置置于一温度为130°C的鼓风烘箱中加热10分钟后，纸芯被封装在两片塑料片2和4间，与玻璃片3和6分离后可得具有纸纤维填充通道7的单通道纸芯微流控芯片，含有纸芯的通道7的宽度为2毫米。图2A为单通道纸芯微流控芯片的实物照片。如图2C所示，纸芯微流控芯片中纸纤维填充通道7的末端与溶液连接孔9连接。图3为本发明制备的纸芯微流控芯片中纸纤维填充通道7断面的显微镜照片的显微镜照片。可见纸纤维微流通道完整，两有机玻璃片2和4间无裂缝，封装质量良好。
[0033]将含有0.2 mol/L高碘酸的100 mmol/L乙酸盐缓冲溶液(pH 4.0)溶液通过溶液连接孔9注入单通道纸纤维填充通道7，在室温下反应30分钟，使纸芯中纤维素糖链中的邻二羟基氧化生成醛基。通道中残留的未反应的去高碘酸需用0.2 mol/L乙二醇水溶液清洗除去。然后，通过溶液连接孔9注入0.5-10毫克