在酵母中从d-葡萄糖生产抗坏血酸的制作方法

专利名称：：在酵母中从d-葡萄糖生产抗坏血酸的制作方法
技术领域：
：本发明一般地涉及抗坏血酸生产的领域。更具体地，它涉及从酵母，包括重组酵母生产L-抗坏血酸的方法。
背景技术：
：L-抗坏血酸(维生素C)是一种强的水溶性抗氧化剂，其对于人的所有组织类型的生长与维持是极其重要的。抗坏血酸的一个重要作用是它参与胶原的产生，胶原是结締组织，肌肉，腱，骨，牙齿与皮肤的基本细胞组分。胶原也是血管，擦伤和骨折的修复所需要的。抗坏血酸有助于调节血压，促进降低胆固醇含量，而且有助于从动脉壁除去胆固醇沉积。抗坏血酸也有助于叶酸的代谢，调节铁的吸收，而且是氨基酸L-酪氨酸与L-苯丙氨酸转变成去曱肾上腺素所需要的。色氨酸转变成五羟色胺，其是负责睡眠，疼痛控制和健康的神经激素，也需要抗坏血酸的充足供应。缺乏L-抗坏血酸会削弱胶原的产生，而且导致关节疼痛，贫血，神经紧张和生长緩慢。其它的作用是降低的免疫反应和增加的感染易感性。最极端的抗坏血酸缺乏形式是坏血病，一种迹象为关节肿胀，齿龈出血，和皮肤表面下的毛细血管出血的疾病。如果不进行治疗，坏血病是致命的。尽管肠很容易吸收抗坏血酸，但是它在摄取2到4个小时内排泄到尿中。因此，它不能在体内贮存。所有的高等植物和多数高等动物，但不是人，蝙蝠，一些鸟类和多种鱼类的肝脏或肾脏都产生L-抗坏血酸。因此，人必须从足够的饮食来源或增补来获得足够量的抗坏血酸，以保持最佳的健康状态。抗坏血酸的食品来源包括柑桔类水果，马铃薯，胡椒，绿叶蔬菜，番茄和浆果。增补形式的抗坏血酸如丸剂，片剂，粉末，嚢剂和糖浆也是市场上可买到的。L-抗坏血酸由美国食品与药品管理局批准用作营养增补剂和化学防腐剂，而且列在公认为安全的物质的FDA目录上。L-抗坏血酸可用于软饮料中，作为调味成分的抗氧化剂，用于肉类和含肉产品中，用于熟化和酸洗，用于面粉中以提高烘焙质量，用于啤酒中作为稳定剂，用于脂肪和油类中作为抗氧化剂，以及用于各种各样的食品中以便抗坏血酸富集。L-抗坏血酸也可用于去斑剂，理发产品，塑料制造，摄影和水处理中。产生抗坏血酸的生物合成途径的酶还没有鉴定完全。目前了解的植物中生理途径如图1所示。已经报道了植物中抗坏血酸合成的两个分立的途径。在一个途径中，L-抗坏血酸从D-葡萄糖经由L-山梨糖酮合成(LoewusM，W.等，1990，Plant.Physiol.94，1492-1495)。目前的证据表明，主要的生理途径是从D-葡萄糖经由L-半乳糖和L-半乳糖酸-l，4-内酯到L-抗坏血酸(WheelerG.L.等1998，Nature,393，365-369)。最后两个步骤由L-半乳糖脱氢酶和L-半乳糖酸-l，4-内酯脱氬酶催化。已经分离并表征了最后一个酶，而且已经克隆并测序了来自甘蓝(5環s/a0/e潔ea)的基因(OstergaardJ.等1997，J.Biol.Chem.，272，30009—30016)。为了用作营养增补剂，可以从天然来源分离抗坏血酸或如Reichstein方法的改变，通过氧化L-山梨糖化学合成抗坏血酸(美国专利2，265，121)。仍然需要通过方便的过程生产抗坏血酸的方法。合成应该是对映选择性的，因为只有抗坏血酸的L-对映体是具有生物学活性的。一种可能的方法是从微生物生产L-抗坏血酸。微生物可以是易于以工业规模生长的。尽管过去已经报道了从微生物和真菌生产L-抗坏血酸，但是最近的证据证明发现的是L-抗坏血酸类似物，而不是L-抗坏血酸(HuhW.K.等1998，Mol.MicroMoi.30，4，895-903,HancockR.D.等，2000，FEMSMicrobiol.Let.186，245—250，DumbravaV.A.等1987，BBA926，331—338,NickJ.A.等，1986，PlantScience,46，181-187)。已经报道了在酵母(假丝酵母和糖酵母属的种)中生产赤型抗坏血酸(HuhW.K.等，1994，Eur.J.Biochem，225，1073-1079，HuhW.K.等，1998，Mol.Microbiol.30，4，895-903)。在这些酵母中，生理途径建议从D-葡萄糖经由D-阿拉伯糖和D-阿拉伯糖酸-1，4-内酯到赤型抗坏血酸(KimS.T.等，1996，BBA，1297，1-8)。已经表征了来自白色假丝酵母以及啤酒糖酵母的酶D-阿拉伯糖脱氢酶和D-阿拉伯糖酸-1,4-内酯氧化酶。值得注意的是，L-半乳糖和L-半乳糖酸-l，4-内酯是这些体外活性的底物。已经通过给野生型假丝酵母细胞喂养L-半乳糖酸-l，4-内酯，获得了体内L-抗坏血酸的生产(国际专利申请WO85/01745)。最近，已经表明当与L-半乳糖，L-半乳糖酸-l，4-内酯或L-古洛糖酸-l,4-内酯一起孵育时，野生型啤酒糖酵母细胞内积累了L-抗坏血酸(Hancock等，2000，FEMSMicrobiol.Lett.186，245-250，SpickettCM.等，2000，FreeRad.Biol.Med.28，183—192)。与L-半乳糖酸-1,4-内酯一起孵育的野生型假丝酵母细胞在培养基中积累L-抗坏血酸，表明该酵母具有释放细胞内积累的L-抗坏血酸的生物学机制；实际上，L-抗坏血酸是一种复杂分子，它在培养基中的积累与简单扩散过程不相关，而应该取决于易化或主动转运是合理的。在高等真核生物(哺乳动物)细胞中鉴定和表征L-抗坏血酸转运分子，支持了该结论(DaruwalaR.等，1999,FEBSLetters.460，480-484)。但是，L-抗坏血酸转运分子在酵母属当中还没有描述。尽管如此，虽然生长于含有L-半乳糖酸-l，4-内酯的培养基中的假丝酵母细胞在培养基中积累L-抗坏血酸，但是，令人惊讶地，从未描述过野生型啤酒糖酵母细胞在培养基中积累L-抗坏血酸。一种用于大规模生产抗坏血酸的合乎需要的方法包括使用基因工程微生物(即，重组微生物)。原核与真核微生物现在都可以很容易而且成功地用于生产异源蛋白质以及用于生产异源代谢产物。原核生物当中，经常使用大肠杆菌与枯草杆菌。真核生物当中，经常使用啤酒糖酵母与乳酸克鲁维酵母。0stergaard等在啤酒糖酵母中克隆了编码来自花椰菜的L-半乳糖酸-l，4-内酯脱氩酶的基因(J.Biol.Chem.，1997，272，48，30009-30016)。虽然，在体外，作者在酵母细胞提取物中发现了L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶活性(细胞色素C测定，参见0stergaard等)，但是在体内证明没有产生L-抗坏血酸。Berry等，国际专利申请W099/64618论述了抗坏血酸的植物生物合成途径的潜在应用；特别强调了催化GDP-D-甘露糖转变成GDPL-半乳糖的活性。但是，催化该步骤的酶的表征还没有详细描述。超表达的大肠杆菌同源物结果是无活性的。Smirnoff等，W099/33995，论述了使用L-半乳糖脱氢酶生产抗坏血酸。酶純化自豌豆苗，并确定了其N-末端蛋白质序列。Roland等，美闺专利4，595，659和4，916，068，论述了使用非重组假丝酵母菌株使L-半乳糖酸底物转变成L-抗坏血酸。Roland等描述了负责的酶为L-半乳糖酸-l，4-内酯氧化酶。Ku歸r，W000/34502论述了在布蓝克氏假丝酵母和迪门纳隐球酵母中生产L-抗坏血酸，这些酵母在生产中能使用2-酮基-L-古洛糖酸作为唯一的碳源。Kumar明确地排除了通过涉及L-半乳糖酸内酯氧化酶的途径或通过L-半乳糖酸前体的转变来从酵母进行生产。之前，我们已经报道了通过用，尤其是L-半乳糖脱氢酶(LGDH)，D-阿拉伯糖酸-l，4-内酯氧化酶(ALO)或两者转化的并生长在含有一种或多种L-半乳糖酸-l，4-内酯，L-古洛糖酸-1，4-内酯或L-半乳糖的培养基中的啤酒糖酵母来生产L-抗坏血酸(美国专利6,630,330)。仍然需要通过方便的发酵工艺生产抗坏血酸的方法。从D-葡萄糖开始生产L-抗坏血酸的方法也是合乎需要的。　
发明内容在一个实施方案中，本发明涉及生产L-抗坏血酸的方法，包括a)获得用编码甘露糖差向异构酶(ME)的编码区功能性转化的重组酵母；b)在含有D-葡萄糖的培养基中培养重组酵母，从而形成L-抗坏血酸,和c)分离L-抗坏血酸。在另一个实施方案中，本发明涉及用编码甘露糖差向异构酶(ME)的编码区功能性转化的重组酵母。在该方法和重组酵母的更进一步的实施方案中，酵母可以用编码肌醇磷酸酶(MIP)的编码区进一步地功能性转化。本发明提供了通过方便的发酵工艺从D-葡萄糖生产L-抗坏血酸的方法。图1显示了从D-葡萄糖合成L-抗坏血酸的主要植物途径。图2显示了在缺乏(图2A)和存在(图2B-2C)氧化胁迫时，BY4742和YML007w酵母在660nm处的光密度。Yaplp激活了响应氧化胁迫所需的基因；缺失该基因导致所观察到的表型。图3显示了在存在氧化胁迫和添加抗坏血酸到培养基中时，BY4742wt与YML007w酵母在660nm处的光密度(图3A-3B)。图4显示了存在氧化胁迫时，BY4742wt;表达ALO，LDGH与ME的YML007w;和表达ALO，LDGH，ME与MIP的YML007w酵母在660nm处的光密度(图4A-4B)。图5显示了在缺乏(图5A)和存在(2mM的仏02)氧化胁迫时，野生型GRFc;表达ALO，LDGH与ME的GRF18U;和表达ALO，LDGH，ME与MIP的GRF18U酵母菌林在660nm处的光密度。示例性实施方案的描述在一个实施方案中，本发明涉及生产L-抗坏血酸的方法，包括a)获得用编码甘露糖差向异构酶(ME)的编码区功能性转化的重组酵母；b)在含有D-葡萄糖的培养基中培养重组酵母，从而形成L-抗坏血酸，和c)分离L-抗坏血酸。"重组"酵母是这样的酵母，其含有酵母中非天然存在的核酸序列或内源核酸序列的另外的单拷贝或多个拷贝，其中核酸序列通过人的行为被引入到酵母或其祖细胞中。重组DNA技术是公知的，如Sambrook等的分子遗传学实验手册，美国冷泉港实验室出版，其提施方案中，同源和/或异源基因的编码区分离自具有该基因的生物体。所述生物体可以是细菌，原核生物，真核生物，微生物，真菌，植物或动物。的细胞中提取。此后，编码区可通过任何适当的技术分离。在一种已知的技术中，编码区是通过以下步骤分离的首先，制备基因组DM文库或cDNA文库，其次，在基因组DNA文库或cDNA文库中鉴定该编码区，如通过用标记的核苷酸探针探测该文库，该标记的核苷酸探针选择为或假设为与该编码区至少部分地同源，确定该编码区的表达是否赋予含有该编码区的文库微生物可检测的表型，或通过PCR扩增所需的序列。用于分离编码区的其它已知的技术也可以使用。待转化的酵母可以选自酵母的任何已知的属和种。酵母是N.J.W.Rreger-vanRij,"TheYeasts",Vol.1ofBiologyofYeasts,Ch.2，A.H.Rose和J.S.Harrison,Eds.AcademicPress,London,1987描述的。在一个实施方案中，酵母属于糖酵母属(5^ccAsTO/z7/ces)，接合酵母属(2ygosacc力sro迈7ces)，假丝酵母属(Ca/^/cTa)，汉逊酵母属(&/^e/m/a)，克鲁维酵母属(i7"7rero迈/ce51)，德巴利酵母属("e6arc迈/ce》，拿逊酵母属(^&o/n'a)，油脂酵母U&o/z77ce力，；求拟酵母属(r。rw7o;^i力，克勒克酵母属(r^ecirera),毕赤氏酵母属(尸/c力2'a)，裂殖酵母属(Sc力/zosaccAar(M7ces),三角酵母属(7>/go/2o;s/s),酒香酵母属(Sre〃細/z/戸力，隐球酵母属(Cr/;^co歸力，丝孢属(7y/c力os;oro")，短梗霉属C4"reo6as/cT/M)，油脂酵母属(Z/;o迈/cw),法夫酵母属(/^a/Y7a),红酵母属0Aoc/otari//a)，耶罗威亚酵母属(r"/^w7'a)或许旺酵母属(Sc力w/7;7/咖/ce力，等等。在进一步的实施方案中，酵母可以是酵母属，接合酵母属或克鲁维酵母属。仍然在进一步的实施方案中，酵母可以是哞酒糖酵母(&cereWWae)，乳酸克鲁维酵母7sc〃》或拜耳接合酵母种(Z6a/h7)。仍然在更进一步的实施方案中，酵母是啤酒糖酵母菌林GRF18U，W3031B,BY4742(船ra，'力/s》/eW,EuroScarf保藏号Y10000)或YML007w(BY4742AYapl)(船ra/7eW,""J,/s/]EuroScarf保藏号Y10569;拜耳接合酵母ATCC60483;或乳酸克鲁维酵母PM6-7A。重组酵母用编码甘露糖差向异构酶(D-甘露糖L-半乳糖差向异构酶；ME)的编码区功能性转化。ME是任何GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶(5.1.3.18)，其指的是催化GDP-甘露糖转变成GDP-L-半乳糖的酶。示例性的ME以SEQIDNO:1提供。在一个实施方案中，ME与SEQIDNO:1具有至少大约95%的同一性。在更进一步的实施方案中，ME与SEQIDNO:l具有至少大约98%的同一性。"同一性"可以通过使用CiustalW程序和它的缺省值进行的序列比对来确定，即DNA缺口打开罚分-15.0，DNA缺口延伸罚分-6.66，DNA矩阵-同一性，蛋白质缺口打开罚分-10.0，蛋白质缺口延伸罚分-O.2,蛋白质矩阵-Gonnet。同一性可以才艮据ClustalW文档编制所描述的方法计算对于待比对的每对序列计算配对分数。这些分数呈现于结果的表格中。计算配对分数，除以所比较的残基的数目(缺口位置除外)，作为最佳序列比对中的同一性数字。这些分数最初都是作为同一性百分比分数计算的，然后通过除以100并从1.0中减去以得到每个位点的差异数而换算成距离。我们没有校正这些初始距离中的多个置换。因为配对分数的计算与所选择的矩阵和缺口无关，所以对于特定的序列对它将始终是相同的值。仍然在更进一步的实施方案中，ME具有SEQIDN0:1。在一个实施方案中，重组酵母用编码肌醇磷酸酶(MIP)的编码区进一步地功能性转化。MIP是任何肌醇磷酸酶(3.1.3.25),其指的是催化L-半乳糖-lP转变成L-半乳糖的酶。例如，L-半乳糖-l-磷酸酶也催化L-半乳糖-IP转变成L-半乳糖并且是根据这个定义的MIP。在一个实施方案中，MIP具有以SEQIDN0:2提供的序列。在一个实施方案中，MIP与SEQIDNO:2具有至少大约95%的同一性。在更进一步的实施方案中，MIP与SEQIDNO:2具有至少大约98。/。的同一性。仍然在更进一步的实施方案中，MIP具有SEQIDNO:2。在一个实施方案中，重组酵母用编码选自L-半乳糖脱氢酶(LGDH)，L-半乳糖酸-l，4-内酯脱氢酶(AGD)，D-阿拉伯糖脱氢酶(ARA)，D-阿拉伯糖酸-l,4-内酯氧化酶(AL0)或L-古洛糖酸-l，4-内酯氧化酶(GL0)的酶的编码区进一步地转化。本发明不局限于已知用于在植物，酵母或其它的生物体中生产L-抗坏血酸中间体或L-抗坏血酸的途径的酶。在另一个实施方案中，本发明涉及用ME或ME和MIP二者转化的微生物，其是抗胁迫的或强健的。仍然在另一个实施方案中，该微生物可以用LGDH，AL0，ME或LGDH，AL0,ME和MIP转化。该孩t生物可以是任何微生物，例如，细菌，酵母或另一种真菌(如丝状真菌)，培养的动物细胞或培养的植物细胞。在一个实施方案中，该微生物是酵母。普遍认为胁迫会导致干扰微生物(酵母)的生物加工。胁迫可以是细胞(内部或胞内)来源的，环境(外部或胞外)来源的，或二者。内部来源的胁迫的经典例子包括蛋白质和代谢物的超量产生(以重量/体积计)和蛋白质与代谢物的超量生产率(以每单位时间的重量/体积计)，等等。外部来源的胁迫的例子包括高渗透性，高盐度，氧化胁迫，高温或低温，高pH值或低pH值，有机酸的存在，有毒化合物的存在，以及常量和微量营养物饥饿，等等。胁迫一般是由胁迫物(或刺激)引起的。胁迫物是对细胞的消极影响，与缺乏胁迫物时所需要的相比其需要该细胞付出更大的努力来保持平衡。这种更大的努力会导致较高或较低的代谢活性，较低的生长率，较低的存活力，或较低的生产率，等等。胁迫物是物理，化学或生物性质的物质，其体现出对于任何给定生活型通常的胞内或胞外条件的改变。因此，尽管特定条件(例如，65。C的温度)可能对通常在37。C生存的某个物种是胁迫的(或甚至致死的)，但是该温度对嗜热生物却是最佳的。不考虑来源，胁迫可以具有不同的作用，包括较高或较低的代谢活性，较低的生长率，较低的存活力，或较低的生产率，等等。细胞或分子水平的作用可包括损害DNA，损害脂质，损害蛋白质，损害膜，损害其它分子和大分子，产生活性氧类别(ROS)，诱导凋亡(细胞程序死亡)，细胞坏死，细胞裂解，破坏细胞的完整性，以及削弱细胞存活力，等等。R0S可以通过胞内和胞外刺激产生。大多数内源性R0S是通过从线粒体电子传递链渗漏这些类别而产生的。此外，胞质酶系统，包括NADPH氧化酶，以及过氧化物酶体代谢的副产物也是R0S的内源性来源。R0S的产生也可以通过暴露于许多外源性物质和事件包括电离辐射(IR),紫外线，化疗药，环境毒素和过热而发生。由胞内R0S引起的氧化性损伤可导致DNA碱基修饰，单链和双链断裂，以及形成脱嘌呤/脱嘧啶损伤，其中许多是有毒的和/或致突变的。因此，所产生的DNA损伤也可能直接导致有害的生物学后果(Tiffany,B.等，NucleicAcidsResearch,2004，Vol.32，No.12，3712-3723)。在工业过程中，其中生物体用作生产的手段，对生物体的胁迫一般导致较低或零产物生产，较低或零生产率，较低或零产物产量，或其中的二者或多者。因此胁迫是非常不受欢迎的现象，用于最小化胁迫的技术将是有用的。如用于该实施方案中的，"生产"指的是通过微生物制备一种或多种产物的过程。(微生物本身可以是产物，或通过微生物的代谢过程产生或修饰的化合物可以是产物，例如蛋白质，有机酸，维生素或抗菌素)。该过程开始之后，可以通过确定每重量或体积的维持微生物的生长和生存的培养基，或每重量或体积的微生物的生物质产生的产物的重量，随时对生产进行定量。"生产率"指的是如上述在规定的一段时间内定量的生产的量(例如，如每小时g/L，每周mg/L,或每小时g/g的生物质的速率)。"产量"指的是根据转变成产物的底物的量产生的产物的量。菌林的胁迫耐性，胁迫抗性，或强健性，如这里使用的，指的是樣t生物在生产过程中显示较好的工业性能。这可以表现为下述之一较好的抵抗胁迫的能力，减少胁迫对生物体或生产率的消极影响，增加生长率或增加细胞密度，降低生产率抑制，减少细胞死亡率(增加存活力)，降低生长抑制，或防止由于胁迫条件所致的细胞失活。我们已经观察到，与未用ME或ME和MIP二者转化的酵母相比，用ME或ME和MIP二者转化的酵母具有更大的胁迫抗性或强健性。这种抗性可以对抗许多胁迫物。这种更大的胁迫抗性可以表现为下列情况中一种或多种在培养中表达ME或ME+MIP的微生物更快的生长速率，在培养中表达ME或ME+MIP的微生物更大的细胞密度，在培养中表达ME或ME+MIP的微生物更大的存活率，在培养中表达ME或ME+MIP的微生物更大的生产能力。细胞存活率的量度是存活力(一般以相对于细胞总数的活细胞分数表示)。存活力可以确定为给定细胞在适当的琼脂平板上形成集落的能力(繁殖能力)。而且如果细胞显示代谢活性或如果它们的细胞膜是完整的，则可以认为它们是能存活的。应当理解，微生物的独特群体可以描述为能存活的，而且从一种到另一种的直接推论是不可能的。例如，仍然具有代谢活性的细胞可能不再是可繁殖的(集落形成)。因此，可以应用不同的方法确定培养物的存活力，而得出不同的结果。典型的方法包括在琼脂平板上铺板，以确定集落形成单位的数目，用锥虫蓝染色并在显微镜下计数，藉此死细胞变蓝，而活细胞由于完整的膜而着色较少。其它的方法包括流式细胞术，藉此细胞用不同的化合物包括碘化丙锭(完好的膜防止进入)，溴化乙锭(代谢活性细胞排斥染料)等等进行染色。虽然不想受理论的束縛，但是我们认为通过描述的实施方案实现的较大的胁迫抗性源于能提供较大的氧化胁迫抗性的微生物中抗氧化剂水平(具体地，L-抗坏血酸)的增加。我们认为这种较大的胁迫抗性使表达ME或ME+MIP的微生物(本身或用另外的编码区转化的)，特别适于在工业发酵中生产代谢产物。在另一个实施方案中，在发酵期间微生物如酵母的生产，生产率，或由其生产的产物的产量通过用编码甘露糖差向异构酶(ME)的编码区功能性地转化该微生物而增加。在另一个实施方案中，在发酵期间，微生物如酵母的生活力，如由形成集落的能力，代谢活性或膜完整性所定义的，通过用编码甘露糖差向异构酶(ME)的编码区功能性转化该微生物而增加。总之，本发明可以降低或消除一般在微生物生产过程期间遇到的胁迫的消极影响。也就是说，可以通过表达上述的酶确立或增加微生物的L-抗坏血酸含量，而增加微生物的生产，生产率，产量或存活力。因此，在孩i生物中表达ME，或ME以及下列酶MIP，AL0，或LGDH中的一种或多种是特别有用的，条件是该微生物将在渗透胁迫的条件下培养。渗透胁迫是一种状况，其中微生物遇到不同于最佳渗透性的渗透性，该最佳渗透性对于相应的孩吏生物被限定为250mOsmol或更高，或特别地为500mOsmol或更高或者750mOsmol或更高。对于啤酒糖酵母，渗透性大于500mOsmol，或大于750m0smol，或大于1000mOsmol的状况是胁迫的。此外，在微生物中表达ME，或ME以及下列酶MIP，AL0，或LGDH中的一种或多种是特别有用的，条件是该微生物将在pH胁迫的条件下培养。pH胁迫是这样一种状况，其中微生物遇到不同于最佳pH值的pH值，该最佳pH值为适于相应的微生物生产的pH值，其为超过1个，或超过2个，或超过3个pH单位。对于哗酒糖酵母，用于进行生物加工的最佳pH值一般为5。小于4的pH，或小于3的pH，或小于2的pH，或大于6的pH，或大于7的pH,或大于8的pH是胁迫的，而且在本发明的上下文中，如果酵母在这样的pH条件下用作生产宿主，则在酵母如啤酒糖酵母中表达所述的基因看来是有用的。在微生物中表达ME,或ME以及下列酶MIP，ALO,或LGDH中的一种或多种也是特别有用的，条件是该微生物将在温度胁迫的条件下培养。温度胁迫是这样一种状况，其中微生物遇到不同于最佳温度值的培养温度，该最佳温度值为适于相应的微生物生长或生产的温度值，所述的培养温度与该最佳温度值相差2'C或更高，相差5'C或更高，及至相差10。C或更高。对于啤酒糖酵母，32。C或32。C以上，35。C或35。C以上，40。C或40。C以上的温度可能是胁迫的。对于细菌大肠杆菌，38。C或38。C以上，或4rC或41。C以上，或46。C或46。C以上的温度可能是胁迫的。此外，在微生物中表达ME，或ME以及下列酶MIP,ALO，或LGDH中的一种或多种是特别有用的，条件是该微生物将在氧化胁迫的条件下培养。氧化胁迫是用于描述由活性氧类别(ROS)引起的细胞中氧化性损伤的稳态水平的通称。这种损伤会影响特定分子或整个生物体。活性氧类别，如自由基和过氧化物，表示一类分子，其来源于氧的代谢而且固有地存在于所有的需氧生物体中。氧化胁迫源于促氧化剂的形成与中和之间的不平衡。动物细胞，以及其它例子中，在标准培养条件期间可暴露于显著的氧化胁迫。因此，在动物细胞中表达ME,或ME和下列酶MIP，ALO或LGDH中的一种或多种看来是特别有用的。在微生物中表达ME,或ME以及下列酶MIP，ALO，或LGDH中的一种或多种也是特别有用的，条件是培养的微生物由于代谢产物或蛋白质的超量产生而受到胁迫。这种胁迫状况的标志可以是与本领域已知的UPR(解折叠蛋白应答)相关的基因的增量调节。编码ME，MIP或另一种酶的编码区可以从4壬何来源分离。在一个实施方案中，ME的编石马区分离自4以南芥(Jra6/do/7512、f力a7/a/7a)。在一个实施方案中，MIP的编码区分离自拟南芥。应当注意到，编码区"分离"自生物体，条件是它编码的蛋白质序列与从该生物体的细胞纯化的相同蛋白质的序列基本上相同。例如，在上述的特定实施方案中，ME编码区或MIP编码区不必分离自拟南芥的核酸或通过从拟南芥提取的核酸的一个或多个世代的复制来产生。优选地，编码所需酶的编码区以这样的方式掺入酵母中，该方式为所需的酶在酵母中产生并基本上是功能性的。这种酵母这里可被称为"功能性转化的"。区，它可以准备用于转化到酵母中，并在酵母中表达。至少，这涉及将编码区插入到载体中，并与存在于栽体上的且在酵母中是有活性的启动子可操作地连接。任何载体(整合型，染色体的或附加型)都可以使用。在靶宿主中有活性的任何启动子(同源的或异源的；组成型，诱导型，或阻抑型)都可以使用。这种插入可能涉及将限制性内切核酸酶用于在所需位点"打开"载体，其中与启动子可操作地连接是可能的，接着将编码区连接到所需位点中。如果需要，在插入到载体中之前，编码区可准备用于靶生物体。这可能涉及改变编码区中使用的密码子以更加充分地与靶生物体使用的密码子匹配；改变编码区中可能削弱该编码区的转录或翻译或该编码区的mRNA转录物的稳定性的序列；或添加或除去编码信号肽的部分(指导蛋白质到特定位置(例如，细胞器，细胞或细胞器的膜，或胞外分泌)的由编码区编码的蛋白质的区域)，以及本领域中已知的其它可能的制备。不考虑是否修饰编码区，当将编码区插入到载体中时，它与在酵母中有活性的启动子可操作地连接。启动子，如已知的，是能够指导附近的编码区转录的DM序列。如已经描述的，启动子可以是组成型的，诱导型的或阻抑型的。组成型启动子连续地指导附近的编码区转录。诱导型启动子可以通过添加合适的诱导性分子到培养基中被诱导，合适的诱导性分子可以根据启动子的特征来确定。阻抑型启动子可以通过添加合适的阻制性分子到培养基中被阻抑，合适的抑制性分子可以根据启动子的特征来确定。在一个实施方案中，启动子是组成型的。在更进一步的实施方案中，组成型启动子是啤酒糖酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子。含有与启动子可操作地连接的编码区的载体可以是质粒，粘粒，或酵母人工染色体，以及本领域已知的适用于酵母的其它载体。除了与启动子可操作地连接的编码区，载体还可以包含其它的遗传元件。例如，如果不期望载体整合到酵母基因组中，则该载体可以包含复制起点，其允许载体传递给含有该载体的酵母的子代细胞。如果需要载体整合到酵母基因组中，则该载体可包含与酵母基因组中发现的序列同源的序列，而且还可以包含可促进整合的编码区。为了确定哪些酵母细胞被转化，载体可包含选择标记或筛选标记，其赋予酵母区别于未转化酵母的表型，例如，它能在含有对未转化酵母致命的抗生素的培养基上存活，或它可将培养基的某种成分代谢成未转化酵母不能产生的产物，以及其它的表型。此外，载体可包含其它的遗传元件，如限制性核酸内切酶位点以及通常在载体中发现的其它元件。载体制备以后，其具有与启动子可操作地连接的编码区，可用该载体转化酵母(即，可以将该载体引入到酵母群体的至少一个细胞中)。用于酵母转化的技术沿用已久，包括电穿孔法，微粒轰击，以及LiAc/ssDNA/PEG法，等等。被转化的酵母细胞，然后可以使用载体上的筛选或选择标记进行检测。应当注意，短语"转化酵母"具有与如上面所定义的"重组酵母"基本相同的含义。转化酵母可以是在转化技术中接受载体的酵母，或可以是这种酵母的子代。已经获得重组酵母以后，可以在培养基中培养酵母。其中能够培养酵母的培养基可以是本领域已知的适于这种用途的任何培养基。培养技术和培养基是本领域公知的。在一个实施方案中，可以通过在合适的容器中的水性发酵进行培养。用于酵母发酵的典型的容器的例子包括摇瓶或生物反应器。培养基可以包含D-葡萄糖。它可以进一步地包含酵母生长所需的任何其它的成分。D-葡萄糖可能是酵母的生长所需要的成分但不一定是。培养基可以包含除D-葡萄糖以外的碳源，如蔗糖，果糖，乳糖，D-半乳糖，或植物性物质的水解产物，等等。在一个实施方案中，培养基还可以包含氮源如有机或无机分子。在另外的实施方案中，培养基还可以包含组分如氨基酸；嘌呤；嘧啶；玉米浆；酵母提取物；蛋白水解物；水溶性维生素如复合维生素B维生素；或无机盐如Ca，Mg，Na，K,Fe，Ni,Co，Cu，Mn，Mo或Zn的氯化物，盐酸盐，磷酸盐或硫酸盐，等等。还可以包含本领域普通技术人员已知的可用于酵母培养或发酵的其它的组分。培养基可以是緩冲的，但不是必需的。在发酵的过程中，D-葡萄糖可以被酵母内在化并通过许多步骤，转变成L-抗坏血酸。这样产生的L-抗坏血酸可以在酵母内部聚集，或可以由酵母分泌到培养基中。优选的培养基含有D-葡萄糖和YNB。在已经培养足够长的时间以在酵母，培养基或二者中产生所需浓度的L-抗坏血酸之后，可以分离L-抗坏血酸。如这里提到抗坏血酸时使用的"分离的"指的是通过L-抗坏血酸与酵母或培养基的至少一种非L-抗坏血酸成分的分离而使之处于更纯的状态。优选地，分离的L-抗坏血酸的純度为至少大约95%，更优选纯度为至少大约99%。为了从酵母中分离L-抗坏血酸，在酵母从培养基中分离之后，分离的第一个步骤可以是通过化学或酶促处理，用玻璃珠处理，超声处理，冷冻/融化循环，或其它已知的技术裂解酵母。可以通过合适的技术，如离心，过滤，微过滤，超滤，纳过滤，液-液提取法，结晶，用核酸酶或蛋白酶进行酶促处理或色谱法等等，从酵母裂解物的膜，蛋白质和核酸级分中纯化L-抗坏血酸。为了分离培养基中积累的L-抗坏血酸，分离可以包括从培养基中纯化抗坏血酸。可通过已知的技术，如利用离子交换树脂，活性碳，微过滤，超滤，纳过滤，液-液提取法，结晶或色谱法等等进行纯化。L-抗坏血酸可以从酵母和培养基中分离。如果在培养步骤期间酵母在培养基中积累L-抗坏血酸，优选使L-抗坏血酸的浓度稳定或允许其增加。提供以下定义以便帮助本领域技术人员理解本发明的详细描述术语"高于背景水平的抗坏血酸的积累"指的是抗坏血酸的积累高于如使用这里所述的方法确定的不可检测的水平。如这里使用的"抗坏血酸"以及"维生素C"指的是L-抗坏血酸。"抗坏血酸前体"是一种能由本发明的酵母直接或通过一个或多个中间产物转变成L-抗坏血酸的化合物。"扩增"指的是无论通过什么方式，增加所需核酸分子的拷贝数或提高酶的活性。"密码子"指的是确定特定氨基酸的三个核苷酸的序列。"DNA连接酶"指的是共价连接两段双链DNA的酶。"电穿孔法"指的是一种将外源DM引入到细胞中的方法，其采用短暂的，高压DC电荷来穿透宿主细胞，导致它们吸收染色体外的DNA。"核酸内切酶"指的是在内部位置水解双链DNA的酶。酶1.1.3.37，D-阿拉伯糖酸-l，4-内酯氧化酶，指的是催化D-阿拉伯糖酸-l，4-内酯+02转变成D-赤型抗坏血酸+&02的蛋白质。由于宽的底物范围，同样的酶能催化卜半乳糖酸-1，4-内酯+02转变成L-抗坏血酸+11202。该同样的酶错误地被称为L-半乳糖酸-l，4-内酯氧化酶(酶1.1.3.24)(参见Huh，W.K.等，1998，Mol.Microbiol.30，4，895-903)。酶1.3.2.3,L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶，指的是催化L-半乳糖酸-1，4-内酯+2高铁细胞色素C转变成L-抗坏血酸+2亚铁细胞色素C的蛋白质。酶1.1.3.8，L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶，指的是催化L-古洛糖酸-l，4-内酯氧化成L-木-己酮糖酸内酯的蛋白质，L-木-己酮糖酸内酯自发地异构化成L-抗坏血酸。酶GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶(5.1.3.18)，指的是催化GDP-甘露糖转变成GDP-L-半乳糖的蛋白质。酶肌醇磷酸酶(3.1.3.23)，指的是催化L-半乳糖-IP转变成L-半乳糖的蛋白质。其它值得关注的酶，和它们的分类号，如下己糖激酶葡萄糖-6-P异构酶甘露糖-6-P异构酶磷酸甘露糖变位酶甘露糖-l-P乌苷酰转移酶GDP-甘露糖3，5-差向异构酶L-半乳糖-脱氢酶L-半乳糖酸-l，4-内酯脱氢酶葡糖磷酸变位酶UTP-葡萄糖-l-P尿苷酰转移酶UDP-D-葡萄糖脱氢酶UDP-葡糖醛酸4-差向异构酶葡糖醛酸-l-P尿苦酰转移酶D-葡糖醛酸激酶D-葡糖醛酸还原酶醛糖内酯酶L-古洛糖酸-l，4-内酯氧化酶糖醛酸内酯酶葡糖醛酸内酯还原酶活性L-半乳糖酸-1,4-内酯3-差向异构i半乳糖醛酸酯-l-P尿苷酰转移酶半乳糖醛i2.7.1.15.3.1.95.3.1.85.4.2.82.7.7.225.1.3.183.1.3.23*)1.3.2.32.7.1.15.4.2.22.7.7.91.1.1.225.1.3.62.7.7.442.7.1.431.1.1.193.1.1.171.1.3.83.1.1.191.1.1.20*)*)2.7.1.44己糖醛酸(D-半乳糖醛酸)还原酶*)月几醇l-P合酶5.5.1.4肌醇l-P单磷酸酶3.1.3.25肌醇加氧酶1.13.99.1D-半乳糖激酶2.7.1.6UTP-己糖l-P尿苷酰转移酶2.7.7.10UDP-葡萄糖4-差向异构酶5.1.3.2Sue合酶2.4.1.13果糖激酶2.7.1.4*)分类号在数据库中没有得到。术语"表达，，指的是基因转录以产生对应的mRNA,并翻译该mRNA以产生对应的基因产物，即肽，多肽或蛋白质。短语"功能性连接"或"可操作地连接"指的是启动子或启动子区域和编码或结构序列以这样的方向和距离以便编码或结构序列的转录可以由该启动子或启动子区域来指导。术语"基因"指的是染色体DNA，质粒DM，cDNA，合成DM，或编码肽，多肽，蛋白质的其它DNA，或RM分子，以及表达调节中所涉及的编码序列旁侧的区域。术语"基因组"包括宿主细胞内的染色体和质粒。引入到宿主细胞中的本发明的编码DM因此可以是染色体整合的或质粒定位的。"异源DNA"指的是来自与受体细胞不同来源的DNA。"同源DNA"指的是来自与受体细胞相同来源的DM。"杂交"指的是核酸链与互补链通过碱基配对结合的能力。当这两条核酸链中的互补序列彼此结合时，发生杂交。术语"培养基，，指的是酵母的化学环境，其含有酵母或重组酵母生长所需的任何组分以及用于生产抗坏血酸的一种或多种前体。适于酵.的"可读框(0RF)"指的是编码肽，多肽或蛋白质的DNA或RM的区域。"质粒"指的是一段环状的，染色体外的，可复制的DM。"聚合酶链反应(PCR)"指的是产生一条核酸序列的多个拷贝的酶技术。通过在两个扩增引物之间穿梭移动DNA聚合酶来制备DNA序列的拷贝。这种扩增方法的基础是变性，然后再退火扩增引物，接着延伸以在位于侧翼扩增引物之间的区域中合成新的DM链的多个循环的温度改变。术语"启动子"或"启动子区域"指的是一种DM序列，其通常发现于编码序列上游(50，其通过提供用于RNA聚合酶的识别位点和/或在正确位点开始转录所必需的其它因子来调控信使RNA(mRNA)的产生，从而调控编码序列的表达。"重组细胞"或"转化细胞"是这样的细胞，其含有细胞中非天然存在的核酸序列或内源核酸序列的另外的单拷贝或多个拷贝，其中核酸序列通过人的行为被引入到细胞或其祖细胞中。术语"重组载体"或"重组DM或RM构建体"指的是任何元件如质粒，粘粒，病毒，自主复制序列，噬菌体，或线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列，其来源于任何来源，能整合到基因组中或自主复制，含有其中一个或多个序列已经以功能性操作方式连接的核酸分子。这种重组构建体或载体能以这样的方式将5'调节序列或启动子区域和用于选择的基因产物的DNA序列引入到细胞中，该方式为DNA序列被转录成功能性mRNA，其可以或不可以被翻译并因此表达。"限制酶"指的是能识别双链DM中的核苷酸的特定序列并切割两条链的酶；也被称为限制性核酸内切酶。切割一般发生于限制位点内或接近于限制位点。"选择标记"指的是这样的核酸序列，其表达赋予促进含有该核酸序列的细胞的鉴定的表型。选择标记包括那些赋予毒性化学药品(例如，氨千青霉素，卡那霉素)抗性或补充营养缺乏(例如，尿嘧啶，组氨酸，亮氨酸)。"筛选标记"指的是这样的核酸序列，其表达赋予视觉上有区别的特征(例如，颜色变化，荧光)。"转录"指的是从DNA模板产生RM拷贝的过程。"转化"指的是引入外源核酸序列(例如，载体，质粒，或重组核酸分子)到细胞中的过程，其中该外源核酸掺入到染色体中或能够自主复制。已经经历转化的细胞，或这种细胞的子代，是"转化的"或"重组的"。如果该外源核酸含有编码所需蛋白的编码区，而且该所需蛋白在转化的酵母冲生产并基本上是有功能的，那么这种转化的酵母是"功能性转化的"。"翻译"指的是从信使RNA产生蛋白质。术语"产率"指的是用产生的抗坏血酸的量(摩尔或重量/体积)除以消耗的前体的量(摩尔或重量/体积)，再乘以100。酶的"单位"指的是酶活性，其表示每分钟每mg总的细胞蛋白质所转变的底物的微摩尔数量。"载体"指的是携带核酸序列进入宿主细胞中的DNA或RNA分子(如质粒，粘粒，噬菌体，酵母人工染色体，或病毒，等等)。载体或它的一部分可以被插入到宿主细胞的基因组中。缩写表AscL-抗坏血酸(维生素C)AGDL-半乳糖酸-l，4-内酯脱氢酶(没有信号肽)ALOD-阿拉伯糖酸-l，4-内酯氧化酶ARAD-阿拉伯糖脱氢酶GalL-半乳糖酸-l，4-内酯GulL-古洛糖酸-l，4-内酯LGDHL-半乳糖脱氢酶ME甘露糖差向异构酶MIP肌醇磷酸酶RGLOL-古洛糖酸-l，4-内酯氧化酶TCA三氯乙酸TPI丙糖磷酸差向异构酶实施例下面的实施例旨在示范本发明的特定实施方案。本领域技术人员应当认识到，下列实施例中公开的技术代表发明人所发现的在实施本发明中充分发挥作用的技术，并因此可被认为构成用于实施本发明的优选方式。然而，本领域的技术人员，根据本公开内容，应当理解，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变，并仍然获得同样的或相似的结果而不背离本发明的精神和范围。材料和方法1.抗坏血酸的测定按照Sullivan等的方法(1955，Assoc.0ff，Agr.Chem.，38，2,514-518)用分光光度法测定抗坏血酸。将135jal样品与40jalH3P04(85%)在比色杯中混合。然后添加675jaloc，cT-联吡咬(0.5%)和135jLi1FeCl3(1%)。IO分钟以后测定525nm处的吸光度。在一些实验中，通过HPLC(TracerExtrasil柱C8，5yM，15x0.46cm，Teknokroma，S.Coop.C.Ltda.#TR-016077;洗脱液'溶于95/5&0/乙腈中的5mM十六烷基三曱基溴化铵，50mMKH2P04;流速1ml/分钟，在254nm处UV检测)，用纯的L-抗坏血酸(Aldrich，A9,290-2)作为标准品证实了抗坏血酸的身份。2.特定基因序列的扩增为了扩增特定基因序列，将PfuTurboDM聚合酶(Stratagene#600252)用于GeneAmpPCRSystem9700(PEAppl.Biosystems,Inc.)上。使用的标准条件为每100m1反应液400jaMdNTP,0.5|iM引物，0.5mMMgC12(除了緩沖液以外)，以及3.75UPfu。使用的基因的序列已经通过Genbank公开报道，如下，MIP除外。MIP序列如SEQIDN0:4所示，其不同于Genbank序列(登录号NM—111155)之处在于有两个翻译沉默位点置换bp271处，A(NM—111155)置换为T(SEQIDNO:4);685bp处，T(NM—11155)置换为G(SEQIDNO:4)。基因Genbank登录号SEGIDNO:<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>将下面的程序用于扩增ME:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>将下面的程序单用于扩增MIP:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>用于LGDH，ME与MIP的模板DNA:50ng质粒cDNA文库pFL61拟南芥(ATCC#77500(MinetM.等，1992，PlantJ.，2，417-422))。用于AL0的模板DNA:来自啤酒糖酵母GRF18U的50ng基因组DNA，是使用标准方法提取的。使用NovagenInc.的完全平端克隆试剂盒(#70191-4)，将PCR产物平端克隆到pSTBlue-1的EcoRV位点中。使用的寡核普酸SEQIDNO:8:tttcaccatatgtctactatccSEQIDNO:9:aaggatcctagtcggacaactc扩增的基因AL0(酵母)SEQIDNO:10:atgacgaaaatagagcttcgagcSEQIDNO:11:ttagttctgatggattccacttggLGDH(植物)SEQIDNO:12:gcgccatgggaactaccaatggaacaSEQIDNO:13:gcgctcgagtcactcttttccatcaME(植物)SEQIDNO:14:atccatggcggacaatgattctcSEQIDNO:15:aatcatgcccctgtaagccgcMIP(植物)3.质粒构建这里使用的命名规则是将pSTBlue-l，在就它的多克隆位点(MCS)而言有义方向上含有，例如，ALO，命名为pSTBAL0-1。在另一个例子中，将pSTBlue-1，在就它的MCS而言反义方向上含有ALO，命名为pSTBALO-2，等等。使用pYX系列(R&DSystems,Inc.)或着丝粒表达质粒pZ3和pZ4(P.Branduardi，M.Valli,L.Brambilla,M.Sauer，L.Alberghina和D.Porro.TheYeastzj^osacc力ao/z/ycesbailii:将aNewHostforHeterologousProteinProduction,SecretionandforMetabolicEngineeringApplications,FEBSYeastResearch,FEMSYeastRes.4，493-504,2004)克隆插入物。将标准程序用于所有的克隆过程(SambrookJ.等，MolecularGenetics:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress)。pSTBLGDH-1EcoRIpYX022pHHIS3(标记)pSTBALO-1EcoRIpYX024ALOLEU2(标记)pSTBME-1EcoRIpZ3pZ3MEKarf(标记)pSTBME-lEcoRIpZ4pZ4MEHphr(标记)pSTBMIP-1EcoRIpYX012pUMIPURA3(标记)为了进行下面的所有工作，将酵母对照菌株用对应的空载体转化。4.酵母培养与检验使用的酵母菌株是啤酒糖酵母GRF18U(Brambilla,L.等，1999，FEMSMicrob.Lett.171，133-140)，卑酒糖酵母GRFc(Brambilla等1999FEMSMicrob.Lett.171:133-140)，哞酒糖酵母BY4742O^fcr,力/s》/ew义/7^/wsJ，EuroScarf登录号Y10000),啤酒糖酵母YML007w(BY4742;M4ra/A/sJ;7eM,j1￥丄^7『.."/3#K，EuroScarf登录号Y10569)，或通过用不同的开发质粒转化而由它们4汙生。所有的菌林都在装有基本培养基(0.67%w/vYNB(DifcoLaboratories,Detroit,MI#919-15，2%w/v葡萄糖或甘露糖，并分别添加合适的氨基酸或腺嘌呤或尿嘧啶至50jag/L)和/或合适的抗生素(G418或潮霉素分别至500mg/l和400mg/1)的摇瓶中，在标准条件(30。C下振荡)下培养。对于抗坏血酸测定，660nni处的初始光密度为大约O.05，从氧化胁迫恢复的动力学为0.1。通过以4000rpm于4'C离心5分钟回收细胞，用冷蒸馏&0洗涤一次，并如下处理对于测定胞内抗坏血酸，将细胞重悬浮于为沉淀体积的大约3倍的冷10%TCA中，强力涡旋，在水上保持大约20，然后通过离心从细胞碎片中清除上清液。5.酵母转化酵母细胞的转化4安照LiAc/ss-DNA/PEG法(Gietz，R.D.和Schiestl，R.H.,1996，TransformingYeastwithDM,MethodsinMol.andCell.Biol.)进行。转化的酵母待保藏于ATCC，保藏号还没有指定。实验结果在C^7(^哞《这拟/^不li",Z/(^^学潘潜發母〃0编码拟/^f#凡举潘#餘母"G，拟扇不Z(7/^希拟^辜#/尸的基因被置于TPI启动子的调控下，每个基因都位于它自己的整合质粒上，除了ME，其被亚克隆到着丝粒质粒中。两个或多个基因被整合到啤酒糖酵母GRF18U和BY4742中。每个基因在单一座位上被整合。图1提供了目前对植物中从D-葡萄糖到L-抗坏血酸的生理学生物合成途径的理解的示意图。涉及下列酶A，L-半乳糖酸-l，4-内酯脱氢酶(1.3.2.3)，B，L-半乳糖脱氢酶，C,肌醇磷酸酶(3.1.3.23)，D，水解酶(假定的)，E，GDP-甘露糖-3，5-差向异构酶(5.1.3.18)，F,甘露糖-l-磷酸鸟苷酰转移酶(2.7.7.22),G，磷酸甘露糖变位酶(5.4.2.8),H，甘露糖-6-磷酸异构酶(5.3.1.8)，I，葡糖-6-磷酸异构酶(5.3.1.9)，J，己糖激酶(2.7.1.1)。在图l所示的途径中，AL0催化反应A,LGDH催化反应B，ME催化反应E,而MIP催化反应C。已知野生型酵母细胞能生产GDP-甘露糖(图1中的反应F-J)，并将它转运到内质网中。下表显示了通过啤酒糖酵母GRFc(对照)，或用(i)AL0和LDGH;(n)ALO，LDGH和ME;或(iii)ALO，LDGH，ME和MIP转化的哗酒糖酵母GRF18U,将D-葡萄糖和D-甘露糖转变成抗坏血酸。细胞从0D"。为0.05开始，在基本培养基(2%葡萄糖或甘露糖，0.67%YNB)上生长。生长24小时以后，测定抗坏血酸。虽然用ALO和LGDH转化的野生型GRFc和GRF18U这两种细胞都没有积累抗坏血酸，但是用ALO，LDGH和ME，或ALO，LDGH，ME和MIP转化的细胞分别出乎意料地积累了相当量(即高于背景水平)的抗坏血酸。使转化的酵母在基于葡萄糖或基于甘露糖的培养基上批量生长表达的基因含有葡萄糖的培养基上总的(抗坏血酸加赤型抗坏血酸)含有甘露糖的培养基上总的(抗坏血酸加赤型抗坏血酸)wt(对照)0.02050.0220ALO,LGDH(对照)0.02100.0221ALO，LGDH，ME0.03020.0332ALO,LGDH,ME，MIP0.04500.0296(总的(抗坏血酸加赤型抗坏血酸)值为生物质/L的mg/0D"°)对照菌抹中测定的值表明野生型酵母通常产生的赤型抗坏血酸产物。我们推断，酵母内源性地具有可非特异性催化从GDP-L-半乳糖到L-半乳糖的反应的活性(参见图1)。具体地说，虽然不想受理论束3缚，但是我们推断GDP-L-半乳糖自发地水解成L-半乳糖-l-P并且非特异性磷酸酶催化L-半乳糖-l-P转变成L-半乳糖，其然后由LGDH和ALO转变成L-抗坏血酸。MIP与假定的非特异性磷酸酶相比提供了更好的使L-半乳糖-l-P转变成L-半乳糖的催化作用(E《ZM《#5,#/尸对E《ZC/眠#i)。我们没有观察到在培养基中任何抗坏血酸积累。图2表明了YML007w酵母宿主对氧化胁迫特别敏感。Yaplp激活对氧化胁迫应答所需的基因；缺失该基因导致所观察到的表型(Rodrigues-PousadaCA，NevittT，MenezesR，AzevedoD，PereiraJ，AmaralC.Yeastactivatorproteinsandstressresponse:anoverview.FEBSLett.2004Jun1;567(1):80-85)。已经分析了下列酵母菌林BY4742(▲)YML007w(0)图2A.酵母菌抹从0D"。为Q.l开始，在基本培养基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生长。图2B.在存在0.8mM比02时，酵母菌抹从0D綱为0.1开始，在基本培养基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生长。图2C.在存在1.0mM11202时，酵母菌林从0D"。为0.1开始，在基本培养基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生长。在缺乏11202时这两个菌林均生长(图2A)，虽然YML007w酵母宿主的生长在含有0.8mM过氧化氢(图2B)的培养基中强烈延迟并在含有1mM过氧化氢(图2C)的培养基中完全削减。图3表明了YML007w酵母的生长敏感性可通过添加抗坏血酸到培养基中来拯救。已经分析了下列酵母菌林BY4742(▲)200680015039.4说明书第28/32页YML007W(0)图3A.在存在0.8niMH力2时，酵母菌林从OD"。为0.1开始，在基本培养基(2%葡萄糖，Q.67%YNB)上生长。以15mg/L的终浓度在T=0时添加抗坏血酸。图3B.在存在1.0mM&02时，酵母菌株从OD"。为0.1开始，在基本培养基(2%葡萄糖，Q.67%YNB)上生长。以15mg/L的终浓度在T=0时添加抗坏血酸。添加的抗坏血酸的作用是浓度依赖性的。实际上，抗坏血酸浓度增加到30mg/L，确定了对生长缺陷更快的拯救(数据未显示于图中)。图4表明了YML007w酵母宿主的生长缺陷可以由表达ALO,LDGH,ME和MIP的表达来杏i救。已经分析了下列酵母菌抹BY4742(▲)表达ALO，LDGH和ME的YML007w(口)表达ALO，LDGH，ME和MIP的YML007w(■)图4A.在存在0.8mM&02时，酵母菌林从OD"。为0.1开始，在基本培养基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生长。图4B.在存在1.0mMH202时，酵母菌林从0D"。为0.1开始，在基本培养基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生长。克隆的基因能与通过在培养基中添加抗坏血酸获得的类似地拯救生长敏感性(参见图3)。令人感兴趣的是注意到，与在没有MIP存在下的酵母细胞相比，存在MIP可以更快的恢复。作为胁迫的经典例子，我们用&02激发了野生型酵母细胞。正如所料，在缺乏&02时野生型细胞充分生长(图5A)，但是相同的酵母细胞在存在&02时不生长(图5B)。普遍认为外部胁迫物导致DNA损害，脂质损害，蛋白质损害，膜损害，以及其它的亚细胞结构，并最终导致细胞生活力和细胞完整性的丧失。因此，不令人惊讶的是，这种胁迫物的存在导致零产物，零生产率与零产物(在本案中，野生型酵母生物质)的产量，如图5B所示。通过用(i)LGDH，AL0和ME或(ii)LGDH，AL0，ME和MIP转化野生型GRF酵母，重组酵母产生了抗坏血酸，如上所述，而野生型酵母没有天然地产生抗坏血酸。令人惊讶地，基于这些重组酵母的生物加工显示出高产，高生产率，和高产物(酵母生物质)的产量(图5B)。生产，生产率和产量的值都大于0.00(对照菌林的值)。图5表明了野生型GRF酵母菌林对发酵的胁迫状态(由添加2mMH202诱导的胁迫状态)是敏感的；令人惊讶地，产生抗坏血酸的酵母菌林显示非常强健。已经分析了下列酵母菌林GRFc(闭合的三角形)；表达ALO,LDGH和ME的GRF18U(开放的正方形)；表达AL0，LDGH,ME和MIP的GRF18U(闭合的正方形)。图5A.酵母菌株从0D"。为0.l开始，在基本培养基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生长。图5B.在存在2.0mM&02时，酵母菌林从0D"。为0.1开始，在基本培养基(2%葡萄糖，0.67%YNB)上生长。野生型菌林没有消耗葡萄糖。用于该实验的所有菌林均具有相同的营养缺陷型互补和相同的抗生素抗性表达盒(其是不同的异源基因表达所必需的)，以便对于它们中所有的菌抹，表达3个或4个异源基因的菌林或野生型菌抹，使用相同的培养基都是可能的。该实验显示，两个重组GRF酵母菌林是比野生型GRP酵母更强健的菌林，因此可能更适于某些工业过程。虽然不想受理论束绰，但是我们认为也许通过由抗坏血酸直接清除活性氧类别(ROS)和由抗坏血酸干扰不需要的应激反应如凋亡，细胞死亡，生活力丧失和完整性丧失等等，重组酵母可能对各种各样的胁迫物不太敏感。虽然已经根据特定的实施方案描述了本发明的组合物和方法以及酵母菌林，但是可以进行改变而不背离本发明的构思，精神和范围，对于本领域技术人员来说是显而易见的。参考文献下列参考文献，某种程度上，它们为这里描述的那些提供了示例性的程序或其它的额外详述，特此引入这里作为参考。PadhH.1990，Cellularfunctionsofascorbicacid,Biochem.CellBiol，68，1166-1173.[2〗美国专利2,265,121Huh，W.K.，Lee，B,H.，Kim，S.T.，Kim，Y.R.，Rhie，G.E.，Baek，Y.W.，Hwang,C.S.,Lee，S.J.,Kang，S.0.，1998，D-Erythoascorbicacidisanimportantantioxidantmoleculein5:cere"'"'ae，Mol.Microb.30，4，895-903Wheeler,G.L.，Jones,M.A.，Smirnoff,N.，1998，TheMosyntheticpathwayofvitaminCinhigherplants,Nature393,365-368Huh，W丄，Kim，S.T.，Yang，K.S.，Seok，YJ.，Hah，Y.C.，Kang，S.0.，1994，CharacterisationofD-arabinono-l，4一lactoneoxidasefromCa/7￡/2.￡/aa/6/ca/2SATCC10231，Eur.J.Biochem.225，1073-1079Kim，S.T.，Huh，W.K.，Kim，J.Y.，Hwang,S.W.，Kang，S.0.，1996，D-ArabinosedehydrogenaseandbiosynthesisoferythoascorbicacidinCfl/2d2'c^a/6/ca叫BBA1297,1—8Kim，S.T.，Huh,W.K.,Lee，B.H.，Kang,S.0.，1998，D-Arabinosedehydrogenaseanditsgenefrom5^cc力aro/z7/cescere"^e，BBA1429，29-39Roland,J.F.，Cayle，T.，Di画odie，R.C.，Mehnert，D.W.，1986，FermentationProductionofAscorbicAcidfromL-GalactonicSubstrate,美国专利4,595,659Roland,J.F.，Cayle，T.，Di画odie，R.C.,Mehnert，D.W.，1990，BioconversionProductionofAscorbicAcidwithL一Galactono—l，4一0xidase，美国专利4,916，068Lee,B.H.，Huh，W.K.，Kim，S.T.，Lee，J.S.，Kang，S.0.，1999，BacterialProductionofD-ErythoascorbicAcidandL一ascorbicacidthroughFunctionalExpressionof5^cc力aro/z77cescereF/、2'aeD—Arabinono—l，4一LactoneOxidaseini^c/er/c力/aco//App.Env.Micr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