鉴定抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的方法

专利名称：：鉴定抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的方法鉴定抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的方法本申请要求2005年3月1日提交的美国临时专利申请60/657494的优先权。发明领域本发明涉及个人护理产品领域。更具体地，本发明涉及鉴定抗皮肤发明背景皮肤调理剂和皮肤着色剂是公知的，并且常用于皮肤护理产品。目前的皮肤调理剂和皮肤着色剂的主要问题是缺乏长期持续效果需要的耐久性。为了改进这些组合物的耐久性，开发了基于肽的皮肤调理剂、皮肤着色剂和其它有益试剂(Huang等人的共同未决和共同拥有的美国专利申请公开No.2005/0050656和美国专利申请公开No.2005/0226839)。基于肽的皮肤调理剂或着色剂是通过将与皮肤具有高亲和力的特定肽序列分别与调理剂或着色剂偶联而制备的。肽部分结合于皮肤，从而强烈附着于调理剂或着色剂。用噬菌体展示筛选技术鉴定了与皮肤具有高结合亲和力的肽(Huangetal.，supra;Estelletal.WO0179479;Murrayetal.,美国专利申请公开No.2002/0098524;Janssenetal.，美国专利申讳？>开No.2003/0152976;和Janssenetal.,WO04048399)。0179479、2002/0098524、2003/0152976和04048399申请描述了在沐浴露的稀溶液(即2%的水溶液)存在下使肽文库与皮肤样品接触，并且在噬菌体展示筛选过程中用沐浴露溶液洗涤得到的噬菌体-肽-皮肤复合物。但是，使用的沐浴露的浓度太低，以至于不能鉴定抗沐浴露的皮肤结合肽。在皮肤护理组合物基质存在下皮肤结合肽的结合亲和力降低，因此不能与组合物基质中的皮肤强结合，并且由于采用皮肤护理产品而从皮肤上洗掉。此外，在皮肤护理组合物基质中皮肤结合肽不能长时间稳定，这使得它们的结合亲和力在皮肤护理产品组合物中随时间降低。已经报道了鉴定抗洗发液的毛发结合肽的方法(Huang等人的共同未决和共同拥有的美国专利申请公开No.2005/0050656,和O'Brien等人的共同未决和共同拥有的美国专利申请No.11/251715)、结合秕糠状鳞斑霉的细胞表面蛋白的抗洗发液的抗体片段(Dolk等人的Appl.Environ.Microbiol.71:442-450(2005))和抗毛发调理剂的毛发结合肽(Wang等人的共同未决和共同拥有的美国专利申请No.60/657494)。但是，还没有描述过鉴定抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的方法。因此，要解决的问题是提供能够结合皮肤护理组合物基质中的皮肤并且在其中稳定的皮肤结合肽。决了上述问题。通过本发明的方法鉴定的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽序列可以用于制备基于肽的皮肤有益试剂，如皮肤调理剂和皮肤着色剂，在皮肤护理组合物基质存在下与皮肤具有高结合亲和力，并且在皮肤护理组合物中具有改进的稳定性。发明概述本发明提供了用于鉴定和分离皮肤结合肽的方法，所述肽的结合特性不受皮肤护理组合物存在的影响。本发明的抗皮趺护理组合物的皮肤结合肽从组合肽文库筛选，并且以二嵌段或三嵌段结构提供在皮肤护理组合物中，该结构任选包含间隔基和有益试剂，如着色剂和调理剂。包括a)提供DNA联合的肽(DNAassociatedpeptide)的组合文库；b)使(a)的文库与皮趺样品接触，其中皮肤与DNA联合的肽复合，形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液；c)从反应溶液分离(b)的DNA联合的肽-皮肤复合物；d)使(c)的分离的DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触，形成肽-皮肤复合物-组合物混合物，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%;e)从肽-皮肤复合物-组合物混合物分离(d)的DNA联合的肽-皮肤复合物；f)扩增编码(e)的DNA联合的肽-皮肤复合物中的肽部分的DNA;和g)对(f)的扩增的编码抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的DNA进行测序，其中鉴定出抗皮肤护理組合物的皮肤结合肽。任选可以在步骤(e)之后用洗脱剂从皮肤洗脱皮肤结合肽，并且可以通过连续采用该方法而进一步精制本发明的方法鉴定的肽。在另一实施方案中，本发明提供了通过包括以下步骤的方法鉴定的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽a)提供DNA联合的肽的组合文库；b)使(a)的文库与皮肤样品接触，其中皮肤与DNA联合的肽复合，形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液；c)从反应溶液分离(b)的DNA联合的肽-皮肤复合物；d)使(c)的分离的DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触，形成肽-皮肤复合物-组合物混合物，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%;e)从肽-皮肤复合物-组合物混合物分离(d)的DNA联合的肽-皮肤复合物；f)扩增编码(e)的DNA联合的肽-皮肤复合物中的肽部分的DNA;和g)对(f)的扩增的编码抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的DNA进行测序，其中鉴定出抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽。此外，本发明提供了二嵌段的、基于肽的皮肤有益试剂，其具有通式结构(SCPm)n-BA,其中a)SCP是抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；b)BA是有益试剂；c)m的范围是l-约100;并且d)n的范围是1-约50,000。类似地，本发明提供了三嵌段的、基于肽的皮肤有益试剂，其具有通式结构[(SCPX-S)m]n—BA，其中a)SCP是抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；b)BA是有益试剂；c)S是间隔基；d)x的范围是1-约10;e)m的范围是1-约100;并且f)n的范围是1-约50，000。在另一实施方案中，本发明提供了皮肤护理产品组合物，其中包含有效量的本发明的基于肽的皮肤调理剂。类似地，本发明提供了皮肤着色产品组合物，其中包含有效量的本发明的基于肽的皮肤着色剂。此外，本发明提供了皮肤清洁产品组合物，其中包含有效量的本发明的基于肽的皮肤调理剂。在一个替代实施方案中，本发明提供了形成皮肤上的基于肽的调理剂的保护层的方法，包括将本发明的组合物施用于皮肤，并且使得形成所述保护层。类似地，本发明提供了使皮肤着色的方法，包括将本发明的组合物施用于皮肤，持续足以导致皮肤着色的一段时间。在另一实施方案中，本发明提供了使皮肤着色的方法，包括以下步骤a)提供包含选自下组的皮肤着色剂的皮肤着色组合物!)(SCPm)n-C;和H)[(SCPx-S)m〗n_C其中1)SCP是抗皮肤护理組合物的皮肤结合肽；2)C是着色剂；3)n的范围是l-约50,000;4)S是间隔基；5)m的范围是1-约100;并且6)x的范围是l-约10;下步骤的方法选择的A)提供DNA联合的肽的组合文库；B)使(A)的文库与皮肤样品接触，其中皮肤与DNA联合的肽复合，形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液；C)从反应溶液分离(B)的DNA联合的肽-皮肤复合物；D)使(C)的分离的DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触，形成肽-皮肤复合物-组合物混合物，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%;E)从肽-皮肤复合物-组合物混合物分离(D)的DNA联合的肽-皮肤复合物；F)扩增编码(E)的DNA联合的肽-皮肤复合物中的肽部分的DNA;和G)对(F)的扩增的编码抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的DNA进行测序，其中鉴定出抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；和b)将(a)的皮肤着色组合物施用于皮肤，持续足以使皮肤着色剂结合于皮肤的一段时间。在一个额外的实施方案中，本发明提供了在皮肤上形成基于肽的调理剂的保护层的方法，包括以下步骤a)提供包含选自下组的皮肤调理剂的皮肤护理组合物i)(SCPm)n-SCA;和11)[(SCPX-S)m]n-SCA其中1)SCP是抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；2)SCA是皮肤调理剂；3)n的范围是1-约50,000;4)S是间隔基；5)m的范围是l-约100;并且6)x的范围是1-约10;并且其中抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽是通过包含以下步骤的方法选择的A)提供DNA联合的肽的组合文库；B)使(A)的文库与皮肤样品接触，其中皮肤与DNA联合的肽复合，形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液；C)从反应溶液分离(B)的DNA联合的肽-皮肤复合物；D)使(C)的分离的DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触，形成肽-皮肤复合物-组合物混合物，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%;E)从肽-皮肤复合物-组合物混合物分离(D)的DNA联合的肽-皮肤复合物；F)扩增编码(E)的DNA联合的肽-皮肤复合物中的肽部分的DNA;和G)对(F)的扩增的编码抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的DNA进行测序，其中鉴定出抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；和b)将(a)的皮肤护理组合物施用于皮肤，使得形成所述保护层。附图简述和序列描述通过以下的详细i兌明和所附的序列描述，可以更充分地理解本发明，其中序列描述也是本申请的一部分。以下的序列符合37C.F.R丄821-1.825("包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请所必备的条件-序列条款，，)，并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)，以及EPO和PCT(5.2条和49.5(a-bis)条，和使用说明208部分和附件C)的序列表要求。在核苷酸和氨基酸序列数据中所使用的符号和格式均符合37C.F.R.§1.822的规定。SEQIDNO:1是胱天蛋白酶3切割位点的氨基酸序列。SEQIDNO:2是用于对噬菌体DNA进行测序的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNO:3是实施例4和15描述的对照毛发结合肽的氨基酸序列。SEQIDNO:4是实施例4描述的荧光标记的毛发结合肽的M酸序列。SEQIDNOs:5-7是肽间隔基的氨基酸序列。SEQIDNOs:8-25是抗浴液的皮肤结合肽的氨基酸序列。SEQIDNO:26是在实施例15中用作对照的毛发结合肽的氨基酸序列。SEQIDNO:27是在C末端添加了半胱氨酸残基的抗浴液的皮肤结合肽(SEQIDNO:20)的氨基酸序列。发明详述性结合于人皮肤的皮肤结合肽的方法。这些皮肤结合肽可以用于制备基于肽的皮肤有益试剂，如皮肤调理剂和着色剂，在皮肤护理组合物基质存在下与皮肤具有高结合亲和力，并且在皮肤护理组合物中具有改进的稳定性。此处采用如下定义，其用于解释权利要求书和说明书。"SCP"表示抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽。"BA"表示皮肤有益试剂。"SCA"表示皮肤调理剂。"S"表示间隔基。"C，，表示着色剂。术语"肽"是指通过肽键或修饰的肽键彼此连接在一起的两个或多个氨基酸。如本文所使用的，术语"皮肤"是指人皮肤或人皮肤的替代物，如猪皮、Vitro-Skin⑧和EpiDermTM。术语"抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽"是指与皮肤护理组合物基质中的皮肤强结合并且在其中稳定的肽。术语"皮肤护理组合物基质"是指一种介质，其包含未稀释或稀释形式的皮肤护理产品，如皮肤调理剂、皮肤清洁剂、化妆品、抗皱产品和皮肤着色剂，或包含皮肤护理产品的至少一种成分的混合物以及皮肤护理产品的至少两种成分。皮肤护理产品的成分包括但不限于油、蜡、树胶、所谓的糊状脂肪状物质、皮肤调理剂、皮肤着色剂、抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、香料、增稠剂、润湿剂和阴离子、非离子或两性聚合物；以及染料或色素。术语"完全强度浓度"是指成分存在于皮肤护理产品中的浓度。术语"有益试剂，，是表示可以与抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽偶联，以施用于皮肤而提供美容或皮肤学效果的化合物或物质。有益试剂典型地包括调理剂、着色剂、香料、防晒剂等，以及通常用于个人护理工业的其它物质。如本文所使用的，术语"偶联"和"偶联的"指任意的化学締合，包括共价的和非共价的相互作用。术语"肽-皮肤复合物"表示一种结构，其包含通过肽上的结合位点与皮肤纤维结合的肽。术语"DNA联合的肽-皮肤复合物"是指皮肤和肽之间的复合物，其中所述肽联合了鉴定性核酸成分。典型地，DNA联合的肽作为展示系统的结果产生，所述展示系统如噬菌体展示。在该系统中，肽展示在噬菌体的表面，而编码该肽的DNA包含在噬菌体的附着的糖蛋白外壳内。编码DNA在p盆菌体内的联合可以用于促进编码区的扩增，从而鉴定肽。术语"非靶"表示一种底物，对于该底物，具有结合亲和力的肽不是理想的。为了选择抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽，所述非靶包括但不限于皮肤和塑料。术语"氨基酸"指蛋白或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用如下的缩写来代表特定的氨基酸氨基酸_三字母缩写_单字母缩写丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GinQ谷氨酸GluE甘氨酸GlyG组氨酸HisH异亮氨酸lieI亮氨酸LeuL赖氨酸LysK曱石克氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP丝氨酸SerS苏氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY缬氨酸ValV"基因"指表达特定蛋白的核酸片段，包括编码序列之前的调控序列(5'非编码序列)和之后的序列(3'非编码序列)，"天然基因"指在天然状态下发现的带有自身调控序列的基因。"嵌合基因"指非天然基因的任意基因，其包含在天然状态下不会同时发现的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可能包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含源自相同来源、但排列方式不同于天然状态的调控序列和编码序列。"外源"基因指在宿主生物体中通常不存在、而是通过基因转移引入到宿主生物体的基因。外源基因可以包含插入非天然生物体中的天然基因，或嵌合基因。使用本领域中技术人员已知的方法，可以将化学合成的寡核苷酸结构单元装配成"合成的基因"。连接这些结构单元并退火，形成基因片段，然后再酶促地装配它们，构建完整的基因。当涉及DNA序列时，"化学合成的"表示在体外装配组分核苷酸。DNA的人工化学合成，可以使用充分确立的技术来完成，或自动化学合成可以使用许多市售仪器之一来进行。因此，可以根据反映宿主细胞密码子偏倚的核苷酸序列最优化，对基因进行裁剪，进行最佳的基因表达。如果密码子选择偏向宿主偏爱的那些密码子，本领域技术人员能够意识到成功的基因表达的可能性。基于对源自可得到序列信息的宿主细胞的基因的分析，可以确定出优选的密码子。"编码序列"指编码特定氨基酸序列的DNA序列。"适当的调控序列"指位于编码序列上游(5'非编码序列)、其中或下游(3，非编码序列)的核普酸序列，其会影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎环结构。"启动子"指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般来说，编码序列位于启动子序列的3，。启动子可以整体地源自天然基因，或包含源自不同天然启动子的不同元件，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以指导基因表达，后者发生在不同组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或对不同环境或生理条件作出的反应。导致基因在大多数细胞类型中在大多数时间下表达的启动子，一般称为"组成型启动子"。进一步认识到，因为在大多数情况下不能完全确定调控序列的确切界限，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。如本文所使用的，术语"表达"指源自本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达还可以指mRNA翻译为多肽。术语"转化"指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，导致遗传上稳定的遗传特性。包含转化的核酸片段的宿主生物体也称作"转基因的"或"重组的"或"转化的"生物体。术语"宿主细胞"指已经或能被外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。术语"质粒"、"栽体"和"盒"指经常携带特定基因的染色体外元件，所述基因不是细胞中心代谢的一部分，并且通常是环状双链DNA分子形式。这样的元件可以是任意来源的单链或双链DNA或RNA的线状或环状自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经结合或组合在独特的构建体中，该构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当的3'非翻译序列引入细胞中。"转化盒"指一种特殊的载体，其包含外源基因，除外源基因外还具有促进特定宿主细胞的转化的元件。"表达盒"指一种特殊的载体，其包含外源基因，除外源基因外还具有增强该基因在外源宿主中的表达的元件。术语"噬菌体(phage或bacteriophage)，，指能感染细菌的病毒。变化形式的噬菌体也能用于本发明目的。优选的噬菌体源自叫做M13的"野生，，噬菌体。M13系统可以在细菌内生长，因此不会石皮坏它所感染的细胞，只是使它不断地制造新的噬菌体。它是单链DNA噬菌体。术语"噬菌体展示"指在噬菌体或噬菌粒颗粒表面上所进行的功能性外源肽或小蛋白的展示。可以使用基因工程化的噬菌体，将肽展示为它们的天然表面蛋白的片段。具有不同基因序列的噬菌体群可以产生肽文库。"PCR"或"聚合酶链式反应"是用于扩增特定DNA片段的技术(美国专利No.4,683,195和4,800,159)。Cloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)(下文称作"Maniatis");和Silhavy，T丄，Bennan，ML.和Enquist,L.W.，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryColdPressSpringHarbor,NY(1984);和Ausubel，F.M等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc,和Wiley-Interscience出版(1987)。本发明提供了鉴定在皮肤护理组合物基质存在下以高亲和力特异性结合于皮肤的抗皮肤护理组合物的肽序列的方法。该方法是标准生物淘选技术的改进，其中皮肤与组合产生的肽的文库接触。然后，得到的DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触一段时间。分离DNA联合的肽-皮肤复合物，与洗脱剂接触，得到洗脱的DNA联合的肽和保持与皮肤结合的DNA联合的肽。扩增和鉴定洗脱的DNA联合的肽和/或保留的结合的DNA联合的肽。可以用鉴定的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽序列构建基于肽的皮肤有益试剂，如皮肤调理剂和着色剂。抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的鉴定本文定义的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽(SCP)是特异性结合皮肤护理组合物基质中的皮肤并且在其中稳定的肽序列。本发明的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的长度是约7个氨基酸-约45个氨基酸，更优选约7个氨基酸-约25个氨基酸，最优选约12-约20个氨基酸。本发明的肽是随机产生的，然后按照下文所述，在皮肤护理组合物基质存在下，基于它们对皮肤的结合亲和力针对皮肤样品进行选择。随机的肽文库的产生是众所周知的，且可以通过许多技术来实现，包括，细菌展示(Kemp，D丄；Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(7):4520—4524(1981),和Helfman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80(1):31-35，(1983)),酵母展示(Chien等，ProcNatlAcadSciUSA88(21):9578-82(1991))，组合固相肽合成(美国专利No.5,449,754，美国专利No.5,480，971，美国专利No.5,585，275,美国专利No.5,639,603)，和噬菌体展示技术(美国专利No.5，223,409，美国专利No.5,403，484，美国专利No.5，571,698,美国专利No.5,837,500)。产生这样的生物肽文库的技术是本领域公知的。示例的方法记载在Dani,M.，J.ofReceptor&SignalTransductionRes.,21(4):447-468(2001)，Sidhuetal.,MethodsinEnzymology328:333-363(2000)，和PhageDisplayofPeptidesandProteins,ALaboratoryManual,BrianK.Kay，JillWinter,以及JohnMcCafferty，eds.;AcademicPress,.NY，1996。jt匕夕卜，可以从商业来源如NewEnglandBiolabs(Beverly,MA)购买嗟菌体展示文库。在一个实施方案中，特别有用的是以某种方式使编码肽的DNA与肽联合。该联合在筛选或生物淘选过程中促进结合肽的快速鉴定。编码DNA可以是PCR扩增的，或用于感染复制中的宿主，以增加用于快速鉴定的肽的表达。典型地通过噬菌体展示、细菌展示和酵母展示的方法生产DNA联合的肽。随机产生肽的一个优选的方法是利用噬菌体展示。噬菌体展示是一种体外选择技术，其中将肽或蛋白遗传地融合到噬菌体外壳蛋白上，从而在噬菌体病毒体的外部形成融合肽展示，而编码融合体的DNA停留在病毒体内。展示肽和其编码DNA之间的这种物理连接，允许通过称作"生物淘选"的简单体外选择过程，筛选大量肽变体，每个变体均与相应的DNA序列连接。生物淘选中最简单的形式是，将噬菌体-展示的变体库与目标靶一起温育，洗去未结合的噬菌体，并通过破坏噬菌体与輩巴之间的结合相互作用，洗脱特异性地结合的噬菌体。然后，体内扩增洗脱的噬菌体，重复该过程，得到逐步富集的有利于最紧密结合序列的噬菌体库。经过3轮或更多轮的选择/扩增，通过DNA测序对单个克隆进行表征。可以通过在皮肤组合物基质存在下，基于对皮肤的结合亲和力，针对皮肤样品选择噬菌体肽，从而用噬菌体展示法鉴定本发明的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽。皮肤和噬菌体肽可以以多种途径与皮肤护理组合物基质接触，形成肽-皮肤复合物-组合物混合物，如下文的详细描述。例如，可以将噬菌体肽文库溶解于皮肤组合物基质，然后与皮肤样品接触。或者，可以随后将通过使皮肤样品接触噬菌体展示文库而形成的噬菌体-肽-皮肤复合物与皮肤组合物基质接触。此外，可以使用这些皮肤组合物基质接触方法的任意组合。在已经生产出或者从供应商购买DNA联合的肽的合适文库后，使该文库与适量的皮肤样品相接触，形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液。人皮肤样品可以获自尸体或体外人皮肤培养物。此外，猪皮、Vitro-Skin，获自IMSInc.Milford，CT)和EpiDerm1M(获自MatTekCorp.,Ashland,MA)可以用作人皮肤替代物。将DNA联合的肽的文库溶解于合适的溶液，用于接触皮肤样品。在一个实施方案中，将肽的文库溶解于含有表面活性剂的緩沖盐水溶液中。合适的溶液是含有0.5%Tween20的Tris緩冲的盐水(TBS)。在另一实施方案中，将肽的文库溶解于皮肤护理组合物基质中(参见下文)，然后与皮肤样品接触。可以通过任何方法搅拌溶液，以便增加肽到皮肤表面的质量转移速度，从而缩短达到最大结合所需的时间。达到最大结合所需的时间依赖于一些因素而改变，例如皮肤样品的大小、肽文库的浓度和搅拌速度。本领域技术人员可以采用常规实验容易地确定需要的时间。典型地，接触时间是l分钟到l小时。任选地，可以使肽文库与非靶，如毛发或塑料接触，所述接触是在接触皮肤样品之前或同时，以除去结合于非靶的不需要的DNA联合的肽。接触皮肤样品后，许多随机产生的肽就结合于皮肤，形成DNA联合的肽-皮肤复合物。许多肽保持未复合状态，部分样品也未结合。可以任选用任何合适的緩沖液洗涤，从而除去未复合的肽，所述緩冲液如Tns-HC1、Tris緩冲的盐水、Tris-硼酸盐、Tris-乙酸、三乙胺、石辟酸緩冲液和甘氨酸-HC1，其中优选Tris緩沖的盐水溶液。洗涤溶液也可以含有表面活性剂，如SDS(十二烷基硫酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、NonidetP-40、TritonX-100、Tween20,其中优选浓度为0.5%的Tween20。洗涤步骤可以重复一次或多次。除去未复合的材料后，使DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触一段时间，典型地，接触约1分钟至约30分钟，以形成肽-皮肤复合物-组合物混合物。本文用到的皮肤护理组合物基质是是指一种介质，其包含未稀释或稀释形式的皮肤护理产品，如皮肤调理剂、皮肤清洁剂、化妆品、抗皱产品和皮肤着色剂，或包含皮肤护理产品的至少一种成分的混合物以及皮肤护理产品的至少两种成分。合适的皮肤护理产品组合物是本领域公知的。皮肤护理组合物由Philippe等人描述于美国专利No.6,280,747。例如，皮肤护理组合物可以是无水组合物，其含有比例通常是组合物总重量的约10-约90重量％的脂肪物质，其中脂肪相含有至少一种液体、固体或半固体脂肪物质。脂肪物质包括但不限于油、蜡、树胶和所谓的糊状脂肪物质。或者，这些组合物可以是稳定的分散系形式，如油包水或水包油乳剂。此外，组合物可以包含一种或多种常规的化妆品或皮肤病学添加剂或佐剂，包括但不限于皮肤调理剂(参见下文实施例)、皮肤着色剂(参见下文实施例)、抗氧化剂、防腐剂、填料、表面活性剂、UVA和/或UVB防晒剂、香料、增稠剂、润湿剂和阴离子、非离子或两性聚合物，以及染料或色素。可以4吏用来自诸:i口L，Oreal,Neutrogena,ProctorandGamble,Unilever,以及JohnsonandJohnson的公司的商购皮肤护理组合物。这些皮肤护理产品可以在地区超市和药店购买。优选地，本方法中采用这样的皮肤护理组合物基质，其中最终使用抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽。皮肤护理组合物可是不稀释使用，也可以稀释以促进其应用，特别是在非常粘稠的组合物的情况下。皮肤护理组合物可以用水或合适的緩沖液稀释，如可以使用上文描述的那些。皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%，优选至少约20%，更优选至少约50%,更优选至少约75%。最优选地，以未稀释形式使用皮肤护理组合物基质。任选地，可以使DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触一次或多次。在一种实施方案中，皮肤护理组合物基质包含皮肤调理产品。在另一种实施方案中，皮肤护理组合物基质包含皮肤清洁产品。从肽-皮肤复合物-组合物混合物分离DNA联合的肽-皮肤复合物，任选用上文描述的緩冲液洗涤一次或多次。也可以将皮肤护理组合物基质用作洗液。然后使DNA联合的肽-皮肤复合物与洗脱剂接触一段时间，典型是l-30分钟，以使DNA联合的肽从皮肤上解离；但是，一些DNA联合的肽在该处理之后可能仍然保持与皮肤结合。任选地，在接触洗脱剂之前，将DNA联合的肽-皮肤复合物转移到新容器中。洗脱剂可以是任何已知的洗脱剂，包括但不限于酸(pHl.5-3.0);碱(pH10-12.5);高盐浓度如MgCl2(3-5M)和LiCl(5-10M);水；乙二醇(25-50%);二喝烷(5-20%);疏氰酸盐(1-5M);胍(2-5M);和脲(2-8M),其中优选用酸处理。如果使用的洗脱緩冲液是酸或碱，那么，加入中和緩沖液，以便在洗脱步骤后将pH调节至中性范围。可以使用任何合适的緩冲液，其中采用酸性洗脱液时优选使用1MTris-HCIpH9.2。然后，用本领域已知的方法扩增编码洗脱的肽或保持结合的肽的DNA，或编码洗脱的肽和保持结合的肽这两者的DNA。例如，可以通过用编码需要的肽的DNA感染细菌宿主，如大肠杆菌ER2738,来扩增编码洗脱的肽和保持结合的肽的DNA，如Huang等人的描述(共同未决和共同拥有的美国专利申请公开No.2005/0050656，在此引入作为参考)。在合适的生长培养基(例如LB(Luria-Bertani)培养基)中培养感染的宿主细胞，然后将培养物涂布到琼脂上，琼脂包含合适的生长培养基，例如含有IPTG(异丙基(3-D-硫代吡喃半乳糖苷)和S-GalTM(3，4-环己烯基七叶亭-(3-D-吡喃半乳糖苷)的LB培养基。生长后，挑选噬斑进行DNA分离和测序，以鉴定抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽序列。或者，可以用核酸扩增方法，如聚合酶链式反应(PCR)扩增编码洗脱的肽和保持结合的肽的DNA。在该方法中，用合适的引等人在美国专利申请公开No.2003/0152976中的描述，在此引入作为参考。在一个实施方案中，通过感染细菌宿主细胞扩增编码洗脱的肽和保持结合的肽的DNA，使扩增的DNA联合的肽与新鲜的皮肤样品接触，将上述完整过程重复一次或多次，得到富含抗皮肤护理组合物的皮肤结合DNA联合的肽的群体。在需要数目的生物淘选周期后，用本领域公知的标准DNA序列技术确定扩增的DNA序列，以鉴定抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽序列。抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的生产可以使用本领域公知的标准的肽合成方法来制备本发明的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽(参见例如Stewart等，SolidPhasePeptideSynthesis,PierceChemicalCo.，Rockford，IL,1984;Bodanszky,PriniciplesofPeptideSynthesis,Springer-Verlag,NewYork,1984;和Pennington等，PeptideSynthesisProtocols,HumanaPress,Totowa,NJ，1994)。另外，许多公司能够提供提供常规肽合成服务。或者，可以使用重组DNA和分子克隆技术来制备本发明的肽。可以在异源宿主细胞(尤其是微生物宿主细胞)中生产编码皮肤结合肽的基因。用于表达本发明结合肽的优选异源宿主细胞是微生物宿主，其广泛地存在于真菌或细菌家族中，并能够在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长。因为转录、翻译和蛋白质生物合成装置均同样地与细胞原料供给无关，因此功能性基因的表达与用于生成细胞生物量的碳原料供给无关。宿主菌株的实例包括但不限于，真菌或酵母物种，如曲霉属(Aspergillus)、木霉菌属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)，或细菌物种，如沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、鱼腥蓝纟田菌属(Anabaena)、疏杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、和克雷伯氏菌属(Klebsiella)。可以使用多种表达系统来生产本发明的肽。这样的栽体包括但不限于，染色体型载体、附加型载体和病毒衍生型栽体，如源自细菌质粒、噬菌体、转座子、插入元件、酵母附加体和病毒(如杆状病毒、逆转录病毒)的栽体，以及上述栽体组合后得到的栽体，如源自质粒和噬菌体遗传元件，如粘粒和噬菌粒的栽体。表达系统构建体可以包含调控区，其调节和引起表达。通常，在这点上来说，任何适合在宿主细胞中维持、繁殖或表达多核苷酸或多肽的系统或载体都可以用于表达。微生物表达系统和表达载体包含调控序列，该调控序列能够指导外源蛋白相对于宿主细胞的生长进行高水平的表达。调控序列对于本领域技术人员来说是公知的，实例包括但不限于，在对化学或物理刺激的反应中造成基因表达开启或关闭的调控序列，包括存在于栽体中的调控元件，如增强子序列。可以使用它们中的任一种来构建嵌合基因，用于生产本发明的任意结合肽。然后，将这些嵌合基因通过转化引入到合适的微生物中，提供肽的高水平表达。用于转化适当宿主细胞的栽体或盒是本领域公知的。典型地，栽体或盒包含指导相关基因的转录和翻译的序列、一个或多个选择标记、和允许自主复制或染色体整合的序列。适合的载体包含携带转录起始控制区的基因的5，区域，和控制转录终止的DNA片段的3'区域。尽管本领域技术人员均清楚，这样的控制区没有必要源自选为生产宿主的特定物种的天然基因，但是最优选地，两个控制区都源自与转化的宿主细胞同源的基因。选择标记基因会为转化的宿主细胞的选择提供表型性状，如大肠杆菌中的四环素或氨节青霉素抗性。能够用于驱动嵌合基因在目标宿主细胞中的表达的起始控制区或启动子有多种，并为本领域技术人员所熟知。几乎任意能够驱动基因的启动子都适合用于生产本发明的结合肽，包括，但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GALIO、ADH1、PGK、PH05、GAPDH、ADC1TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中的表达)；AOX1(用于在毕赤氏酵母属中的表达)；和lac、ara、tet、trp、IPL、IPr、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中的表达)；以及用于在芽孢杆菌属中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。终止控制区也可以来自优选宿主的各种天然基因。任选地，没有必要必须包含终止位点，但是最优选地包含终止位点。可以使用包含上述合适的DNA序列以及合适的启动子或控制序列的载体，来转化合适的宿主，以使宿主表达本发明的肽。也可以使用源自本发明DNA构建体的RNA,使用无细胞翻译系统来生产这样的肽。任选地，可能需要以转化的宿主的分泌产物的形式来生产本发明的基因产物。将所需的蛋白分泌到培养基中，有利于简化纯化过程并降低成本。本领域熟知，分泌信号序列常被用于促进可表达的蛋白穿过细胞膜的主动运输。通过掺入编码在生产宿主中起作用的分泌信号的DNA序列，可以建立能分泌的转化的宿主。选择合适的信号序列的方法在本领域中是已知的(参见例如EP546049和WO9324631)。分泌信号DNA或促进子(facilitator)可以位于表达-控制DNA和本发明基因或基因片段之间，并且与后者处于相同的读码框中。基于肽的皮肤有益试剂通过将抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽(SCP)与有益试剂(BA)如调理剂、着色剂、香料、防晒剂等偶联，形成本发明的基于肽的皮肤有益试剂。基于肽的有益试剂的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽部分与皮肤护理组合物基质中的皮肤强结合，由此使有益试剂保持附着于皮肤，得到长期持续的效果。抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽与有益试剂之间的偶联相互作用可以是共价—建或非共价相互作用，并且可以是通过任选的间隔基，如下文的描述。也可能需要将多个抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽偶联于有益试剂，以便增强基于肽的有益试剂和皮肤之间的相互作用，如Huang等人(共同未决和共同拥有的美国专利申请公开No.2005/0050656)的描述。这可以通过将多个拷贝的单个抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽与有益试剂偶联，或通过直接或经间隔基将两个或多个抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽序列连接在一起，然后将得到的多拷贝皮肤结合肽序列与有益试剂偶联而实现。此外，可以将多个拷贝的多拷贝抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽序列与有益试剂偶联。在所有这些基于肽的皮肤有益试剂皮肤护理组合物的皮肤结合肽的组合。在本发明的一个实施方案中，基于肽的有益试剂是二嵌段组合物，其由抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽(SCP)和有益试剂(BA)组成，具有通式结构(SCPm)n-BA,其中m是l-约100，优选1-约10。当有益试剂是分子种类时，n的范围是1-约100，优选1-约10。当有益试剂是颗粒，如色素时，n的范围是l-约50,000,优选l-约10,000。在另一实施方案中，基于肽的有益试剂含有分隔抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽与有益试剂的间隔基(S)。可以将多个拷贝的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽与单个间隔分子偶联。或者，可以由多个间隔基分隔多个拷贝的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽。在该实施方案中，基于肽的有益试剂是三嵌段组合物，其由抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽、间隔基和有益试剂组成，具有通式结构[(SCPx-S)m]n-BA，其中x的范围是1-约10,优选x是1,并且m是1-约100,优选1-约10。当有益试剂是分子种类，如染料或非颗粒调理剂时，n的范围是l-约100,优选l-约10。当有益试剂是颗粒，如色素时，n的范围是l-约50,000，优选1-约10,000。应该理解，本文使用的SCP是通用命名，不意味着它表示单个抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽序列。当上文使用的m、n或x大于l时，提供以下状况是在本发明的范围内即一系列不同序列的皮肤结合肽可以形成组合物的一部分。此外，S是通用命名，不意味着它表示单个间隔基。当上文用于三嵌段组合物的m或n大于1时，提供以下状况是在本发明的范围内即一系列不同序列的间隔基可以形成组合物的一部分。应该理解，这些结构不一定代表肽、有益试剂和任选间隔基之间的共价键。如下文所述，肽、有益试剂和任选间隔基之间的偶联相互作用可以是共价的或非共价的。下文针对皮肤调理剂和皮肤着色剂描述了本发明的基于抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的有益试剂的制备。应该理解，这些方法可以用于其它有益试剂，并且这些其它的基于抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的有益试剂属于本发明的范围内。基于肽的皮肤调理剂结合肽(SCP)与皮肤调理剂(SCA)偶联而形成的。调理剂的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽部分与皮肤护理组合物基质中的皮肤强结合，由此使调理剂附着于皮肤，得到长期持续的调理效果。抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽是通过上文描述的方法选择的。本文中的皮肤调理剂包括但不限于，使皮肤收紧的收敛剂；去除死皮细胞的表皮脱落剂；有助于保持光滑、柔软、柔韧外观的润滑剂；增加皮肤上层水含量的保湿剂；延迟水分从皮肤表面蒸发的闭塞剂；健康促进剂，以及改进千燥或受损皮肤的外观或减少脱落和恢复补充的多种化合物。在本发明的基于肽的皮肤调理剂中，可以使用任何合适的已知皮肤调理剂。皮肤调理剂在本领域是公知的，参见例如本申请引作参考的文献Green等(WO0107009),并且可以通过各种途径购买到。合适的皮肤调理剂的例子包括，但不限于cc-羟酸、p-羟酸、多元醇、透明质酸、D,L-泛醇、聚水杨酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素E乙酸酯、甘油、山梨糖醇、硅酮、硅酮衍生物、羊毛脂、天然油、甘油三酯、y氨基丁酸、激素，如人生长激素；和胰岛素样生长因子-1。本发明的优选的皮肤调理剂是聚水杨酸酯、丙二醇(CASNo.57-55-6,DowChemical,Midland,MI)、甘油(CASNo.56-81-5,Proctor&GambleCo.,Cincinnati,OH)、乙醇酸(CASNo.79-14-1，DuPontCo.,Wilmington,DE)、乳酸(CASNo.50-21-5,AlfaAesar,WardHill，MA)、苹果酸(CASNo.617-48-1,AlfaAesar)、柠檬酸(CASNo.77-92-9，AlfaAesar)、酒石酸(CASNO.133-37-9,AlfaAesar)、葡糖二酸(CASNo.87-73-0)、半乳糖二酸(CASNo.526-99-8)、3-羟基戊酸(CASNo.10237-77-1)、水杨酸(CASNo.69-72-7,AlfaAesar)和1,3丙二醇(CASNo.504-63-2，DuPontCo"Wilmington,DE)。可以通过White等人在美国专利No.4,855,483中描述的方法制备聚水杨酸酯，在此引入作为参考。可以用Merbouh等人描述的方法合成葡糖二酸(C"Ao/^A336:75-78(2001)。可以按照Bramucci在WO02/012530中描述的方法制备3-鞋基戊酸'选的间隔基偶联到皮肤调理剂上，可以制备本发明基于肽的皮肤调理剂。偶联相互作用可以是共价键或非共价相互作用，例如氢键，静电相互作用，疏水相互作用，或范德华相互作用。在非共价相互作用的情况下，可以通过混合肽和调理剂以及任选的间隔基(如果使用)，并允许足以发生相互作用的时间，制备基于肽的皮肤调理剂。使用本领域已知的方法，例如，凝胶渗透色谱，可以从得到的基于肽的皮肤调理剂加合物分离未结合的物质。通过间隔基共价地结合到皮肤调理剂上，制备本发明的基于肽的皮肤调理剂，如Huang等人的描述(共同未决和共同拥有的美国专利申请公开No.2005/0050656)。可以使用任意已知的肽或蛋白缀合化学，制备本发明的基于肽的皮肤调理剂。缀合化学在本领域是已知的(参见例如Hermanson，BioconjugateTechniques,AcademicPress，NewYork(1996))。合适的偶联剂包括但不限于，碳二亚胺偶联剂、酸氯化物、异氰酸酯、环氧化物、马来酰亚胺和其它功能性偶联剂，其中功能性偶联剂与肽的末端胺和/或羧酸基团以及肽上的巯基反应。另外，可能需要保护对肽上的反应性胺或羧酸基团，以产生基于肽的调理剂的预期结构。本领域公知氨基酸的保护基团、如叔丁氧羰基(t-Boc)的应用(参见例如上述Stewart等的文献；上述Bodanszky的文献；和上述Pennington等的文献)。在某些情况下，可能需要在皮肤调理剂上引入反应基团，如羧酸、醇、胺、异氰酸酯或醛基，以偶联皮肤结合肽。可以使用本领域公知的常规化学方法，如氧化、还原等，完成这些修饰。也可能希望使抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽通过间隔基与皮肤调理剂相偶联。间隔基将肽和调理剂分隔开，以确保调理剂不干扰肽对皮肤的结合。间隔基可以是任意类型的分子，如烷基链、苯基化合物、乙二醇、酰胺、酯等。优选的间隔基是亲水性的，链长从1至约100个原子，更优选地，链长从2至约30个原子。优选的间隔基的实例包括但不限于，乙醇胺、乙二醇、链长为6个碳原子的聚乙烯、具有3-6个重复单元的聚乙二醇、苯氧乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基链、和乙基烷基链、丙基烷基链、己基烷基链、甾醇基(steryl)烷基链、十六烷基烷基链和棕榈酰基烷基链。可以使用任意上述的偶联化学，使间隔基共价结合到肽和皮肤调理剂上。为了促进间隔基的掺入，可以使用双功能交联剂，其包含间隔基和处于两末端的反应基团，以偶联肽和调理剂。合适的双功能交联剂在本领域中是公知的，包括但不限于二胺，如1，6-二氨基己烷；二醛，如戊二醛；双N-羟基琥珀酰亚胺酯，如乙二醇-双(琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、双琥珀酰亚胺基戊二酸酯、双琥珀酰亚胺基辛二酸酯、和乙二醇-双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)；二异氰酸酯，如1，6-己二异氰酸酯；双环氧乙烷，如1，4亚丁基二环氧甘油醚；二羧酸，如琥珀酰双水杨酸酯等。也可以使用异双功能交联剂，其在每个末端含有一个不同的反应基团。异双功能交联剂的实例包括但不限于，具有如下结构的化合物其中R,是H或是取代基，如-SOsNa、-N02、或-Br;R2是间P鬲基，如-CH2CH2(乙基)、-(CH2)3(丙基)或-(CH2)3C6H5(丙基苯基)。这样的异双功能交联剂的实例是3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。这些试剂的N-羟基琥珀酰亚胺酯基团与调理剂上的胺或醇基反应，而马来酰亚胺基团与肽上的巯基反应。通过在结合肽序列的至少一个末端(即，C-末端或N-末端)添加至少一个半胱氨酸基团，可以将巯基掺入肽中。可以在结合肽序列和末端半胱氨酸之间掺入几种间隔氨基酸残基，如甘氨酸，以将反应性巯基与结合序列分隔开。此外，可以将至少一个赖氨酸残基加至结合肽的至少一个末端，即C-末端或N-末端，以提供用于偶联的胺基团。另外，间隔基可以是包含任意氨基酸及其混合物的肽。优选的肽间隔基包含脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸及其混合物。另外，肽间隔基可以包含特异性酶切割位点，如蛋白酶半胱天冬酶3位点(SEQIDNO:l所示)，其用于酶促地从皮肤上去除调理剂。肽间隔基的长度可以是从1至约50个氨基酸，优选从l至约20个氨基酸。肽间隔基的实例包括但不限于SEQIDN0s:5-7。可以通过本领域已知的任何方法，将这些肽间隔基连接到结合肽序列上。例如，可以使用前面所述的标准的肽合成技术，制备完整的结合肽-肽间隔基二嵌段物。另外，还可以4吏用石友二亚胺偶联剂(参见例如Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress,NewYork(1996))、二价氯化物、二异氰酸酯和能与肽上的末端胺和/或羧酸基团反应的其它双功能偶联剂，连接结合肽序列和肽间隔基。或者，可以使用前面所描述的重组DNA和分子克隆技术，制备完整的结合肽-肽间隔基二嵌段物。间隔基也可以是肽间隔基和有机间隔基分子的组合，其可以通过上述方法制备。偶联，以增强基于肽的皮肤调理剂和皮肤之间的相互作用。可以使用多个拷贝的相同皮肤结合肽，或不同皮肤结合肽的组合。在大调理颗粒(如颗粒乳液)的情况下，可以在调理剂上偶联大量的皮肤结合肽，即至多约5,000个。可以将小量皮肤结合肽偶联到较小的调理剂分子上，即至多约100个。此外，多个拷贝的肽可以连接在一起，并且附着于调理剂。因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的皮肤调理剂是二嵌段组合物，其由抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽(SCP)和皮肤调理剂(SCA)组成，通式结构为(SCPm、-SCA，其中m的范围为1-约100,优选1-约10。当皮肤调理剂是分子种类，即非颗粒调理剂时，n的范围是l-约100，优选1-约10。当皮肤调理剂是颗粒时，n的范围是l-约50,000,优选1-约10,000。在另一实施方案中，基于肽的皮肤调理剂含有上文所述的将抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽与皮肤调理剂分开的间隔基(S)。可以将多个拷贝的皮肤结合肽与单个间隔基偶联。此外，可以通过间隔基将多个拷贝的肽连接在一起，并且通过间隔基与皮肤调理剂偶联。在该实施方案中，基于肽的皮肤调理剂是三嵌段组合物，其由抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽、间隔基和皮肤调理剂组成，具有通式结构[(SCPx-S)m]n-SCA，其中x的范围是1-约10，x优选是l，m的范围是l-约IOO,优选1-约10。当皮肤调理剂是分子种类，即非颗粒调理剂时，n的范围是l-约100,优选l-约10。当皮肤调理剂是颗粒时，n的范围是l-约50，000，优选1一约IO，OOO。应该理解，本文使用的SCP是通用命名，不意味着它表示单个抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽序列。当上文使用的m、n或x大于l时，提供以下状况是在本发明的范围内即一系列不同序列的皮肤结合肽可以形成组合物的一部分。此外，S是通用命名，不意味着它表示单个间隔基。当上文用于三嵌段组合物的m或n大于1时，提供以下状况是在本发明的范围内即一系列不同序列的间隔基可以形成组合物的一部分。应该理解，这些结构不一定代表肽、有益试剂和任选间隔基之间的共价键。如下文所述，肽、有益试剂和任选间隔基之间的偶联相互作用可以是共价的或非共价的。可以将本发明的基于肽的皮肤调理剂用于皮肤护理的产品中。还应当认识到，皮肤结合肽本身也能作为调理剂来处理皮肤。皮肤护理产品组合物包括但不限于皮肤调理剂、皮肤清洁剂、化妆品、抗皱产品和皮肤着色剂。在一种实施方案中，皮肤护理产品组合物是皮肤着色产品。另一种实施方案中，皮肤护理产品组合物是皮肤清洁产品。本发明的皮肤护理产品组合物包含美容上可接受的介质中的有效量的基于肽的皮肤调理剂或不同基于肽的皮肤调理剂的混合物。在本文量定义为相对于组合物的总重量，按重量计约0.01%至约10%、优选约0.01%至约5%的比例。该比例可以作为皮肤护理产品类型的函数而改变。用于皮肤护理产品的美容上可接受的介质的成分是公知的，并且在上文描迷。基于肽的皮肤着色剂通过将抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽(SCP)与着色剂(C)相偶联，形成本发明的基于肽的皮肤着色剂。基于肽的皮肤着色剂的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽部分可以与皮肤强结合，并且不被皮肤调理剂的施用除去，从而能够使着色剂在皮肤上保持，产生长期持续的皮肤着色效果。抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽是通过上文描述的方法鉴定的。本发明的基于肽的皮肤着色剂是采用上文描述的偶联方法，直接或而制备的r在本文中定义的着色剂是，能够用于改变皮力夫的颜色的任何染料和色素等。在本发明的基于肽的皮肤着色剂中，可以使用任何合适的着色剂。着色剂在本领域是公知的(参见例如上述Green等的文献，CFTAInternationalColorHandbook,2nded.，MicellePress,England(1992)和CosmeticHandbook,USFoodandDrugAdministration,FDA/IASBooklet(1992)),并且可以通过各种途径购买到(例如Bayer，Pittsburgh,PA;Ciba-Geigy，Tarrytown，NY;ICI，Bridgewater，NJ;Sandoz，Vienna,奥地利；BASF,MountOlive,NJ;和Hoechst，Frankfurt,德国)。用于本发明的基于肽的皮肤着色剂的优选着色剂包括以下染料伊红衍生物如D&CRedNo.21和卣化荧光素衍生物如D&CRedNo.27、与D&CRedNo.21和D&COmngeNo.lO组合的D&CRedOrangeNo.5;和色素二氧化钬、氧化锌、D&CRedNo.36和D&COrangeNo.l7、D&CRedNo.7、11、31和34的4丐色淀、D&CRedNo.12的钡色淀、D&CRedNo.13的锶色淀、FD&CYellowNo.5、FD&CYellowNo.6、D&CRedNo.27、D&CRedNo.21和FD&CBlueNo.1的铝色淀、氧化铁、锰紫(manganeseviolet)、氧化铬、群青蓝和炭黑。着色剂也可以是无须日光的增黑剂，如二羟基丙酮，它使得皮肤展示晒黑的外^见，而无须暴露于日光。另外，可以将附着、吸附或吸收了染料的有机和无机納米颗粒用作着色剂。例如，着色剂可以是有色的聚合物纳米颗粒。示例性的聚合物微球包括但不限于，包含聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯基甲苯、笨乙晞/丁二烯共聚物和胶乳的微球。为了用于本发明，微球具有约10纳米至约2微米的直径。通过将任意的合适的染料(例如上述的那些)偶联到微球上，可以使微球着色。可以将染料偶联到微球的表面上，或吸附到多孔微球的孔结构内。可以从BangLaboratories(Fishers,IN)等公司得到合适的微球，包括未染色和染色微球，其被官能化，以实现共价结合。还可能需要将多个抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽与着色剂偶联，以增强基于肽的皮肤着色剂和皮肤之间的相互作用。可以使用多个拷贝的相同皮肤结合肽，或不同皮肤结合肽的组合。此外，可以将多个皮肤结合肽序列连接在一起，并且与上文所述的着色剂偶联。在大色素颗粒的情况下，可以在色素上偶联大量的皮肤结合肽，即至多约5,000个。可以将小量皮肤结合肽偶联到较小的染料分子上，即至多约100个。因此，在本发明的一个实施方案中，基于肽的皮肤着色剂是二嵌段组合物，其由抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽(SCP)和着色剂(c)组成，通式结构为(SCPnOn-C，其中m的范围为1-约100，优选1-约10。当着色剂是分子种类，如染料时，n的范围是l-约100,优选l-约10。当着色剂是颗粒，如色素或纳米颗粒时，n的范围是1-约50,000,优选-约0，000。在另一实施方案中，基于肽的皮肤着色剂含有上文所述的将结合肽与皮肤着色剂分开的间隔基(S)。可以将多个拷贝的皮肤结合肽与单个间隔基偶联。此外，可以通过间隔基将多个拷贝的肽连接在一起，并且通过间隔基与着色剂偶联。在该实施方案中，基于肽的皮肤着色剂是三嵌段组合物，其由抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽、间隔基和着色剂组成，具有通式结构[(SCPfS)m]n-C，其中X的范围是1-约10,X优选是1，m的范围是l-约IOO,优选1-约10。当着色剂是分子种类如染料时，n的范围是l-约100,优选l-约10。当着色剂是颗粒，如色素或纳米颗粒时，n的范围是1-约50,000，优选l-约10,000。应该理解，本文使用的SCP是通用命名，不意味着它表示单个抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽序列。当上文使用的m、n或x大于l时，提供以下状况是在本发明的范围内即一系列不同序列的皮肤结合肽可以形成组合物的一部分。此外，S是通用命名，不意味着它表示单个间隔基。当上文用于三嵌段组合物的m或n大于1时，提供以下状况是在本发明的范围内即一系列不同序列的间隔基可以形成组合物的一部分。应该理解，这些结构不一定代表肽、有益试剂和任选间隔基之间的共价键。如下文所述，肽、有益试剂和任选间隔基之间的偶联相互作用可以是共价的或非共价的。可以将本发明的基于肽的皮肤着色剂用作美容和化妆产品中的着色剂，包括但不限于粉底、腮红、唇膏、唇线、唇油、眼影和眼线。这些可以是无水化妆产品，包含美容上可接受的含有脂肪物质的介质，或它们可以是稳定的分散系形式，如上文所述的油包水或水包油乳剂。在这些组合物中，基于肽的皮肤着色剂的比例通常是按重量计占组合物总重量的约0.001%至约40%。处理皮肤的方法在另一个实施方案中，提供了用本发明的基于肽的调理剂和着色剂处理皮肤的方法。更具体地，本发明还包含如下在皮肤上形成基于肽的调理剂的保护膜的方法将上述包含有效量的基于肽的皮肤调理剂的组合物施用到皮肤上，使之形成保护膜。可以通过各种方法，包括但不限于，喷雾、刷涂和用手涂抹，将本发明的组合物施用到皮肤上。使基于肽的调理剂组合物与皮肤接触足以形成保护膜的时间，优选至少约0.1到60分钟。本发明还提供了如下使皮肤着色的方法通过上述的方法，将包含有效量基于肽的皮肤着色剂的皮肤着色组合物施用到皮肤上。在下面的实施例中对本发明作进一步的详细i兌明。应当理解，这些实施例是本发明优选的实施方案，仅用作实例。根据上述描述和这些实施例，本领域技术人员能够确定本发明的基本特征，在不脱离本发明精神和范围内，能够对本发明作出各种改变和修改，以满足各种应用和需要。使用的缩写的含义如下"min，，表示分钟，"sec"表示秒，"h，，表示小时，")aL"表示微升，"mL"表示毫升,"L"表示升，"nm"表示納米，"mm"表示毫米，"cm"表示厘米，"fim"表示微米，"mM"表示毫摩尔浓度，"M"表示摩尔浓度，"mmol"表示毫摩尔，"pmole"表示微摩尔，"g"表示克，>g，，表示微克，"mg"表示毫克，"pfu"表示噬斑形成单位，"BSA，，表示牛血清白蛋白，"ELISA，，表示酶联免疫吸附测定法，"A"表示吸光度，"A45q，，表示在450nm波长测得的吸光度，"TBS"表示Tris-緩冲盐水，"TBST-X"表示包含Tween20的Tris緩冲盐水，其中"X"是Tween20的重量百分比，"SEM"表示平均值的标准误，"THF，，表示四氢呋喃，"DMF，，表示二甲基甲酰胺，"Mv，，表示重均分子量，"kDa，，表示千道尔顿，"NMR，，表示核磁共振分光检定法，"v/v，，表示体积-体积比。一般方法标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域中公知的，且记载在，Sambrook，J.,Fritsh，E.F.和Maniatis,T.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY1989;T.J.Silhavy，M丄.Bennan,和L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1984;和Ausubel,F.M.等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,实施例GreenePublishingAssoc.和Wiley-Interscience,N.Y.，1987。适用于细菌培养物的维持和生长的材料和方法也是本领域中公知的。适用于下面实施例的技术参见ManualofMethodsforGeneralBacteriology,PhillippGerhardt，R.G.E.Murray,RalphN.Costilow，EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.Kriey和G.BriggsPhillips,eds.,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.，1994，或者ThomasD.Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,SecondEdition,Si画erAssociates,Inc.,Sunderland,MA，1989。除非另有说明，实施例中描述的所有的试剂和用于生长和维持细菌细胞的材料均购自AldrichChemicals(Milwaukee,Wl)、BDDiagnosticSystems(Sparks,MD)、LifeTechnologies(Rockville,MD)、或SigmaChemicalCompany(St丄ouis,MO)。噬菌体展示肽文库以下实施例使用3种噬菌体展示肽文库。Ph.D.-12TM噬菌体展示肽文库购自NewEnglandBioLabs(Beverly,MA)。该试剂盒是基于随机肽12聚体的组合文库，所述随机肽融合到噬菌体M13的一个较小的外壳蛋白(pIII)上。所展示的肽在pill的N-末端表达，因此在切除信号肽后，外壳蛋白的首位残基即是所展示的肽的第一位残基。Ph.D.-12文库分别由大约2.7x109个序列组成。用Kay等人描述的方法(CombinatorialChemistry&HighThroughputScreening,Vol.8:545-551(2005))制备3个噬菌体展示肽文库，其中一个含有15聚体随机肽序列，另一个含有20聚体随机肽序列，第三个含有14聚体二疏化物限制的随机肽序列，其在第3和11位具有半胱氨酸残基。该方法是Sidhu等人报道的方法(MethodsinEnzymology328:333-363(2000))的改进，其中用大肠杆菌CJ236抹(dut—ung一)制备含有尿苷的单链噬菌粒DNA(U-ssDNA)。这种DNA用作采用寡核苷酸合成第二链的模板，不仅作为第二链的引物，也用于插入编码随机氨基酸的序列。在完成第二链合成后，双链DNA(dsDNA)即转化到野生型菌抹中。由宿主细胞降解任何U-ssDNA,由此仅仅留下重組链来产生噬菌体颗粒。这种方法可以用于制备M13外被蛋白的肽融合体或突变体。Kay等人的方法在基因III的起始处采用琥珀终止密码子。将含有随机化的DNA序列片段的寡核苷酸与单链噬菌体基因组退火，使得随机化的区域与终止密码子联合。将单链DNA(ssDNA)酶促转化为共价封闭的、环状dsDNA，随后电穿孔到大肠杆菌的非阻抑菌抹中。新合成的DNA链(负链)作为制备宿主细胞中的正链的模板，该正链用于转录/翻译病毒基因，并且包装到病毒颗粒中。实施例1-3(预示性)抗皮肤调理剂的皮肤结合肽的鉴别这些实施例的目的是描述如何从三个随机噬菌体展示肽文库鉴别抗皮肤调理剂的皮肤结合肽的方法，这三个随机噬菌体展示肽文库具体是Ph.D,12TM噬菌体展示肽文库、15聚体和20聚体随机肽文库。为进行该方法，制备了独特的以猪皮为底的96孔装置，所述装置是通过以下方法制备的在MinifoldIDot-BlotSystem(Schleicher&Schuell，Inc.,Keene，NH)的上层96孔板的下面加上一层Parafilm,然后在该Parafiln^层的上面加入一层无毛的猪皮，然后将该装置绷紧。猪皮可以购自地区超市，并且在-8(TC下储存。使用前，将猪皮放置在去离子水中解冻，然后用纸巾将其吸干。用90%的异丙醇擦拭猪皮表面，然后用去离子水沖洗。每个实验中采用含有大约4x101Gpfu来自感兴趣的文库的噬菌体的样品。首先将噬菌体文库的样品进行预处理，以除去毛发和塑料结合克隆。为了除去毛发结合克隆，将噬菌体文库的样品在室温下与获自InternationalHairImportersandProducts(Bellerose,NY)的人头发的样品一起温育l小时。这是采用以下程序进行的首先将头发室温下放置在90%异丙醇中30分钟，然后用去离子水冲洗5次，每次10分钟。室温下将头发晾干过夜。将头发切成lcm长，将10-20段头发放置在微量离心管，与噬菌体文库一起温育。暴露于毛发样品后，将噬菌体样品转移到聚苯乙烯、6孔细胞培养蔟(Corninglnc.,Acton，MA;目录号3526),在室温下温育l小时，以除去塑料结合克隆。将预处理的噬菌体样品加入含有猪皮样品的装置中，将混合物在室温下温育1小时。除去噬菌体溶液，将猪皮样品在未稀释的OlayAgeDefyingProtectiveRenewal洗液(Proctor&Gamble,Cincinnati,OH)中室温下温育5分钟。然后用TBST-0.5%緩冲液将猪皮洗涤6次。洗涤后，用由溶于0.2Mglycine-HC1,pH2.2的1mg/mLBSA组成的洗脱緩冲液处理猪皮，并且温育10分钟。然后，加入由1MTris-HCl，pH9.2组成的中和緩冲液。通过加入新的宿主细胞(大肠杆菌ER2338)扩增洗脱或仍然与皮肤结合的噬菌体。使扩增和分离的噬菌体与新鲜的皮肤样品接触，对于每个文库，将生物淘选程序再重复2次。第3轮生物淘选后，选择随机单噬菌体克隆，按照制造商的说明书(NewEnglandBiolabs)制备单噬斑裂解物，用QIAprepSpinMl3试剂盒(Qiagen;Valencia,CA)純化单链噬菌体基因组DNA，用SEQIDNO:2示出的-96gill测序引物(5，-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3，)在DuPont测序装置中进行测序。展示的肽紧接基因III的信号肽之后。鉴定的皮肤结合肽序列预期能够与皮肤调理剂基质中的皮肤结合，并且在其中稳定。实施例4(预示性)抗皮肤调理剂的皮肤结合肽的特异性本实施例的目的是描述如何釆用ELISA程序证明用实施例1-3的方法鉴定的抗皮肤调理剂的皮肤结合肽的特异性。将实施例1-3描述的方法鉴定的抗皮肤调理剂的皮肤结合肽与对照肽，即一种无关的毛发结合肽I-B5(上文引用的Huang等人的文献)一起使用，所述对照肽如SEQIDNO:3所示。用添加的赖氨酸残基合成所有的肽，所述赖氨酸残基通过SynPep(Dublin,CA)在C末端用荧光标记5-羧基焚光素-氨基己基amidite(5-FAM)衍生化。标记的I-B5毛发结合肽的序列示于SEQIDNO:4。对于该测定，在MinifoldIDot-BlotSystem(Schleicher&Schuell,Inc.,Keene,NH)的上层96孔板的下面加上一层Parafilm,在该Parafilm⑧层的顶部加上毛发或一层无毛的猪皮，然后将该装置绷紧，从而形成了独特的以毛发或猪皮为底的96孔装置。首先，通过将样品在室温温育1小时，用SuperBlock封闭緩沖液(Tris-緩冲的；PierceBiotechnology,Rockford，IL)封闭96孔装置中的毛发或皮肤样品。然后，用洗涤緩冲液(TBST-0.5%)将毛发或皮肤样品洗涤6次。将l.OmL结合緩冲液(含1mg/mLBSA的TBST-0.5%)中浓度为20的荧光素标记的肽加入每个孔，37。C下温育30分钟。用TBST-0.5%将毛发或皮肤样品洗涤6次，然后，每孔加入1.0mL抗焚光素/小鼠IgG(MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR)溶液(在封闭緩沖液中1:1000稀释)。将样品在室温下温育1小时，然后用洗涤緩沖液洗涤6次。然后，每孔加入1.0mL抗小鼠IgG-HRP缀合物(PierceBiotechnology)溶液(在封闭緩沖液中1:1000稀释)，将样品在室温下温育1小时。用洗涤緩沖液洗涤样品6次，每孔加入300nLTMB底物(PierceBiotechnology),将样品在室温下温育10分钟，然后从每孔取出100样品，加入新的微量滴定板的孔中。然后，每孔加入100pL终止溶液(2M石克酸溶液)，在450nm的波长测量每个样品的吸光度。测定通过重复运行而完成，每次运行由至少三次重复组成。预期抗皮肤调理剂的皮肤结合肽将与皮肤具有强结合亲和力，这是通过高A，值表明的，并且与毛发具有低结合亲和力，这是通过低A450值表明的。对照毛发结合肽I-B5将与皮肤具有低结合亲和力，与毛发具有高结合亲和力。实施例5(预示性)抗皮肤调理剂的皮肤结合肽与皮肤调理剂基质中的皮肤的结合本实施例的目的是证明抗皮肤调理剂的皮肤结合肽与皮肤调理剂基质中的皮肤结合。采用了实施例4中描述的相同ELISA法。分别用高剪切混合器(Silverson，ModelL4R7A;SilversonMachines,EastLongmeadow，MA)单独地将实施例1-3鉴定的皮肤结合肽与未稀释的OlayAgeDefyingProtectiveRenewal洗液混合6分钟，得到最终20|tiM的肽浓度。按照实施例4的描述封闭猪皮样品，然后37。C下在肽-调理剂混合物中温育30分钟。然后按照实施例4的描述洗涤和处理猪皮样品，在450nm的波长测量每个样品的吸光度。用相同的程序确定皮肤结合肽与緩沖液中的皮肤的结合。此外，用相同的程序进行对照，但是在皮肤调理剂和緩沖液中都不存在任何皮肤结合肽。预期如A45o值所指示的皮肤结合肽的结合亲和力在皮肤调理剂基质和緩沖液中将是相似的，表明抗皮肤调理剂的皮肤结合肽与皮肤调理剂基质中的皮肤强结合。实施例6(预示性)抗皮肤调理剂的皮肤结合肽在皮肤调理剂基盾中的稳定性本预示性实施例的目的是描述如何证明抗皮肤调理剂的皮肤结合肽在皮肤调理剂基质中的稳定性。按照实施例5中的描述，制备实施例1-3鉴定的皮肤结合肽在皮肤调理剂中的各自的混合物。为了比较，使用了皮肤结合肽在緩冲液中的溶液。所有溶液都保存在室温下，釆用实施例5描述的ELISA程序确定肽的结合活性，其中在不同的时间采集样品。也用緩冲液和不含皮肤结合肽的皮肤调理剂作为对照。预期在皮肤调理剂中保存最多至21天的时间后，皮肤结合肽的结合亲和力没有显著减少，这是通过A45Q值表明的。实施例7-10(预示性)抗皮肤清洁剂的皮肤结合肽的鉴别这些实施例的目的是描述如何从三个随机噬菌体展示肽文库鉴别抗皮肤清洁剂的皮肤结合肽的方法，这三个随机噬菌体展示肽文库具体是Ph.D,12TM噬菌体展示肽文库、15聚体和20聚体随机肽文库。采用了实施例1-3的程序，不同之处是用皮肤清洁剂，即Johnson的Head-to-Toe浴液(Johnson&Johnson,Skillman，NJ)代替了皮肤调理剂。预期鉴定的皮肤结合肽序列能够结合皮肤清洁剂基质中的皮肤，并且在其中稳定。按照实施例4中的描述确定皮肤结合肽的特异性。用实施例5描述的程序确定皮肤结合肽与皮肤清洁剂基质中的皮肤结合的能力，按照实施例6的描迷确定皮肤清洁剂基质中的皮肤结合肽的稳定性。实施例11-13抗浴液的皮肤结合肽的恭别这些实施例的目的是从三个随机噬菌体展示肽文库鉴别抗浴液的皮肤结合肽，这三个随机噬菌体展示肽文库具体是Ph.D,12TM噬菌体展示肽文库、15聚体和14聚体随机肽文库。为进行该方法，制备了独特的以猪皮为底的96孔装置，所述装置是通过以下方法制备的在MinifoldIDot-BlotSystem(Schleicher&Schuell，Inc.,Keene，NH)的上层96孔板的下面加上一层Parafilm,然后在该Parafiln^层的上面加入一层无毛的猪皮，然后将该装置绷紧。猪皮可以购自地区超巿，并且在-80。C下储存。使用前，将猪皮放置在去离子水中解冻，然后用纸巾将其吸千。用90%的异丙醇擦拭猪皮表面，然后用去离子水沖洗。首先，通过将样品在室温温育1小时，用SuperBlock封闭緩冲液(Tris-緩冲的；PierceBiotechnology,Rockford，IL)封闭96孔装置中的皮肤样品。然后，用洗涤緩冲液(TBST-0.5%)将皮肤样品洗涤6次。每个实验中采用含有大约lx1011pfu来自感兴趣的文库的噬菌体的样品。将嗟菌体文库的样品与Johnson的Head-to-Toe浴液(Johnson&Johnson,Skillman,NJ)预混合，加入皮肤孔中，轻柔振荡下在37。C温育30分钟。此后，取出并且弃去未结合的噬菌体颗粒。然后，用TBST緩沖液(0.5%Tween20)洗涤皮肤样品10次。将结合的噬菌体从皮肤上洗脱，然后取下装置的顶板(高于形成孔的皮肤的部分)，用新板代替。该步骤除去所有结合塑料的噬菌体。用由溶于0.2Mglycine-HC1，pH2.2的1mg/mLBSA组成的洗脱緩冲液处理猪皮，并且温育最多20分钟。然后，加入由lMTris-HC1，pH9.2组成的中和緩沖液。通过加入新的宿主细胞(大肠杆菌ER2338)扩增洗脱或仍然与猪皮结合的噬菌体。使扩增和分离的噬菌体与新鲜的皮肤样品接触，对于每个文库，将生物淘选程序再重复3次。第4轮生物淘选后，选择随机单噬菌体克隆，按照制造商的说明书(NewEnglandBiolabs)制备单i斑裂解物,用QIAprepSpinMl3试剂盒(Qiagen;Valencia,CA)纯化单链嗟菌体基因组DNA,用SEQIDNO:2示出的—96gill测序引物(5，-CCCTCATAGTTAGCGTAACG—3，)在DuPont测序装置中进行测序。展示的肽紧接基因III的信号肽之后。鉴定的抗浴液的皮肤结合肽序列如表1所示。表1抗浴液的皮肤结合肽的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>实施例14抗浴液的皮力夫结合肽的表征本实施例的目的是用ELISA程序评估抗浴液的皮肤结合肽的皮肤结合活性。通过感染新的宿主细胞(大肠杆菌ER2338)扩增实施例11-13中鉴定的噬菌体-肽克隆。将实施例11-13中描述的猪皮为底的96孔装置系统用于ELISA程序。对于要测试的每个克隆，将猪皮孔在室温下与400pL封闭緩冲液温育1小时，该緩冲液由溶于TBS中的2%脱脂奶粉(Schleicher&3^1^11,111(:.)组成。通过倒置系统并且用纸巾吸千，除去封闭緩冲液。用TBST-0.05。/。組成的洗涤緩冲液将系统沖洗6次。将100pL含有1mg/mLBSA和1x1011pfu喧菌体的TBST-0.5y。加入孔中。緩慢振荡下将样品在37。C温育15分钟。通过用TBST-0.5。/。洗涤孔10-20次，除去未结合的噬菌体。然后，将100nL在緩沖液中1:500稀释的辣根过氧化物酶/抗Ml3抗体缀合物(AmershamUSA,Piscataway,NJ)加入每个孔，室温下温育l小时。除去缀合溶液，用TBST-0.05。/。洗涤孔6次。将获自PierceBiotechnology(Rockford,IL)的TMB底物(200pL)力口入每个孔，室温下显色5-30分钟，典型是10分钟。然后，将终止溶液(200^L2MH2S04)加入每个孔，将溶液转移到96孔板，用微量滴定板分光光度计(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)测量450nm处的吸光度(A45Q)。得到的吸光度值报道为至少3次重复的平均值，平均值的标准误(SEM)示于表2。表2ELISA测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>从表2的数据可见，克隆对皮肤具有不同的亲和力，这是通过A45Q值测量的。但是，所有的克隆都对皮肤具有显著亲和力，这是通过A4so值显著高于荻自对照的A45Q值而表明的。实施例15浴液处理后抗浴液的皮肤结合肽的表征本实施例的目的是用ELISA程序评估用浴液处理后选定的抗浴液的皮肤结合肽的皮肤结合亲和力。采用实施例14中描述的ELISA程序，进行了以下修改。从孔中除去未结合的噬菌体肽，将200Johnson的Head-to-Toe浴液加入孔中，温育30分钟。进行实施例14描述的洗涤和显色步骤。对于緩沖液洗涤样品，采用了实施例14描述的相同程序。用相同程序测试分别示于SEQIDNOs:3和26的两种毛发结合噬菌体肽IB5和D21作为对照，它们具有已知的对皮肤的低结合亲和力。得到的吸光度值报道为至少3次重复的平均值，平均值的标准误示于表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>结果证明抗浴液的皮肤结合噬菌体肽对皮肤具有高结合亲和力，并且在浴液处理后保持对皮肤的显著结合亲和力。在緩冲液洗涤和浴液处理后，如预期的，毛发结合对照与皮肤结合肽噬菌体肽相比具有显著更低的对皮肤的结合亲和力。实施例16(预示性)抗浴液的皮肤结合肽的特异性本实施例的目的是采用ELISA程序证明如何确定实施例11-13鉴定的抗浴液的皮肤结合肽的特异性。实施例11-13筌定的抗浴液的皮肤结合肽与对照肽，即一种无关的毛发结合肽I-B5(上文引用的Huang等人的文献)一起使用，所述对照肽如SEQIDNO:3所示。用添加的赖氨酸残基合成所有的肽，所述赖氨酸残基通过SynP印(Dublm，CA)在C末端用焚光标记5-羧基荧光素-氨基己基amidite(5-FAM)衍生化。对于该测定，在MinifoldIDot-BlotSystem(Schleicher&Schuell,Inc.,Keene，NH)的上层96孔板的下面加上一层Parafilm,在该Parafiln^层的顶部加上毛发或一层无毛的猪皮，然后将该装置绷紧，从而形成了独特的以毛发或猪皮为底的96孔装置。首先，通过将样品在室温温育1小时，用SuperBlock封闭緩沖液(Tris-緩沖的;PierceBiotechnology,Rockford，IL)封闭96孔装置中的毛发或皮肤样品。然后，用洗涤緩冲液(TBST-0.5%)将毛发或皮肤样品洗涤6次。将l.OmL结合緩沖液(含1mg/mLBSA的TBST-0.5%)中浓度为20的荧光素标记的肽加入每个孔，37X:下温育30分钟。用TBST-0.5。/。将毛发或皮肤样品洗涤6次，然后，每孔加入1.0mL抗荧光素/小鼠IgG(MolecularProbes,Inc.,Eugene，OR)溶液(在封闭缓沖液中1:1000稀释)。将样品在室温下温育1小时，然后用洗涤緩冲液洗涤6次。然后，每孔加入1.0mL抗小鼠IgG-HRP缀合物(PierceBiotechnology)溶液(在封闭缓沖液中1:1000稀释)，将样品在室温下温育1小时。用洗涤緩冲液洗涤样品6次，每孔加入300TMB底物(PierceBiotechnology)。将样品在室温下温育10分钟，然后从每孔取出100样品，加入新的微量滴定板的孔中。然后，每孔加入100pL终止溶液(2M石危酸溶液)，在450nm的波长测量每个样品的吸光度。测定通过重复运4于而完成，每次运4于由至少三次重复组成。预期抗浴液的皮肤结合肽将与皮肤具有强结合亲和力，这是通过高A45o值表明的，并且与毛发具有低结合亲和力，这是通过低A45Q值表明的。对照毛发结合肽I-B5将与皮肤具有低结合亲和力，与毛发具有高结合亲和力。实施例17(预示性)基于皮肤结合肽的皮肤调理剂本预示性实施例的目的是描述如何制备基于肽的皮肤调理剂，其中使用3-马来酰亚胺基丙酸作为接头，将抗浴液的皮肤结合肽与8-臂聚乙二醇(8-臂PEG)偶联。8-臂聚乙二醇的官能化通过将0.97g(0.78mmol)8-臂PEG(Mw10kDa;可以获自NektarTransformingTherapeutics,Huntsville,AL)溶解于20mL四氢吹喃(THF)，制备8-臂PEG的溶液。在氮气中充分搅拌溶液，加入2mL3-马来酰亚胺基丙酸溶液(7.5mmol;Aldrich)。然后，加入2mLN,N，-二环己基-碳二亚胺(DCC)溶液(1.55g，溶于2mLDMF)，随后滴加250pL二甲基氨基吡啶(DMAP)。将混合物在50。C下搅拌过夜。第二天，将混合物冷却至室温，用中等玻璃过滤漏斗(ChemglassInc,Vineland,NJ)过滤。用大量乙醚/DMF(v/v30:1)沉淀滤液。收集沉淀物，溶解于70mL水，形成均质水溶液。用乙醚萃取水溶液4次。最后，冻千含水部分，得到干粉。将官能化的8-臂PEG接头与皮肤结合肽偶联将按照上文制备的官能化的8臂PEG接头悬浮于TBS緩沖液，将等摩尔比的抗浴液的皮肤结合肽Skin-cys-l(SEQIDNO:20)加入溶液中，所述结合肽在肽序列(SEQIDNO:27所示，获自SynPep)的C末端添加了半胱氨酸残基。室温下将混合物搅拌6小时。通过用水/乙醚萃取而纯化终产物，通过NMR分析。实施例18(预示性)制备基于肽的皮肤着色剂本实施例的目的是描述如何通过使抗浴液的皮肤结合肽Skin-cys-l(SEQIDNO:20)共价结合到DisperseOrange3染料上，制备基于肽的皮肤着色剂。首先用异氰酸酯官能化染料，然后与Skin-cys-l肽反应。DisperseOrange3的官能化在干燥箱中，将14.25gDisperseOrange3(Alddch)悬浮于在加料漏斗中的400mL无水THF中。将200mL无水曱苯装入含有磁力搅棒的2-升、四颈反应烧瓶(CorningInc.,Corning,NY;批号1533—12)。给烧瓶配备冷的指形冷凝管(CorningInc.,批号1209-04)和具有加料漏斗的第二个冷的指形冷凝管，并置于通风拒中的油浴上。在室温，将光气(25.4mL)浓缩在反应烧瓶中。添加完光气后，使油浴的温度升高到80°C,经2小时，以100mL的增量，将DisperseOrange3悬浮液逐滴加入反应烧瓶，同时监视反应温度和洗涤器排出的气体。在加料过程中，将温度维持在64。C或低于64°C。完成加料后，将反应物在64。C加热1小时，然后搅拌过夜，冷却至室温。将反应溶剂真空蒸馏至千燥，同时将内容物维持在40'C或低于40°C,并将真空另外维持1小时。将反应烧瓶转移至干燥箱；收集产物，过夜干燥。通过质子NMR，证实目标产物。将异氰酸酯官能化的染料与Skin-cys-l皮肤结合肽相偶联将如上所述制备的异氰酸酯官能化的DisperseOrange3[(2-(4-异氰酸基苯基)-1-(4-硝基苯基)二氮烯)(16mg)溶于5mLDMF中，并加入含有75mg未保护的Skin-cys-l肽(SEQIDNO:20)的溶液中，所述Skin-cys-l肽购自SynPep,且溶解在10mLDMF中。加入三乙胺(30mg)以催化反应。在室温搅拌溶液24小时。蒸发溶剂，产生暗红棕色粉末产物。通过MALDI质语法分析产物，以证实加合物形成。权利要求1.鉴定抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的方法，包括a)提供DNA联合的肽的组合文库；b)使(a)的文库与皮肤样品接触，其中皮肤与DNA联合的肽复合，形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液；c)从反应溶液分离(b)的DNA联合的肽-皮肤复合物；d)使(c)的分离的DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触，形成肽-皮肤复合物-组合物混合物，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10％；e)从肽-皮肤复合物-组合物混合物分离(d)的DNA联合的肽-皮肤复合物；f)扩增编码(e)的DNA联合的肽-皮肤复合物中的肽部分的DNA；和g)对(f)的扩增的编码抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的DNA进行测序，其中鉴定出抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽。2.权利要求l的方法，其中在步骤(e)之后i)使DNA联合的肽-皮肤复合物中的肽与洗脱剂接触，从而从皮肤洗脱一部分DNA联合的肽，而一部分DNA联合的肽保持复合；并且ii)使(ii)的洗脱或复合的DNA联合的肽进行步骤(f)和(g)。3.权利要求1或2的方法，其中编码肽的DNA是通过选自下组的过程扩增的a)聚合酶链反应；和b)用包含编码肽的DNA的噬菌体感染宿主细胞，并且使所述宿主细胞在合适的生长培养基中生长。4.权利要求1或2的方法，其中由步骤(f)的扩增的DNA编码的肽与新鲜的皮肤样品接触，并且重复步骤(b)-(f)—次或多次。5.权利要求l的方法，其中重复步骤(d)—次或多次。6.权利要求l的方法，其中在皮肤护理组合物基质中提供DNA联合的肽的组合文库，并且与皮肤样品接触，以形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%。7.权利要求l的方法，其中在皮肤护理组合物基质中提供DNA联合的肽的组合文库，并且与皮肤样品接触，以形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%，并且其中任选省略步骤(d)和(e)。8.权利要求1的方法，其中通过选自噬菌体展示、细菌展示和酵母展示的方法制备DNA联合的肽的组合文库。9.权利要求l的方法，其中在接触皮肤样品之前或同时，使DNA联合的肽的组合文库任选与非靶接触，以除去结合于非靶的肽。10.权利要求l的方法，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约20%。11.权利要求l的方法，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约50%。12.权利要求l的方法，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约75%。13.权利要求l的方法，其中皮肤护理组合物基质是未稀释的。14.又利要求2的方法，其中洗脱剂选自酸、碱、盐溶液、水、乙二醇、二-恶烷、硫氰酸盐、胍和脲。15.权利要求1的方法，其中皮肤护理组合物基质是皮肤调理产品。16.权利要求1的方法，其中皮肤护理组合物基质是皮肤清洁产品。肽a)提供DNA联合的肽的组合文库；b)使(a)的文库与皮肤样品接触，其中皮肤与DNA联合的肽复合，形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液；c)从反应溶液分离(b)的DNA联合的肽-皮肤复合物；d)使(c)的分离的DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触，形成肽-皮肤复合物-组合物混合物，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%;e)从肽-皮肤复合物-组合物混合物分离(d)的DNA联合的肽-皮肤复合物；f)扩增编码(e)的DNA联合的肽-皮肤复合物中的肽部分的DNA;和g)对(f)的扩增的编码抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的DNA进行测序，其中鉴定出抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽。17.<image>imageseeoriginaldocumentpage4</image>18.抗皮肤护理组合物的毛发结合肽，选自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和27。19.二嵌段的、基于肽的皮肤有益试剂，其具有通式结构(SCPm)n-BA，其中a)SCP是抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；b)BA是有益试剂；c)m的范围是1-约100;并且d)n的范围是1-约50,000。20.三嵌段的、基于肽的皮肤有益试剂，其具有通式结构[(SCPx-S)m〗n-BA，其中a)SCP是抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；b)BA是有益试剂；c)S是间隔基；d)x的范围是l-约10;e)m的范围是1-约100;并且f)n的范围是1-约50，000。21.权利要求19的二嵌段的、基于肽的有益试剂，其中所迷有益试剂是皮肤调理剂。22.权利要求20的三嵌段的、基于肽的有益试剂，其中所述有益试剂是皮肤调理剂。23.权利要求19的二嵌段的、基于肽的有益试剂，其中所述有益试剂是着色剂。24.权利要求20的三嵌段的、基于肽的有益试剂，其中所述有益试剂是着色剂。25.权利要求19-24的任一项的基于肽的有益试剂，其中所述抗a)提供DNA联合的肽的组合文库；、''、"b)使(a)的文库与皮肤样品接触，其中皮肤与DNA联合的肽复合，形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液；c)从反应溶液分离(b)的DNA联合的肽-皮肤复合物；d)使(c)的分离的DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触，形成肽-皮肤复合物-组合物混合物，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%;e)从肽-皮肤复合物-组合物混合物分离(d)的DNA联合的肽-皮肤复合物；f)扩增编码(e)的DNA联合的肽-皮肤复合物中的肽部分的DNA;和g)对(f)的扩增的编码抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的DNA进行测序，其中鉴定出抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽。26.权利要求19-24的任一项的基于肽的有益试剂，其中抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的长度是约7个氨基酸-约25个氨基酸。27.权利要求19-24的任一项的基于肽的有益试剂，其中抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的长度是约12个氨基酸-约20个氨基酸。28.权利要求19-24的任一项的基于肽的有益试剂，其中抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽进一步包含至少一个位于肽的至少一个末端的半胱氨酸残基，所述末端选自a)N末端；和b)C末端。29.权利要求19-24的任一项的基于肽的有益试剂，其中抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽进一步包含至少一个位于肽的至少一个末端的赖氨酸残基，所述末端选自a)N末端；和b)C末端。30.权利要求19-24的任一项的基于肽的有益试剂，其中所述抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽具有选自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和27的氨基酸序列。31.权利要求21或22的基于肽的有益试剂，其中所述皮肤调理剂选自聚水杨酸酯、丙二醇、甘油、乙醇酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖二酸、半乳糖二酸、3-羟基戊酸、水杨酸和1,3丙二醇。32.权利要求23或24的基于肽的有益试剂，其中所述着色剂选自D&CRedNo.21、D&CRedNo.27、D&CRedOrangeNo.5、D&CRedNo.21、D&COrangeNo.10、二氧化钬、氧化辞、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>OrangeNo.l7、D&CRedNo.7、11、31和34的4丐色淀、D&CRedNo.12的钡色淀、D&CRedNo.13的锶色淀、FD&CYellowNo.5的铝色淀、FD&CYellowNo.6的铝色淀、D&CRedNo.27的铝色淀、D&CRedNo.21的铝色淀和FD&CBlueNo.l的铝色淀、氧化铁、锰紫、氧化铬、群青蓝、炭黑、二羟基丙酮和有色微球。33.权利要求32的基于肽的有益试剂，其中所述有色微球包含选自下组的材料聚苯乙烯、聚曱基丙烯酸曱酯、聚乙烯基甲苯、苯乙烯/丁二烯共聚物和胶乳，并且微球具有约10纳米至约2微米的直径。34.权利要求20、22或24的基于肽的有益试剂，其中所述间隔基选自乙醇胺、乙二醇、链长为6个碳原子的聚乙烯、具有3-6个重复单元的聚乙二醇、苯氧乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯基、乙基烷基链、丙基烷基链、己基烷基链、甾醇基烷基链、十六烷基烷基链和棕榈酰基烷基链。35.权利要求20、22或24的基于肽的有益试剂，其中所述间隔基是包含氨基酸的肽，所述氨基酸选自脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸及其混合物。36.权利要求20、22或24的基于肽的有益试剂，其中所述间隔基是包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列选自SEQIDNO:l、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。37.皮肤护理产品组合物，包含有效量的权利要求19或20的基于肽的有益i式剂。38.皮肤调理产品组合物，包含有效量的权利要求21或22的基于肽的有益试剂。39.皮肤着色产品组合物，包含有效量的权利要求23或24的基于肽的有益试剂。40.皮肤着色产品组合物，包含有效量的权利要求21或22的基于肽的有益试剂。41.皮肤清洗产品组合物，包含有效量的权利要求21或22的基于肽的有益试剂。42.在皮肤上形成基于肽的调理剂的保护层的方法，包括将权利要求38的组合物施用于皮肤，使得形成所述保护层。43.使皮肤着色的方法，包括将权利要求39的组合物施用于皮肤，持续足够导致皮肤着色的时间。44.使皮肤着色的方法，包括以下步骤a)提供包含选自下组的皮肤着色剂的皮肤着色组合物i)(SCPm)n-C;和ii)[(SCPx-S)m]n-C其中1)SCP是抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；2)C是着色剂；3)n的范围是1-约50,000;4)S是间隔基；5)m的范围是1-约100;并且6)x的范围是1-约10;并且其中抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽是通过包含以下步骤的方法选择的A)提供DNA联合的肽的组合文库；B)使(A)的文库与皮肤样品接触，其中皮肤与DNA联合的肽复合，形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液；C)从反应溶液分离(B)的DNA联合的肽-皮肤复合物；D)使(C)的分离的DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触，形成肽-皮肤复合物-组合物混合物，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%;E)从肽-皮肤复合物-组合物混合物分离(D)的DNA联合的肽-皮肤复合物；F)扩增编码(E)的DNA联合的肽-皮肤复合物中的肽部分的DNA;和G)对(F)的扩增的编码抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的DNA进行测序，其中鉴定出抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；和b)将(a)的皮肤着色组合物施用于皮肤，持续足以使皮肤着色剂结合于皮肤的一段时间。45.在皮肤上形成基于肽的调理剂的保护层的方法，包括以下步骤a)提供包含选自下组的皮肤调理剂的皮肤护理组合物^)(SCPm)n-SCA;和ii)[(SCPx-S)m]n-SCA其中1)SCP是抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；2)SCA是皮肤调理剂；3)n的范围是l-约50，000;4)S是间隔基；5)m的范围是l-约100;并且6)x的范围是1-约10;下步骤的方法选择的A)提供DNA联合的肽的组合文库；B)使(A)的文库与皮肤样品接触，其中皮肤与DNA联合的肽复合，形成包含DNA联合的肽-皮肤复合物的反应溶液；C)从反应溶液分离(B)的DNA联合的肽-皮肤复合物；D)使(C)的分离的DNA联合的肽-皮肤复合物与皮肤护理组合物基质接触，形成肽-皮肤复合物-组合物混合物，其中皮肤护理组合物基质的浓度是完全强度浓度的至少约10%;E)从肽-皮肤复合物-组合物混合物分离(D)的DNA联合的肽-皮肤复合物；F)扩增编码(E)的DNA联合的肽-皮肤复合物中的肽部分的DNA;和G)对(F)的扩增的编码抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的DNA进行测序，其中鉴定出抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽；和b)将(a)的皮肤护理组合物施用于皮肤，使得形成所述保护层。全文摘要描述了一种鉴定抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的方法。这种抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽与皮肤护理组合物基质中的皮肤强结合并且在其中稳定。描述了基于抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽的基于肽的有益试剂，如皮肤调理剂和着色剂。基于肽的皮肤调理剂和皮肤着色剂由直接或通过任选的间隔基与皮肤调理剂或着色剂偶联的抗皮肤护理组合物的皮肤结合肽组成。还描述了包含这些基于肽的皮肤调理剂和着色剂的皮肤护理和皮肤着色产品组合物。文档编号C12Q1/68GK101218356SQ200680014985公开日2008年7月9日申请日期2006年2月28日优先权日2005年3月1日发明者H·王,J·P·奥布里恩,Y·吴申请人:纳幕尔杜邦公司