专利名称：乳腺癌相关基因znfn3a1的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测和诊断乳腺癌的方法，以及治疗和预防乳腺癌和乳腺 癌转移的方法。
本申请要求2005年2月28日提交的美国临时申请流水号60/657,581 的优先权，其全文内容包含在本说明书中作为参考。
背景技术：
乳月泉癌(BRC)是一种遗4专异质疾病(genetically heterogeneous disease),是
在女性中最为常见的恶性肿瘤。全世界每年报导的推测的新发病例约为 800,000例(Parkin DM.等，(1999) CA Cancer J Clin 49: 33-64)。目前，对于该 疾病，乳房切除术是首选的治疗方案。然而，即便手术切除了原发性肿瘤， 由于诊断时存在不能检出的微小转移(Saphner T,等，(1996) J Clin O则l 14, 2738-2749)，其会在局部或远端部位复发。为了杀死这样的残留细胞或癌前 细胞，通常在手术后作为辅助疗法施用细胞毒剂。
使用传统的化学治疗剂的治疗常常依赖于经验，其主要是基于组织学 的肿瘤参数，而缺乏对具体机制的认识。靶向性药物因而正逐渐成为治疗 BRC的基础。他莫昔芬(Tamoxifen)和芳香酶抑制剂是此类药物的2个代 表，将其作为辅剂或化学预防剂适用于患有转移性BRC的患者，获得了良 好的反应(Fisher B.等(1998) J Natl Cancer Inst 90， 1371-88; Cuzick J (2002) Lancet 360， 817-24)。然而，其缺点是只有表达雌激素受体的患者才对这 些药物敏感。最近，人们对其副作用的关注程度有所提高，这些副作用明 显集中在长期的他莫昔芬治疗引发子宫内膜癌的可能性和对接受芳香酶治 疗的绝经后女性中骨折的有害作用(Coleman RE (2004) Oncology. 18 (5 Suppl 3), 16-20)。因为副作用和耐药性的产生，基于特征明确的作用机制探 索和鉴定选择性智能(smart)药物的新分子靶标，现在已经十分必要。
BRC是与多个遗传性改变相关的复杂疾病。尽管对这些异常是否是乳 腺肿瘤发生的原因知之甚少，但据报道，其发生是一个多步骤的过程，该 过程在广义上等同于正常细胞的转化，包括非典型性导管增生、原位导管 癌(DCIS)和浸润性导管癌(IDC)等几个阶段。获得的证据表明仅有部分恶
化前损害会发展成为浸润性癌症，而其它损害会自发消退。有关导致原发 性乳腺癌的发生、发展和转移形成的参与分子的解释将成为以预防和治疗 为目标的新策略的主要焦点。
与传统的组织病理学方法能够提供的信息相比，通过cDNA微阵列分 析而制成的基因表达分布图能提供更多有关各癌症特性的细节。这样的信 息的价值在于其能够改进治疗肿瘤疾病和开发新药的临床策略(Petricoin, E. F.等，(2002) Nat Genet, W Sw/ ; /: 474-9.)。为此，本发明人通过cDNA微阵 列分析了源自多种组织的肿瘤的表达分布图(Okabe， H.等，(2001) Cancer Res 6/: 2129-37.; Hasegawa, S.等，(2002) Cancer Res, 62, 7012-7.; Kaneta， Y.等， (2002) Jpn J Cancer Res， 9丄.849-56.; Kaneta， Y,等，(2003) lnt J ()ncol, 2丄 681-91.; Kitahara, O.等，(2001) Cancer Res, 6/.. 3544-9.; Lin, Y.等，(2002) Oncogene, 2/: 4120-8.; Nagayama, S.等，(2002) Cancer Res， 62: 5859-66.; Okutsu， J.等,(2002) Mol Cancer Ther, 1035-42.; Kikuchi, T.等,(2003) Oncogene, 22, 2192-205.)。
最近，有人使用cDNA微阵列详细调查了数千个基因的表达水平，结 果发现了在各种类型的乳腺癌中不同的模式(Sgroi, D. C.等，(1999) Cancer Res, 59, 5656-61.; Sorlie, T.等，(2001) Proc Natl Acad Sci USA, 10869-74.; Kauraniemi, R等，(2001) Cancer Res, (57: 8235-40.; Gruvberger, S.等,(2001) S. Cancer Res, 6/, 5979-84.; Dressman， M.等，(2003) Cancer Res, 63: 2194-2199.)。
通过此前对乳腺癌的基因表达分布图进行的研究，鉴定出可用作候选 诊断标记和/或预后判断的候选的基因。然而，这些主要得自肿瘤块的数据 并不能确切反映乳腺癌发生过程中的表达改变，因为乳腺癌细胞以实体块 的形式存在，所述实体块具有严重的炎症反应并含有多种细胞组分。因此， 以前公开的微阵列数据可能反映的是异源分布图。
在为揭示癌症发生机制而安排的研究中，某些种类的抗肿瘤剂的分子 靶标的鉴定工作得以加强。例如，在动物模型中，法尼基转移酶抑制剂(FTI) 显示出其可有效治疗Ras依赖性肺瘤(Sun J等，(l"8) Oncogene 16:1467-73.),当初开发该抑制剂的目的是为了抑制活化依赖于翻译后法尼 基化的Ras相关的生长信号传导途径。类似地，使用抗癌药物、以拮抗原 癌基因受体HER2/neu为目的的抗HER2单克隆抗体和trastuzumab的组合
对人体进行的临床试验，改善了乳腺癌患者的临床反应和总存活(Molina MA,等，(2001) Cancer Res.;61(12):4744-9.)。此外，已经开发出能够选择性 失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制剂STI-571以治疗慢性髓性白血病， 在所述'隻性髓性白血病中，bcr-abl酪氨酸激酶的组成型活化在白细胞转化 中起着至关重要的作用。这些种类的药物被设计成用于抑制具体基因产物 的致癌活性(O'Dwyer ME & Druker BJ. (2000) Curr Opin Oncol.;12(6):594-7)。 因此，在癌细胞中通常上调的基因产物显然可以成为开发新抗癌剂的潜力 靶标。
经证实，CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)能识别MHC I类分子上呈递的 肿瘤相关抗原(TAA)的表位肽并裂解肿瘤细胞。自发现首例TAA——MAGE 家族以来，采用免疫学方案已经发现了很多其它的TAA(Boon, (1993) Int J Cancer 54: 177-80; Boon and van der Bruggen, (1996) J Exp Med 183: 725-9; van der Bruggen等，(1991) Science 254: 1643-7; Brichard V等,(1993)JExp Med 178:489-95; KawakamiY等，(1994) J Exp Med 1 80: 347-52.)。目前，正 作为免疫疗法的靶标对一些新发现的TAA进行临床开发。迄今为止所发现 的TAA包括MAGE (van der Bruggen等，(1991) Science 254: 1643-7)， gpl()() (KawakamiY等，(1994) J Exp Med 180:347-52)， SART (Shichijo S等，(1998) J Exp Med 187: 277-88)和NY-ESO-1 (Chen YT等，(1997) Proc Natl Acad Sci USA94: 1914-8)。另一方面，经证实在肿瘤细胞中特异性过表达的基因产物 可以作为诱导细胞免疫应答的靶标被识别。这样的基因产物包括p53 (Umano Y等，(2001) Brit J Cancer 84: 1052-7)， HER2/neu (Tanaka H等，(2001) Brit J Cancer 84: 94-9), CEA (Nukaya I等，(1999) Int J Cancer 80: 92-7)等。
尽管已在与TAA有关的基础和临床研究中取得显著进步(Rosenberg SA等，(1998) Nature Med 4: 321-7.; Mukherji B等，(1995) Proc Natl Acad Sci USA 92: 8078-82.; HuX等，(1996) Cancer Res 56: 2479-83.)，但目前可以使 用的能治疗腺癌、包括结肠直肠癌的候选TAA的数目仍然很有限。在癌细 胞中大量表达且其表达局限于癌细胞中的TAA被认为是理想的候选免疫治 疗耙标。此外，鉴定能诱导有效而特异性的抗肿瘤免疫应答的新型TAA有 望促进在临床上针对多种类型的癌症使用肽接种策略(Boon and van der Bruggen, (1996) J Exp Med 183: 725-9.; van der Bruggen等，(1991) Science 254: 1643-7.; Brichard V等，(1993) J Exp Med 178: 489-95.; Kawakami Y等,(1994) J Exp Med 180: 347-52.; Shichijo S等，(1998) J Exp Med 187: 277-88.; Chen YT等，(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8.; Harris CC, (1996) J Natl Cancer Inst 88: 1442-5.; Butterfield LH等，(1999) Cancer Res 59: 3134-42.; Vissers JL等，(1999) Cancer Res 59: 5554-9.; van der Burg SH等，(1996) J Immunol 156: 3308-14.; Tanaka F等，(1997) Cancer Res 57: 4465-8.; Fujie T 等，(1999) Int J Cancer 80: 169-72.; Kikuchi M等，(1999) Int J Cancer 81: 459-66.; OisoM等，(1999) Int J Cancer 81: 387-94.)。
据多篇文献报导，源自某些健康供体的经肽刺激的外周血单个核细胞 (PBMC)对肽做出应答，产生显著水平的IFN-a，但在"Cr-释放试验中很少 以局限于HLA-A24或A0201的方式对肿瘤细胞发挥细胞毒性(Kawano K等， (2000) Cancer Res 60: 3550-8.; Nishizaka S等，(2000) Cancer Res 60: 4830-7.; TamuraM等，(2001) Jpn J Cancer Res 92: 762-7.)。然而，与在白种人群中相 同，在日本人中，HLA-A24和HLA-A0201两者均是常见的HLA等位基因 (DateY等，(1996) Tissue Antigens 47: 93-101.; Kondo A等，(1995) J Immunol 155: 4307-12.; Kubo RT等，(1994) J Immunol 152: 3913-24.; Imanishi T等， (1992) Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065.; Williams F等'(1997) Tissue Antigen 49: 129.)。因此，由这些HLA呈递的癌症抗原肽对于治疗曰 本人和白种人人群的癌症特别有用。另外，已知使用高浓度的肽通常可在 体外诱导低亲和力的CTL，由此在抗原呈递细胞(APC)上产生高水平的特异 性肽/MHC复合物，有效激活这些CTL(Alexander-Miller MA等，(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7.)。
发明内容
本发明基于如下发现在乳腺癌(BRC)细胞中ZNFN3A1基因的表达特 异性地且显著地上升。ZNFN3A1(又称"SMYD3")的核苦酸序列和氨基酸序 列分别记载于SEQ ID NOs: 4和5 。这些序列同样可以从Genbank Accession NO.AB057595获得，其基因符号为"S緒D3"。
因此，本发明提供通过测定源自患者的生物样品，如组织样品中 ZNFN3A1的表达水平，以诊断或判断受试者BRC易感性(pi.t、disposition to BRC)的方法。正常细胞是从乳腺组织获得的细胞。表达水平与该基因的
正常对照水平相比发生改变例如上升或下降，表示受试者患有BRC或存在 罹患BRC的风险。
在本发明的上下文中，术语"对照水平"是指在对照样品中检出的蛋白质 表达水平，其包括正常对照水平和BRC对照水平。对照水平可以是来自单 个参照群体的单个表达分布图，也可以是来自多个表达分布图的单个表达 分布图。例如，对照水平可以来自以前检测的细胞的表达分布图数据库。"正 常对照水平"是指在正常健康个体中、或者在已知未患乳腺癌的个体的群组 中检出的基因表达水平。正常个体是没有乳腺癌临床症状的个体。另一方 面，"BRC对照水平，，是指在患有BRC的人群中发现的ZNFN3A1的表达分 布图。
与正常对照水平相比，在受试样品中检出的ZNHN3A1表达水平上升， 表明(取样的)受试者患有乳腺癌或存在罹患乳腺癌的风险。
根据本发明，当基因的表达与对照水平相比上升或下降至少10%、优 选至少25%、更优选至少50%或其以上时，可认为基因表达水平"发生改变"。 此外，当基因的表达与对照水平相比上升或下降至少0.1倍、至少0.2倍、 至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍或其以上时，可认为表达水平 "上升"或"下降"。可以例如检测ZNFN3A1探针与源自患者的组织样品中的 基因转录物的杂交，从而确定表达。
在本发明的上下文中，源自患者的组织样品可以是得自受试者，例如 已知或怀疑患有BRC的患者的任何组织。例如，所述组织可以包含上皮细 胞。更具体地，所述组织可以是源自乳腺导管癌的上皮细胞。
本发明还提供通过使表达ZNFN3 A1的受试细胞与受试化合物接触，并 测定ZNFN3A1的表达水平或其基因产物的活性来鉴定物质的方法，所述物 质能够抑制或增强ZNFN3A1的表达或活性。受试细胞可以是上皮细胞，例 如来自乳腺癌的上皮细胞。如果与在不存在受试化合物时检出的表达水平 或基因产物的活性相比，ZNFN3A1的表达水平或其基因产物的活性下降， 则表明受试物质是ZNFN3A1的抑制剂，因而可用于减轻BRC的症状。
本发明的目的还在于提供通过将源自患者的生物样品中的ZNFN3A1 表达水平与对照样品的ZNFN3A1表达水平相比较，来评价或判断乳腺癌患 者的预后的方法。表达水平上升表示存活率低。特别是，在源自患者的样
品中测定的ZNFN3A1的表达水平越高，涉及治疗后的緩解、恢复和/或存 活率的预后越差，临床效果不良的可能性越大。
本发明的目的还在于提供监测乳腺癌的治疗过程的方法，该方法包括 将治疗后采集的源自患者的生物样品中的ZNFN 3 A1水平与治疗前采集的 源自患者的生物样品的ZNFN3A1水平或对照样品的ZNFN3A1水平进行比 较的步骤。治疗后ZNFN3A1表达水平降低，表明治疗有效和/或预后良好。 反之，治疗后ZNFN3A1表达水平上升或缺少变化，表明治疗无效和/或预 后不良。
本发明还提供用于乳腺癌检测的试剂盒，该试剂盒含有与ZNFN3A1核 酸序列或多肽结合的检测试剂。
本发明的治疗方法包括治疗或预防受试者中BRC的方法，该方法包括 给受试者施用反义组合物的步骤。在本发明的上下文中，反义组合物能降 低指定靶基因的表达。例如，反义组合物可以含有与ZNFN3A1序列互补的 核苷酸。此外，本发明的方法可以包括给受试者施用小干扰RNA (siRNA) 组合物的步骤。在本发明的上下文中，siRNA组合物能降低ZNFN3Al的表 达。在另一个方法中，通过给受试者施用核酶组合物来治疗或预防'l:试者 中的BRC。在本发明的上下文中，核酸特异性核酶组合物能降低ZNFN3A1 的表达。实际上，在本i兌明书确认了 siRNA对ZNFN3A1的抑制效应。例 如，通过本申请的实施例，明确地证实了针对ZNFN3A1的siRNA抑制BRC 细胞的细胞生长。因此，在本发明中ZNFN3A1是乳腺癌的优选治疗靶标。
本发明还包括疫苗和疫苗接种(vaccination)方法。例如，治疗或预防受 试者中BRC的方法包括给受试者施用疫苗的步骤，所述疫苗含有由 ZNFN3A1的核酸编码的多肽或这样的多肽的免疫活性片段。在本发明的上 下文中，免疫活性片段是长度短于全长天然蛋白质、但其诱导的免疫应答 与全长蛋白质所诱导的免疫应答相类似的多肽。例如，免疫活性片段的长 度至少为8个残基，并能够刺激T细胞或B细"包等免疫细胞。通过4企测细 胞生长、细胞因子(如1L-2)生成或抗体产生可以测定免疫细胞刺激，
本说明书记载的方法的 一 个优势是可以在检出乳腺癌的明显临床症状 之前对疾病进行鉴定。结合附图和实施例以及附于本说明书的权利要求书， 再通过阅读以下的详细说明，本发明的其它目的、特点和优势能够更清楚 地显现出来。
图l显示了 BRC组织相关的ZWFiV^4/表达的上升。(a)部分，记录 了在具有不同组织学的92例BRC组织的微阵列数据中，不同标准的 ZA^7V047表达上升的样本数量。(b )部分，显示了采用半定量RT-PCR分 析得到的12例癌组织、15名绝经前患者来源的正常乳&泉导管上皮细^^的混 合物(混合)以及完整正常乳腺(MG )中的ZA^A047表达。以(L4尸Z)// 的表达作为内部对照。(c )部分，显示了通过western印迹分析测定的BRC 组织(T)和相应的非癌性乳腺组织(N)中ZNFN3A1蛋白的存在。以GAPDH 的表达作为对照。图2显示了细胞内的切断型ZNFN3A1蛋白。(a)部分，显示了表达 野生型ZNFN3A1蛋白和缺失型ZNFN3A1蛋白的质粒的相无略图。(b)部分， 显示了使用抗ZNFN3A1抗体(左)或抗Flag抗体(右)对野生型和突变体 ZNFN3A1 -进4亍western印迹分析的结果。图3显示了在4种BRC组织中ZNFN3A1蛋白的免疫组织孑匕学染色 结果。用H&E (上)和抗ZNFN3A1抗体(下)对冰冻切片进行染色。 〖图4]图4显示了 ZNFN3A1参与BRC细月包的生长。(a)部分，显示了 BRC 细胞系中的ZNFN3A1表达。(b )部分，显示对BRC细胞生长而言，击倒 (knock down )ZNFN3 A1的效果。特另'J是，与沖莫拟或萤光素酶si脂A(siLuc) 相比，ZNFN3A1 -siRNA# 12(si# 12)显著抑制细胞生长。
具体实施例方式
除非另有说明，本说明书中使用的词语"一个"或"一种"或"该"是指至少 一个或至少一种。
本说明书中引用的专利、专利申请和出版物的全文全部并入本说明书
作为参考。
除非另有说明，本说明书中使用的全部专业术语和科学用语的含义均 与本发明所属技术领域的技术人员一^L理解的含义相同。但如有沖突，以 包含定义的本说明书为准。
BRC细胞一般以实体肿块的形式存在，其具有高度炎性反应并含有多 种细胞组分。因此，以前公开的微阵列数据很可能反映的是异型分布图。
本发明部分基于以下发^见在患有BRC的患者来源的细力包中， ZNFN3A1的表达上升。 如SEQ ID NO: 4所示，Z7WW3J7 cDNA由1622个核苷酸组成，其中 含有1284个核苷酸的开放阅读框，该开放阅读框编码具有锌指基序的428 个氨基酸的推定蛋白。锌指结构域(MYND )位于密码子49-87, SET (Su 3-9, Enhancer-of-zeste, Trihorrax)结构域位于密码子117-246。 ZNFN3A1蛋白优 选包含SEQ. ID. NO.5记载的氨基酸序列。
此前，ZNFN3A1基因已被鉴定为在肝细胞癌和结肠直肠癌中表达上调 的基因(见WO 2003/027143)。进一步，ZNFN3A1的siRNA在肝细胞癌和结 肠直肠腺癌治疗中的有效性得到证实(见WO 2004/76623)。令人感兴趣的 是，ZNFN3A1蛋白质的亚细胞定位因细胞周期的进展阶段及培养细胞的密 度而变化。当细胞处于S期的中期至晚期或在低密度条件下进行培养时， ZNFN3A1蛋白质在细胞核内聚集；当细胞处于细胞周期的其它阶段或在高 密度条件下生长时，ZNFN3A1位于细胞质和细胞核。ZNFN3A1可与RNA 螺旋酶KIAA0054直接结合，并可与RNA聚合酶II形成复合体，该复合体 可通过与EGFR基因5'侧翼区的元件"(C)CCCTCC(T)"的直接结合，激活包 括表皮生长因子受体(EGFR)的下游基因的转录。NIH3T3细胞中，ZA^FA04/ 的外源性表达导致细胞生长加强，而利用反义S-寡核苷酸抑制其表达，可 明显抑制癌细胞生长,，由此看来，ZNFN3A1通过携带RNA螺旋酶和KNA 聚合酶II的复合体激活包括EC^7 的靶基因的转录，从而赋予癌细胞致癌 活性。从其表达在得自患有BRC的患者的细胞中上升来看，抑制ZNFN3A1 或其复合体的活性是治疗BRC的有望策略。
在本说明书中，使用cDNA微阵列对92例乳腺癌进行了分析，将肿瘤 /正常组织的截留值(cut-off)设置为大于2时，确定在69例浸润性乳腺导管 癌(IDC )的36例和11例原位乳腺导管癌(DCIS )的6例中ZA^A047表 达上升。因此，本发明涉及经鉴定为BRC标记和BRC基因靶标的ZNFN3A1 的诊断价值，其表达会因治疗或緩解BRC的症状而改变。特别是，通过测 定细胞样品中ZNFN3A1的表达，可以诊断BRC。同样地，测定应答于各 种物质的ZNFN3A1的表达，可以鉴定用于治疗BRC的药物。
本发明包括确定(例如测定)ZNFN3A1的表达。使用GenBank'M数据库 登录项提供的已知序列的序列信息，用本领域普通技术人员公知的技术即 可检测和测定ZNFN3A1。例如，可使用对应于ZNFN3A1的序列数据库登 录项中的序列构建探针，以在例如Northern印迹杂交分析中检测对应于 ZNFN3A1的RNA序列。作为另一个例子，可以使用序列构建引物，从而 在例如基于扩增的检测方法中特异性扩增ZNFN3A1核酸，所述检测方法例 如基于逆转录的聚合酶链反应。
然后，将受试细胞群体例如患者来源的组织样品中ZNFN3A1的表达水 平与参照群体中ZNFN3A1的表达水平进行比较。参照细胞群体包括一种或 多种已知比较参数的细胞，即乳腺导管癌细胞(例如BRC细胞)或正常乳腺 导管上皮细胞(例如非BRC细胞)。
与参照细胞群体相比，受试细胞群体中的基因表达模式是否能表示 BRC或其倾向性(predisposition)取决于参照细胞群体的组成。例如，如果 参照细胞群体由非BRC细胞组成，受试细胞群体和参照细胞群体之间基因 表达模式的相似性表示受试细胞群体是非BRC。反之，如果参照细胞群体 由BRC细胞组成，受试细胞群体和参照细胞群体之间基因表达分布图的相 似性表示受试细胞群体含有BRC细胞。
与参照细胞群体中相应的ZNFN3A1基因的表达水平相比，如果受试细 胞群体中ZNFN3A1基因的表达水平提高大于1.1倍、大于1.5倍、大于2.0 倍、大于5.0倍、大于10.0倍或更多，即可认为其"发生了改变"。
酸进行归一化，所述对照核酸例如持家基因。例如，对照核酸是已知不因 细胞的癌或非癌状态而存在差异的核酸。可以 一用对照核酸的表达水平对 受试和参照群体中的信号水平进行归一化。例如，对照基因包括但不限于
(3-肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl。
可以将受试细胞群体与多个参照细胞群体相比较。其中每个参照群体 的已知参数可以不同。因此，受试细胞群体可以与已知含有例如BRC细胞 的第一参照细胞群体和已知含有例如非BRC细胞(正常细胞)的第二参照细 胞群体相比较。受试细胞可以包含在受试者来源的组织型或细胞样品中， 所述组织型或细胞样品已确定含有或被怀疑含有BRC细胞。
受试细胞可以来自身体组织或体液，例如生物体液(如血液、尿液或痰)。 例如，受试细胞可以纯化自乳房组织。优选受试细胞群体含有上皮细胞。 上皮细胞优选来自已知或疑似为乳腺导管癌的组织。
参照细胞群体中的细胞应来自与受试细胞的来源组织类似的组织类 型。可选地，参照细胞群体是细胞系，例如BRC细胞系(即阳性对照)或正常非BRC细胞系(即阴性对照)。或者，对照细胞群体可以来自分子信息数 据库，所述分子信息来源于已知测试参数或条件的细胞。
受试者优选为哺乳动物。例如，哺乳动物包括但不限于人、非人灵长 类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛。
可使用本领域已知的方法，在蛋白质或核酸水平上斥企测本说明书公开
的ZNFN3A1的表达。例如，可以采用Northern杂交分析测定基因表达， 所述Northern杂交分析使用了特异性识别这些核酸序列中的一个或多个序 列的探针。此外，可以使用例如ZNFN3A1序列的特异性引物、采用基于逆 转录的PCR检测法测定基因表达。还可以在蛋白质水平上测定表达，即通 过测定由本说明书所述基因编码的多肽的水平或其生物活性来检测表达。 这样的方法是本领域公知的，例如包括但不限于例如免疫测定法，该方法 利用了抗所述基因编码的蛋白质的抗体。由ZNFN3A1基因编码的蛋白质的 生物活性一^殳是本4支术领域公知的。例如，ZNFN3A1显示其与Ill':LZ(RNA 螺旋酶)或RNA聚合酶II相互作用，以及具有甲基转移酶活性(见WO 2005/71102,其全部内容引入本说明书作为参考)。 BRC的诊断
在本发明的上下文中，通过测定细胞的受试群体细胞(即患者来源的生 物样品)中ZNFN3A1的表达水平来诊断BRC。优选受试细胞群体含有上皮 细胞，例如得自乳房组织的细〗包。还可以由血液或其它体液(如尿液)测 定基因表达。其它生物样品也可用于测定蛋白质水平。例如，可采用免疫 测定法或其它常规生物学试验测定待诊断受试者来源的血液或血清中的蛋 白质水平。
测定受试细胞或生物样品中ZNFN3A1的表达，并与ZNFN3A1相关的 正常对照表达水平进行比较。正常对照水平是典型地在已知未患BRC的群 体中发现的BRC的表达分布图。患者来源的组织样品中，ZNFN3A1表达 水平的改变(例如上升)表示该受试者患有BRC或存在罹患BRC的风险。例 如，与正常对照水平相比，受试群体中ZNFN3A1的表达上升，表示该受试 者患有BRC或存在罹患BRC的风险。
与正常对照水平相比，受试群体中ZNFN3A1发生改变，表示该受试者 患有BRC或存在罹患BRC的风险。 抑制ZNFN3A1的表达的物质的鉴定
使表达ZNFN3A1的受试细胞群与受试物质接触、然后测定ZNFN3A1 的表达水平或其基因产物的活性，可以鉴定抑制ZNFN3A1的表达或其基因 产物的活性的物质。与不存在受试物质条件下的表达或活性水平相比，存 在受试物质条件下ZNFN3A1的表达水平或其基因产物的活性水平下降，表 明该物质是ZNFN3A1的抑制剂，可用于抑制BRC。
受试细胞群可以是表达ZNFN3A1的任何细胞。例如，受试细胞群可以 包含上皮细胞，所述上皮细胞诸如乳房组织来源的细胞。而且，受试细胞 还可以是癌细胞来源的无限增殖细胞系。此外，受试细胞还可以是用 ZNFN3A1转染的细胞，或者是用来源于ZNFN3A1的、与报告基因可操作 相连的调控序列(例如启动子序列)转染的细胞。 受试者中BRC治疗的有效性的评价
通过本说明书鉴定的ZNFN3A1的差异表达，可以监测BRC的治疗过 程。在该方法中，由接受BRC治疗的受试者提供受试细胞群体。必要时， 在不同时间点即治疗前、治疗中和/或治疗后由受试者获取受试细胞群体。 然后测定细胞群体中ZNFN3A1的表达，并与包含已知BRC状态的细胞的 参照细胞群体相比较。在本发明的上下文中，参照细胞未曾暴露于所关注 的治疗之中。
如果参照细胞群体不含有BRC细胞，那么受试细胞群体和参照细胞群 体中ZNFN3A1的表达的相似性表示所关注的治疗是有效的。而受试细胞群 体和正常对照参照细胞群体中ZNFN3A1表达的差异，表示临床效果或预后 较差。类似地，如果参照细胞群体含有BRC细胞，那么受试细胞群体和参 照细胞群体中ZNFN3A1表达之间的差异表示所关注的治疗是有效的，而受 试细胞群体和癌对照参照细胞群体中ZNFN3A1的表达的相似性则表示临 床效果或预后较差。
另夕卜，可将在治疗后取自受试者的生物样品中测定的ZNFN3A1的表达 水平(即治疗后的水平)与在开始治疗之前取自受试者的生物样品中测定的 ZNFN3A1的表达水平(即治疗前的水平)相比较。治疗后样品中表达水平降 低表示所关注的治疗是有效的，而治疗后样品中表达水平增加或维持不变 则表示临床效果或预后较差。
本说明书中，术语"有效的"表示治疗引起受试者体内病理性上调的基因 表达下降，病理性下调的基因表达上升或乳腺导管癌的大小、流行性(prevalence)或转移潜力降低。当预防性采取所关注的治疗时，术语"有效 的"指治疗能够延迟或防止乳房肿瘤的形成，或者能延迟、防止或减轻BRC 的临床症状。乳房肿瘤的评价可以按标准的临床方案进行。
此夕卜，可以与任何已知的诊断或治疗BRC的方法相关联来判别有效性。 例如，通过确定症状性异常可以进行BRC的诊断，所述症状性异常例如体 重减轻、腹痛、背痛、食欲减退、恶心、呕吐、全身不适、虚弱和黄症。 适于具体个体BRC治疗的治疗剂的选4奪
个体基因组成的差异可导致其代谢多种药物的相对能力出现差异。在 受试者体内代谢从而起到抗BRC剂作用的物质，可以通过在受试者的细胞 内诱导癌症状态特征性基因表达模式向非癌症状态特征性基因表达模式的 转变而显现出来。因此，通过本说明书公开的差异表达的ZNFN3A1，可以 在选定受试者来源的受试细胞群体中考察推定的具有治疗效果或预防效果 的BRC抑制剂，从而确定对所述受试者而言该物质是否是合适的BR(、抑 制剂。
为了鉴定出适用于具体受试者的BRC抑制剂，可将受试者来源的受试 细胞群体暴露于治疗剂，然后测定ZNFN3A1的表达。
在本发明的方法中，受试细胞群体含有表达ZNFN3A1的BRC细胞。 优选受试细胞是上皮细胞。例如，可以在存在候选物质的条件下保温受试 细胞群体，测定受试细胞群体的基因表达模式，并与一种或多种参照分布 图例如BRC参照表达分布图或包括ZNFN3Al的非BRC参照表达分布图进 行比较。
相对于含有BRC的参照细胞群体而言，受试细胞群体中ZNFN3A1的 表达下降，表示该物质具有发挥治疗作用的潜力。
在本发明的上下文中，受试物质可以是任何化合物或组合物"受试物 质例如包括但不限于免疫调节剂。 鉴定治疗剂的筛选试验
使用本说明书公开的差异表达的ZNFN3A1，可以鉴定用于治疗BRC 的候选治疗剂。本发明的方法包括筛选候选治疗剂，判断该候选治疗剂是 否能够将BRC状态特征性ZNFN3A1表达分布图转变非BRC状态特征性基 因表达模式。
在本方法中，将细胞暴露于一种或多种受试物质(依次或联合)，并测定
细胞中ZNFN3A1的表达。将在受试群体中测定的ZNFN3A1表达分布图与 在未暴露于受试物质的参照细胞群体中检出的ZNFN3A1的表达水平进行比较。
能够抑制ZNFN3A1这样的过表达基因的表达的物质具有临床价值。可 以在动物或接受试验的受试者中进 一 步测试该物质防止乳腺导管癌生长的 能力。
在另一个实施方案中，本发明提供筛选候选物质的方法，所述候选物 质是治疗BRC的潜在靶标。正如上文所详细讨论的，控制ZNFN3A1的表 达水平或其基因产物的活性，可以控制BRC的发生和发展。因此，釆用将 所述表达水平和活性用作癌或非癌状态指标的筛选方法，可以鉴定出起治 疗BRC的潜在靶标作用候选物质。在本发明中，所述筛选方法包括例如下 述步骤
a) 使受试化合物与多肽接触，所述多肽由ZNFN3A1的多核苷酸编码；
b) 检测所述多肽与受试化合物之间的结合活性；和
c) 选择与多肽结合的受试化合物。
a) 使候选化合物与细胞接触，所述细胞表达ZNFN3A1;和
b) 与在不存在该候选化合物的条件下检出的ZNFN3A1的表达水平相 比，选择降低ZNFN3A1的表达水平的候选化合物。
表达ZNFN3A1基因的细胞包括例如由BRC建立的细胞系；这样的细 胞可以用于本发明的上述筛选。
或者，本发明的筛选方法可包括下述步骤
a)使受试化合物与多肽接触，所述多肽由ZNFN3A1的多核苷酸编码； b^全测a)的多肽的生物活性；和
c) 与在不存在受试化合物时检出的生物活性相比，选择抑制由 ZNFN3A1的多核芬酸编码的多肽的生物活性的化合物。
可以使用ZNFN3A1的核苦酸序列，以重组蛋白质的形式获得可用于本 发明的筛选方法的蛋白质。基于与ZNFN3A1及其编码的蛋白质有关的信 息，本领域技术人员可以选择蛋白质的任何生物活性作为筛选指标，并可
此外，本发明的筛选方法还可以包括以下步骤
a) 使候选化合物与导入了载体的细胞接触，其中所述载体含有 ZNFN3A1的转录调控区及在该转录调控区的调控下表达的报告基因；
b) 测定所述报告基因的表达水平或活性；和
c) 与在不存在候选化合物时检出的^^艮告基因的表达水平或活性相比， 选择降低所述报告基因的表达水平或活性的候选化合物。
合适的报告基因和宿主细胞是本领域公知的。使用ZNFN3A1的转录调 控区可以制备适用于本发明的筛选方法的报告子构建体。当本领域技术人 员已知ZNFN3A1的转录调控区时，可以使用现有的序列信息来制备报告子 构建体。当ZNFN3A1的转录调控区未知时，可以基于ZNFN3A1的核苷酸 序列信息从基因组文库中分离含有转录调控区的核苷酸区段。
通过筛选分离的化合物可以成为药物开发的候选物，所述药物抑制 ZNFN3A1的表达或由ZNFN3A1编码的蛋白的活性，可以用于治疗或预防 BRC。
码的蛋白的活性的化合物的部分结构发生添加、缺失和/或取代而转变成的 化合物。
当将通过本发明的筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺 乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、羊、猪、牛、 猴子、狒狒、黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知 的药物制备方法配制成各种剂型。本发明的药物组合物和制剂及其制作和 使用方法将在下文中进一步描述。例如，根据需要，所述药物可以作为糖 衣片剂、胶嚢剂、酏剂和微胶嚢口服施用；或者用水或任何其它药物可接 受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如， 可以将化合物以一般接受的药物施用方式所需的单位剂型(unit dose)、与 药学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质包括但不限于无菌 水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、 赋形剂(excipient)、媒介物(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。根据这些制剂中有 效成分的含量，可以获得在指定范围内的合适的给药量。
能够混合到片剂和胶囊中的添加剂的例子包括但不限于粘合剂如明 胶、玉米淀粉、黄蓍胶(tragacanthgum)和阿拉伯胶，赋形剂例如结晶纤维素，
溶胀剂例如玉米淀粉、明胶和海藻酸(alginic acid)，润滑剂例如硬脂酸镁， 增甜剂例如蔗糖、乳糖或糖精，和调味剂例如薄荷(peppermint)、 G，w/〃犯/^7 t^e朋An'x油和樱冲兆。当单位剂型为胶嚢剂时，上述成分中还可以包括液体 载体，例如油。注射用无菌組合物可以^吏用^某介物例如注射用蒸馏水，4安 照标准的药物配制方式进行配制。
生理盐水、葡萄糖以及包含佐剂，如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇 和氯化钠的其它等渗液体，可用作注射用水溶液。这些可以与合适的增溶 剂组合使用，所述增溶剂例如一元醇例如乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙 二醇，非离子表面活性剂例如Polysorbate 80 (TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油是油质液体的实例，所述油质液体可以与苯曱酸千酯 或苯曱醇组合使用作为增溶剂，还可与緩沖液如磷酸盐緩沖液和乙酸钠緩 冲液、镇痛剂如盐酸普鲁卡因、稳定剂如笨曱醇和酚和/或抗氧化剂配制在 一起。制备的注射剂可以装入到合适的安瓿(ampoule)中。
可以利用本领域技术人员所公知的方法给患者施用本发明的药物组合 物，例如通过动脉内、,争脉内或经皮注射，以及鼻内、气管内、月几内或口 服给药施用于患者。施用剂量和方法根据患者的体重和年龄以及施用方法 而变化；不过，本领域技术人员能够按常规选择合适的施用方法。如果所 述化合物由DNA编码，可将该DNA插入到基因治疗载体中，并给患者施 用该载体以进行治疗。施用的剂量和方法因患者的体重、年龄和症状而异， 但是选择和优化这些参数在本领域技术人员的能力范围之内。
举例来说，当向标准成年人(体重60 kg)口服给药时，虽然根据其症状 存在一些差异，但与本发明的蛋白结合并调节其活性的化合物的剂量通常 为约0.1 mg-约100 mg每天，优选为约1.0 mg-约50 mg每天，更优选为约 1.0 mg-约20 mg每天。
当以注射剂形式向标准成年人(体重60 kg)非胃肠道给药时，虽然根据患 者、靶器官、症状和给药方法存在一些差异，但静脉内注射约O.()l mg-约30 mg每天，优选约O.l mg-约20mg每天，更优选约O.l mg-约10 mg每天的剂量 是合适的。而且，在其它动物的情况下，可以按60kg体重的标准常规换算 出合适的施用量。 患BRC的受试者的预后评估
本发明还提供评估患有BRC的受试者的预后情况的方法，所述方法包
括在将受试细胞群体中的ZNFN3A1的表达与一系列疾病阶段的患者来源 的参照细胞群体中的ZNFN3A1的表达相比较的步骤。通过比较受试细胞群 体与参照细胞群体中ZNFN3A1的基因表达，或比较受试者来源的受试细胞 群体的时间依赖基因表达模式，可以评估受试者的预后情况。
例如，与正常对照相比，ZNFN3A1的表达上升，表示预后不佳。相反 地，ZNFN3A1的表达与正常对照相似表示受试者预后较好。优选地，可以 通过比较ZNFN3A1的基因表达分布图来评估受试者的预后情况。 试剂盒
本发明还提供含有BRC检测试剂的用于检测乳腺癌的试剂盒，所述 BRC检测试剂例如能够特异性结合或鉴定ZNFN3A1核酸的核酸(诸如与 ZNFN3A1核酸的一部分互补的寡核普酸序列)，或者能够与由ZNFN3A1核 酸编码的蛋白结合的抗体。所述检测试剂可以以试剂盒的形式包装在一起。 例如，可以将检测试剂例如核酸或抗体(可与固体基质结合，或与使其同基 质结合的试剂分开包装)、对照试剂(阳性和/或阴性)和/或可检测标记，分别 包装在不同的容器中。试剂盒内还可以包括实施所述测定的说明(如书面说 明书、磁带、VCR、 CD-ROM等)。试剂盒的试验方式可以是本领域已知的 Northern杂交或夹心ELISA。
例如，可以将BRC检测试剂固定于固体基质如多孔条(porous strip)上， 以形成至少一个BRC检测位点。多孔条的测定区或检测区可以包括多个位 点，每个位点都含有一种核酸。测试条也可以含有阴性和/或阳性对照的位 点。或者，对照位点可以设置于与测试条不同的条上。任选地，不同的检 测位点可以含有不同量的固定化核酸，即第一个检测位点量较多，随后的 位点量较少。添加受试样品后，显示可测信号的位点数目提供了样品中存 在的BRC的量的定量指示(quantitative indication),检测位点的形状可以是 任何适宜的可检测的形状， 一般为跨越测试条宽度的条状或点状。 ^卩制BRC的方法
技术领域：
本发明还提供通过降低ZNFN3A1的表达(或其基因产物的活性)来治疗 或减轻受试者的BRC症状的方法。可以给患有BRC或存在BRC发病风险 (或对BRC易感)的受试者预防性或治疗性地施用适当的治疗化合物,.采用 标准的临床方法或者通过检测ZNFN3A1的异常表达水平或其基因产物的
异常活性，可以鉴定出上述受试者。在本发明中，适当的治疗剂包括例如 细胞周期调控和细胞增殖的抑制剂。
或者，本发明的治疗方法可包括如下步骤降低在乳房细胞中表达异 常升高的ZNFN3A1 ("上调"或"过表达"基因)的基因产物的表达和/或功能。 可以按照本领域已知的几种方法中的任何一种来抑制表达。例如，通过给 受试者施用能抑制或拮抗所述过表达基因的表达的核酸可以抑制表达，所 述核酸例如能够阻碍过表达基因的表达的反义寡核苷酸或小干扰RNA。 反义核酸和siRNA
如上所述，使用对应于ZNFN3A1的核苦酸序列的反义核酸，可以降4氐 基因的表达水平。对于BRC的治疗，对应于在BRC中上调的ZNFN3A1的 反义核酸是有用的。具体地说，本发明的反义核酸通过与ZNFN3A1的核苷 酸序列或与之对应的mRNA结合而发挥作用，从而抑制所述基因的转录或 翻译，促进mRNA降解和/或抑制由ZNFN3A1编码的蛋白质的表达，由此 抑制蛋白质的功能。如本说明书中使用的术语"反义核酸"包括与靶序列完全 互补的核苷酸和具有一个或多个核苷酸错配的核苷酸，只要该反义核酸能 与靶序列特异性杂交。例如，本发明的反义核酸包括那些在至少15个连续 核苷酸的范围(span)内，具有至少70%或更高、优选至少80%或更高、更优 选约至少卯％或更高、还更优选至少95%或更高的同源性的多核苷酸。所 述同源性可使用本领域已知的算法确定。
对于产生由ZNFN3A1编码的蛋白的细胞，本发明的反义核酸通过与编 码该蛋白的DNA或mRNA结合，从而抑制其转录或翻译，促进mRNA的 降解并抑制该蛋白质的表达而发挥作用，由此抑制该蛋白质的功能。
通过与合适的基质混合，可以将本发明的反义核酸制成外用制剂，如 搽剂(liniment)或泥敷剂(poultice),其中所述合适的基质对核酸是惰性的。
并且根据需要，通过添加赋形剂、等渗剂(isotonic agents)、增溶剂、稳 定剂、防腐剂、镇痛剂等，可以将本发明的反义核酸配制成例如片剂、粉 末、颗粒、胶囊、脂质体胶嚢、注射刑、溶液、滴鼻剂和冻干削。这些别 型可通过如下的公知方法制备。
给患者施用本发明的反义核酸，可以直接将其施于患处，也可以将其 注射入血管以4吏其到达患处。4吏用反义封固介质(antisense-mounting medium) 可以提高持久性和膜通透性。所述反义封固介质的例子包括但不限于脂质
体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染试剂(Lipofectine)或它们的衍 生物。
本发明的反义核酸衍生物的剂量，可以根据患者的状况适当调整，并 以所需的量使用。例如，可以施用的剂量范围为0.1至100mg/kg,优选O.l 至50 mg/kg。
本发明的反义核酸抑制本发明蛋白质的表达，因而可以用于抑制本发 明蛋白质的生物活性。此外，含有本发明的反义核酸的表达抑制剂也可以 用于抑制本发明的蛋白质的生物活性。
本发明的方法可以用于改变细胞中ZNFN3A1的表达(例如其因细胞的 恶性转化而上调)。在耙细胞中，siRNA与对应于ZNFN3A1的转录物结合， 导致细胞产生的蛋白质减少。
本发明的反义核酸包括经修饰的寡核苷酸。例如，使用硫代寡核苷酸 可以赋予寡核苦酸核酸酶抗性。
本说明书中，术语"siRNA"指能阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可以 采用将siRNA导入细胞的标准:技术，这其中包括以DNA为RNA转录的才莫 板的技术。在本发明的上下文中，siRNA含有针对ZNFN3Al等上调标记基 因的有义核酸序列和反义核酸序列。构建siRNA以使其单转录物具有靶基 因的有义序列和互补的反义序列，例如为发夹结构。
ZNFN3A1的siRNA与靶mRNA杂交，其结果是其与正常单链mRNA 转录物结合，并藉此阻碍翻译和进一步的蛋白质表达，从而减少或抑制由 ZNFN3A1编码的多肽的产生。因此，本发明的siRNA分子可以根据其在严 紧条件下与ZNFN3A1的mRNA特异性杂交的能力来定义。就本发明而言， 术语"杂交"或"特异性杂交"均是指2个核酸分子在"严紧的杂交条件"下杂交 的能力。本说明书中使用的短语"严紧的杂交条件"通常指如下条件该条 件下，在核酸的复杂混合物中，核酸分子与其靶序列杂交，但不与其它序 列发生可检测程度的杂交。严紧条件依赖于序列，并且因各种情况而异。 较长序列在较高温度下特异性杂交。关于核酸杂交的全面指南见于Tijssen,
尸ra6es， "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)。 一4殳地，选择的严紧条件为比在限定的离子强度、pll下指
定序列的热解链温度(Tm)低约5-10°C。
Tm是有50%的与靶标互补的探针在
平衡状态下与靶序列杂交(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)的温度(当
靶序列过量时，Tm温度下，有50%的探针在平衡状态下被占用)。此外，通
过添加去稳定剂如甲酰胺也可以形成严紧条件。对选择性或特异性的杂交
而言，阳性信号为背景的至少2倍，优选为背景杂交的10倍。示例性的严 紧杂交条件包括如下条件在50%曱酰胺、5x SSC、 1。/。SDS中于42。C保 温，或者在5x SSC、 1% SDS中于65°C保温，然后用0.2x SSC、 0.1% SDS 于50°C进4亍洗涤。
在本发明的上下文中，siRNA的长度优选为500、 200、 100、 50或25 个核苷酸或更短。更优选地，siRNA寡核苷酸的长度为约19-约25个核苷 酸。用于制备ZNFN3A1 siRNA的示例性核酸序列包括作为靶序列的Sl.':Q ID N0:1核苷酸序列。为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸"u"添加到 靶序列的反义链的3，端。待添加的"u"的数目为至少2,通常为2-10,优选 为2-5。添加的"u"在siRNA的反义链的3'端形成单链。
ZNFN3A1的siRNA,可以以能与mRNA转录物结合的形式直接导入细 胞。在这些实施方案中，本发明的siRNA分子一般如与反义分子相关的上 述描述进行修饰。而其它的修饰也是可能的，例如胆固醇偶联的siRNA显 示改善的药理学性质(Song等，A^/wreMW. 9:347-51 (2003))。或者，编 码siRNA的DNA也可以携带于载体中进行输送。
例如，可以这样制备载体，将ZNFN3A1靶序列以两条链均能表达(通 过DNA分子的转录)的形式克隆到表达载体中，该表达载体具有可搡作地 连接于该靶序列侧翼的调控序列(Lee, N.S.,等，(2002) Nature Biotechnology 20 : 500-5.)。相对于ZNFN3A1的mRNA的反义RNA分子由第一启动子(例 如所克隆DNA3，的启动子序列)转录，相对于ZNTFN3A1的mRNA的有义 RNA分子由第二启动子(例如所克隆DNA 5，的启动子序列)转录。所述有义 链和反义链在体内杂交，从而产生用于沉默对应于ZNFN3A1的siRNA构 建体。或者，可以利用两个构建体制备siRNA构建体的有义链和反义链。 克隆的ZNFN3A1可以编码具有发夹等二级结构的构建体，所述构建体的单 转录物既具有来自靶基因的有义序列又具有互补反义序列。
为了形成发夹环结构，可在有义序列和反义序列之间放置由任意核苷 酸序列组成的环序列(loop s叫uence)。因此，本发明还提供具有通式5'-[A]画[B]-[A，]-3，的siRNA(其中[A]为核糖核苷酸序列，其对应于与 ZNFN3A1的mRNA或cDNA特异性杂交的序列)。在优选的实施方式中， [A]为对应于ZNFN3A1的序列的核糖核苷酸序列，[B]为由3-23个核苷酸组 成的核糖核苦酸序列，[A，]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。[A] 区与[A，]杂交，然后形成由[B]区组成的环(loop)。所述环序列的长度优选为 3-23个核苦酸。所述环序列，例如可以选自如下序歹iJ(http:〃www,ambion.com/ techlib/tb/tb—506.html)。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供活性siRNA (Jacque, J.-M.,等，(2002) Nature 418: 435-8.)。
CCC, CCACC或CCACACC: Jacque, J.-M.，等，(2002) Nature 418: 435-8.
UUCG: Lee, N.S.,等，(2002) Nature Biotechnology 20: 500-5. Fmscoloni, P"Wfl/., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4): 1639-44.
UUCAAGAGA: Dykxhoorn, D. M"等，(2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4: 457-67.
因此，环序歹'j可以选自下纟且CCC, UUCG， CCACC, CCACACC和 UUCAAGAGA。优选的环序列是UUCAAGAGA (DNA中为"Ucaagaga"),,适 于在本发明的上下文中^吏用的例示性发夹siRNA包括 对于ZNFN3Al-siRNA(对于SEQ ID NO: 1的輩巴序列)
5，- aacaucuaccagcugaaggug-[b]-caccuucagcugguagauguu-3， (SEQ ID NO: 2)
和
5，- aacaucuaccagcugaaggug-[b]-caccuucagcugguagauguu-3， (SEQ ID NO: 3)
适当的 siRNA 的核苷酸序列可 <吏用乂人 Ambion 网站 (http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder, html)可4寻到的siRNA i殳 计计算机程序来设计。所述计算机程序基于如下规程选择核苷酸序列用于 siRNA合成。 选才奪siRNA把位点
1.从目标转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描，寻找A A 二核苷 酸序列。记录每个AA的出现及其3'侧邻近的19个核苷酸作为潜在的siRNA 耙位点。Tuschl等不推荐针对5'和3'非翻译区(UTRs)和邻近起始密码子的区 域(75个碱基之内)设计siRNA,因为上述区域可能富含调控蛋白结合位点。
UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰与siRNA内切核酸酶复合物的结 合。
2. 将所述潜在靶位点与人基因组数据库进行比较，不考虑与其它编码 序列显著同源的任何靶序列。可采用BLAST(可在如下网址找到，NCBI服 务器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行同源性搜索。
3. 选择合格的靶序列用于合成。在Ambion，可优选沿待评价的基因的 长度选择几个靶序列。
ZNPN3A1基因序列侧翼的调节序列可以相同也可以不同，但应能够独 立地、或者以时间性或空间性方式调控这些基因表达。通过将ZNFN3A1模 板分别克隆到载体上，siRNA得以在细胞内转录，其中所述栽体含有例如 来自小核RNA (snRNA) U6的RNA聚合酶III转录单元或人HI RNA启动 子。为了将载体导入细胞，可以使用转染增强剂(transfection-enhancing agent) 。 FuGENE (Rochediagnostices) ， Lipofectamin 2000 (Invitrogen)， Oligofectamin (Invi加gen)和Nucleofactor (Wako pure Chemical)可以用作转染 增强剂。
本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明的多肽的表达，因此可用 于抑制本发明的多肽的生物学活性。含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA 的表达抑制剂可用于在此处抑制本发明的多肽的生物学活性。因此，含有 本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗BRC。
此外，本发明提供抑制本发明的ZNFN3A1多肽的表达的核酶。通常， 核酶分为大核酶和小核酶。大核酶已知是切割核酸的磷酸酯键的酶。与大 核酶反应后，反应位点由5，-磷酸基团和3'-羟基基团组成。大核酶进一步分 为(l)催化鸟苷在5，-剪接位点的酯基转移作用的组I内含子RNA; (2)催化经 由套索样(lariat-like)结构经过两步反应自我剪接的组II内含子RNA;和(3) 通过水解在5'位点切割tRNA前体的核糖核酸酶P的RNA组件。另 一方面， 小核酶与大核酶相比更小(约40bp)，并且小核酶切割RNA产生5，-羟基和 2，-3，环状磷酸酯。锤头型(Hammerhead type)核酶(Koizumi M等，(1988) FEBS Lett 228: 228)和发夹型核酶(Buzayan, (1986) Nature 323: 349; Kikuchi Y and Sasaki N, (1991) Nucleic Acids Res 19: 6751)都包括在小核酶中。设计和构建 核酶的方法是本领域中已知的(见Koizumi M等，(1988) FEBS Lett 228: 228; Koizumi M等，(1989) Nucleic Acids Res 17: 7059; Kikuchi Y and Sasaki N，(1991)Nucleic Acids Res 19: 6751)。因而，抑制本发明的多肽的表达的核酶 也可以根据其序列信息(SEQ IDNO:4)和这些常M^方法来构建。
针对ZNFN3A1转录物的核酶，可抑制ZNFN3A1蛋白的过表达，并可 抑制该蛋白的生物活性。因此，这些核酶可以用于乳腺癌的治疗或预防。 抗体
此外，可以通过施用与基因产物结合或以其它方式抑制基因产物功能 的化合物，来抑制在BRC中过表达的ZNFN3A1的基因产物的活性或功能。 例如，所述化合物是与ZNFN3A1的基因产物结合的抗体。
本发明涉及抗体、特别是针对由ZNFN3A1编码的蛋白的抗体或所述抗 体的片段的用途。如在本说明书中使用的那样，术语"抗体"指一种具有特异 性结构的免疫球蛋白分子，其仅与用于合成该抗体的抗原(即上调标记的基 因产物)或与其紧密相关的抗原相互作用(即结合)。此外，抗体可以是抗体 片段或修饰的抗体，只要其可以结合由ZNFN3A1编码的蛋白。例如，所述 抗体片段可以是Fab、 F(ab，)2、 Fv或将来自H链和L《连的Fv片段通过合适 的接头连接而成的单链Fv (scFv) (Huston J. S.等，(1988) Proc. Natl, Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-83.)。更具体地，可以用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗 体以产生抗体片段。或者，还可以构建编码该抗体片段的基因，将其插入 合适的表达载体，并在适合的宿主细胞中表达(参见例如CoM. S.等，(1994) J. Immunol. 152:2968-76.; Better M. and Horwitz A. H. (1989) Methods Enzymol. 178:476-96.; Pluckthim A. and Skerra A. (1989) Methods Enzymol. 178:497-515,; Lamoyi E. (1986) Methods Enzymol. 121:652-63.; Rousseaux J, 等，(1986) Methods Enzymol. 121:663-9.; Bird R. E. and Walker B. (1991) W. Trends Biotechnol. 9:132-7.)。
抗体可以通过与各种分子如聚乙二醇(PEG)结合进行修饰。本发明提供 这样的修饰抗体。可通过将抗体进行化学修饰来获得修饰抗体。这些修饰 方法是本领域常规的。
可选的，抗体可包括具有源自非人抗体的可变区及源自人抗体的恒定 区的嵌合抗体，或者含有源自非人抗体的互补决定区(CDR)、源自人抗体的 框架区(FR)及恒定区的人源化抗体。所述抗体可利用已知技术制备,，人源化
例如VerhoeyenM等，(1988) Sc/e ce 239:1534-6)。因而，这样的人源化抗体
是嵌合抗体，其中基本上小于完整人可变结构域的区域已被来自非人物种 的相应序列取代。
除人框架区和恒定区外还包含人可变区的完整人抗体也是可以利用 的。这样的抗体可利用本领域已知的各种技术制备。例如，体外方法包括
使用在噬菌体上展示的人抗体片段的重组文库(例如，Hoogenboom & Winter, (1992) J. Mol. Biol. 227:381-8)。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入 转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，来制备 人抗体。该方法描述于例如美国专利Nos. 6,150,584; 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016。
可以将如上获得的抗体纯化至均质。例如，可根据用于普通蛋白质的 分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，通过适当选4奪和组合使用 柱层析如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和 等电聚焦电泳，可以分离抗体(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory), ^旦并不局限于此。蛋 白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如 Hyper D, POROS和Sepharose F.R (Pharmacia)。
除亲和层析外，例示性的层析包括例如离子交换层析、疏水层析、 凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak等，(19%) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。可以通过液相层析，如HPLC和FPLC 进行层析过程。
例如，可以采用吸光度测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶免疫测定 (EIA)、放射免疫测定(RIA)和/或免疫荧光检测来测定本发明抗体的抗原结 合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定在平板上，将本发明的多肽施加 到平板上，再施加含有所需抗体的样品(如产生抗体的细胞的培养上清液或 纯化的抗体)。然后施加用酶(如》咸性磷酸酶)标记的识别第一抗体的第二抗 体，并保温平板。接下来在洗涤后，在平板中加入酶底物如磷酸对硝基笨 酯，测定吸光度以评价样品的抗原结合活性。多肽的片段，如C-末端或N-末端片段可以用作抗原来评价抗体的结合活性。可以使用BIAcore (Pharmacia)评价本发明抗体的活性。
上述方法允许通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明的多肽的样 品，并检测或测定由抗体和多肽形成的免疫复合物，来检测或测定本发明
的ZNFN3A1多肽。
因为本发明所述的检测或测定多肽的方法可特异性地检测或测定多 肽，所以该方法可应用于使用多肽的各种实验。定向于癌细胞中发生的特 异性分子变化的癌症疗法已经通过下述抗癌药的临床开发和管理机构的批 准被认定为有效用于治疗晚期乳腺癌的曲妥单抗(trastuzumab) (Herceptin)，用于治疗慢性骨髓性白血病的曱磺酸伊马替尼(imatinib methylate) (Gleevec)，用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的gefitinib (Iressa)和 用于B细胞淋巴瘤和外膜细胞(mantle cell)淋巴瘤的美罗华(rituximab)(抗 CD20 mAb) (Ciardiello F.等，(2001) Clin Cancer Res.;7(10):2958-70. Review.; Slamon D丄等，(2001) N I':ngl J Med.;344( 11 ):783匿92.; Rehwald U.等，(2003) Blood.;101(2):420-4,; Fang G.et al.， (2000). Blood, 96, 2246-53.)。这些药物临 床上是有效的，并且比传统抗癌剂具有更好的耐受性，因为它们仅仅靶向 转化的细胞。因此，这些药物不仅改善了癌症患者的存活率和生活质量， 而且证明了分子靶向癌症疗法理念的合理性。另外，当靶向药物与标准化 疗组合使用时，可以增强标准化疗的效力(Gianni L. (2002). Oncology, 63 Suppll ， 47-56.; Klejman A.等，(2002) Oncogene, 21， 5868-76.)。因此，未来 的癌症治疗将很可能涉及常规药物与针对肿瘤细胞不同特性如血管生成 (angiogenesis)禾M曼袭力(invasiveness)的輩巴才示4寺异'l"生^式剂的耳关合4吏用。
这些调节方法可以回体(ct Wvo)、体外(例如通过在药剂的存在下培养细 胞)或体内(例如通过给受试者施用药剂)进行。所述方法包括作为抵制
蛋白质或蛋白质的组合、或者核酸分子或核酸分子的组合。
可以用拮抗(即降低或抑制)一种或多种过表达基因的活性的治疗剂来 治疗疾病和病症，所述疾病和病症的特4正在于基因和基因产物的表达水平 或生物学活性(相对于未患有疾病或病症的受试者)分别有所增加。可以治疗 性或预防性地施用拮抗所述活性的治疗剂。
因此，可以用于本发明上下文中的治疗剂包括例如(i)抗过表达基因或基 因产物的抗体；(ii)反义核酸或"功能障碍(dysfunctional)"的核酸(即，由于在 过表达基因的核酸内的异源插入所致)；(iii)小干扰RNA (siRNA);或(iv)调
节剂(即，改变过表达多肽与其结合配对物(binding partner)之间的相互作用 的抑制剂和拮抗剂)。功能障碍的反义分子被用于通过同源重组来"敲除"多 肽的内源性功能(见例如Capecchi MR， (1989) Science 244: 1288-92,)。
通过获取患者组织样品(例如从活检组织)，并在体外检测其RNA或肽水 平、表达的肽(或表达有所改变的基因的mRNA)的结构和/或活性，来定量肽 和/或RNA，从而可以容易地检测出水平的上升。本领域公知的方法包括但 不限于免疫测定法(例如在Western印迹分析、免疫沉淀后进行十二烷基磺酸 钠(SDS)聚丙歸酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)和/或检测mRNA表达的杂交 试验(例如Northern试验、点印迹、原位杂交等)。
预防性给药在出现疾病的明显临床症状之前进行，以阻止疾病或病症 的出现或者延迟其进程。
本发明的疗法可以包括使细胞与调节剂接触的步骤，所述调节剂可调 节一种或多种差异表达基因的基因产物的活性。蛋白质活性调节剂的例子 包括但不限于核酸、蛋白质、这些蛋白质的天然存在的同源配体 (naturally-occurring cognate ligands)、月太、月太才莫4以4勿牙口其它'J、分子。 针对BRC的接种(vaccinate)
本发明还涉及治疗或预防受试者中BRC的方法，该方法包括如下歩骤 对所述受试者施用疫苗，其中所述疫苗包含由ZNHN3A1的核酸编码的多 肽、该多肽的免疫活性片段或者编码该多肽或其片段的多核苷酸。施用所 述多肽在受试者中诱导抗肿瘤免疫。为了诱导抗肿瘤免疫，应给有需要的 受试者施用由ZNFN3A1的核酸编码的多肽、该多肽的免疫活性片l殳或者编 码该多肽或其片^^的多核苷酸。此外，由ZNFN3A1的核酸编码的多肽可以 针对BRC和IDC的侵袭(invasion)分别诱导抗肿瘤免疫。多肽或其免疫 活性片段可以用作针对BRC的疫苗。在一些情况下，蛋白质或其片段可以 以结合于T细胞受体(TCR)或由抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突细胞 (DC)、 B细胞呈递的形式进行施用。由于DC具有强抗原呈递能力，所以在 APC中使用DC是最优选的。
在本发明中，针对BRC的疫苗是指具有如下能力的物质将其接种于 动物后诱导抗肺瘤免疫。根据本发明，ZNFN3A1编码的多肽或其片段被认 为是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，其可诱导针对表达ZNHN3 A1
的BRC细胞的强力且特异的免疫反应。因此，本发明还包括使用多肽诱导
抗肿瘤免疫的方法。 一般而言，抗肿瘤免疫包括诸如以下的免疫应答
- 诱导抗肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，
- 诱导识别肿瘤的抗体，和
- 诱导抗肿瘤细胞因子的产生。
因此，当某蛋白质接种动物后诱导任一种所述免疫反应时，确定该蛋 白质具有抗肿瘤免疫诱导效果。由蛋白质诱导的抗肿瘤免疫可以通过在体
内或体外观察宿主中的免疫系统针对该蛋白质的应答而进行^r测。
例如，检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是公知的。具体地，进
胞。以抗原特异性方式应答于APC所呈递抗原的T细胞由于该抗原的刺激 而分化为细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞；CTL)，然后增殖(这称 为T细胞活化)。因此， 一些肽的CTL诱导可以通过将该肽经由APC呈递 于T细胞和检测CTL的诱导来进行评估。此外，APC具有激活CD4+ T细 胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，嗜酸粒细胞(eosin叩hil)和NK细胞的功效。 由于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞在抗肺瘤免疫中也是重要的，可使用这些 细胞的激活效应作为指标来评价肽的抗肺瘤免疫诱导作用。
使用树突细胞(DC)作为APC评价CTL诱导作用的方法在本领域中是 众所周知的。在APC中，DC是具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在 该方法中，首先使受试多肽与DC接触，然后使该DC与T细胞接触。在与 DC接触后，如果检测出具有针对目标细胞的细胞毒性作用的T细胞，则表 示该受试多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。CTL的抗肿瘤活性可以例 如采用51Cr标记的肿瘤细胞的溶解(lysis)作为指标来进行检测。或者，采用 3H-胸苦摄取活性或LDH (乳糖脱氢酶)释放作为指标来评价肿瘤细胞损伤程 度的方法也是众所周知的。
除DC外，外周血单个核细胞(PBMC)也可用作APC。已报道通过在存 在GM-CSF和IL-4的情况下培养PBMC来增强CTL的i秀导。相似地，已 显示通过在存在钥孔戚血蓝素(KLH)和IL-7的条件下培养PBMC来诱导 CTL。
可以认为通过这些方法确定为具有CTL诱导活性的受试多肽，是具有 DC激活效应和随后的CTL诱导活性的多肽。因此，it导针对肿瘤细胞的
CTL的多肽可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过与所述多肽接触而获得诱导 针对肿瘤的CTL的能力的APC也可用作抗肿瘤的疫苗。此外，通过APC 呈递多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗肿瘤的疫苗。利用由APC 和CTL产生的抗肺瘤免疫的这些肺瘤治疗方法称为细胞免疫疗法。
一般来说，当使用多肽用于细胞免疫疗法时，已知通过组合多种具有 不同结构的多肽并使其与DC接触来增加CTL诱导的效率。因此，当用蛋 白质片段刺激DC时，使用多种类型的片段的混合物是有利的。
可选地，多肽对抗肺瘤免疫的诱导可以通过观察针对肿瘤的抗体产生
的诱导来进行确认。例如，当用多肽免疫的试验动物中诱导产生抗该多肽 的抗体并且这些抗体抑制肺瘤细胞生长时，所述多肽可;f见为具有诱导抗肿
瘤免疫的能力。
施用本发明的疫苗可以诱导抗肿瘤免疫，而该抗肿瘤免疫的诱导能够 治疗和预防BRC。抗癌治疗或对癌症发病的预防可以包括任何下述步骤 诸如癌性细胞生长的抑制，癌症的退化(involution)以及癌发生的抑制。癌症 的治疗或预防还包括患有癌症的个体的死亡率和发病率降低、血液中肿瘤 标记物水平减少、癌症伴发的可检测症状的缓解等。所述治疗性和预防性 效果优选是统计学上显著的。例如，在观察中显著性水平为5%或更低，在 所述观察中将疫苗针对细胞增殖性疾病的治疗性或预防性效果与未施用疫 苗的对照进行比较。例如，可将Student's t-检验，Mann-Whitney U-检验或 ANOVA用于统计学分析。
上述具有免疫活性的蛋白质或编码该蛋白质的载体可与佐剂组合。佐 剂是指当与具有免疫活性的蛋白质共同(或相继)施用时能增强针对该蛋白 质的免疫应答的化合物。例示性的佐剂包括但不限于霍乱毒素(cholera toxin)、沙门氏菌毒素(salmonella toxin)、明石凡(al画)等。此外，本发明的疫 苗可适宜地与药物可接受的载体组合。这样的载体的例子包括但不限于无 菌水、生理盐水、磷酸緩冲液、培养液等。此外，疫苗可根据需要包含稳 定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂等。疫苗可全身或局部地进行施用。 疫苗施用可以通过单次给药进行，或者通过多次给药来强化(boost)。
当叶吏用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可以例如通过回体方法治疗 或预防肺瘤。更具体地，可以收集接受治疗或预防的受试者的PBMC，使 细胞与所述多肽在离体条件下接触，诱导APC或CTL，然后将该细胞施用
于受试者。也可通过将编码多肽的载体在离体条件下导入PBMC中来诱导 APC。体外诱导的APC或CTL可以在施用前进行克隆。通过克隆和培养具 有高靶细胞破坏活性的细胞，可以更有效地实施细胞免疫治疗。此外，以 该方式分离的APC和CTL不仅可以用于针对提供细胞的受试者进行细胞免 疫治疗，还可以用于针对来自其它个体的相似类型的肿瘤进行细胞免疫治 疗。
此外，本发明提供治疗或预防细胞增殖性疾病诸如癌症的药物组合物， 其包含药物有效量的本发明的多肽。该药物组合物可以用于提高抗肺瘤免疫。
用于抑制BRC或恶性BRC的药物组合物
本发明的上下文中，适宜的药物制剂包括适于口服、直肠、fr、局部(包 括口腔或舌下)、阴道或非消化道(包括肌内、皮下和静脉内)施用的制剂，
可以任选包装在独立的剂量单位(dosage unit)中。适于口服施用的药物制剂 包括但不限于胶嚢剂、扁嚢剂(cachet)或片剂，它们各含有一定量的活性 成分。适合的制剂还包括粉末、颗粒，溶液，悬浮液或乳液。活性成分可 以任选以大丸剂(bolus)、药糖剂(electuary)或糊剂(paste)的形式施用。用于口 服给药的片剂和胶嚢剂可含有常规赋形剂诸如结合剂、填充剂、润滑剂、 崩解剂和/或湿润剂。片剂可通过压缩或模制来制备，其中任选含有一种或 多种配方成分。压縮片剂可通过如下方法制备将活性成分以自由流动的 形式(如粉末或颗粒)任选地与结合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面 活性剂和/或分散剂混合，并在适当的机器中进行模制。模制片剂可通过如 下方法制备在适当的机器中对利用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的 混合物进行模制。所述片剂可根据本领域已知的方法进行包覆(coated)。 口 服液体制备物可以是例如水性或油性的悬浊液、溶液、乳液、糖浆或酏剂 的形式，或者也可以作为干燥产物提供，在使用前用水或其它适宜媒介物 调制。所述液体制备物可含有常规添加剂诸如悬浮剂，乳化剂，非水性媒 介物(可包括食用油)和/或防腐剂。片剂可选配制成緩释或控释其中的活性 成分的形式。有些情况下，片剂的包装中可以包含每月服用的一片药物。
适于非消化道施用的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，其中任 选地含有抗氧化剂、緩沖剂、抑菌剂(bacteriostat)和使得制剂与目标受体的
血液等张的(isotonic)溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其中含有悬浮 剂和/或增稠剂。所述制剂可以以单位剂量或多次剂量的形式保存在容器中， 例如可以装入密封的安瓿和小瓶；还可以以冷冻-干燥状态保存，这样仅需 要在使用前添加无菌液体载体例如生理盐水、注射用水即可。可选地，可 提供所述制剂用于连续输注。即配即用的注射溶液和悬浮液可由前述的无 菌粉末、颗粒及片剂的类型制备。
适于直肠给药的制剂中包括含有标准载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂 (suppository)。适于口内局部给药，例如口腔或舌下给药的制剂包括锭剂 (lozenge)和软锭剂(pastille)，其中锭剂在调味基质、如蔗糖和阿拉伯胶(acacia) 或黄蓍胶中包含活性成分，而软锭剂在基质、如明胶和甘油或蔗糖和阿拉 伯胶中包含活性成分。鼻内给药时，本发明的化合物可以作为液体喷雾剂、 可分散粉末，或以滴剂(drop)的形式使用。滴剂可用水性或非水性基质配制， 该基质中也含有 一种或多种分散剂、增溶剂和/或悬浮別。
吸入乡合药时，可以由吹入器、雾化器、气溶胶包装(pressurized pack)或 其它输送气溶胶喷雾的便利装置方便地输送化合物。气溶胶包装可含有适 宜的喷射剂，如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或 其它适宜气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供输送计量(metered amount)的阀门来确定剂量单位。
可选地，通过吸入或吹入给药时，化合物可以是干粉组合物的形式， 例如该化合物与适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可 以以单位剂型提供，这些剂型例如胶嚢、药筒(cartridge)、凝力交(gelatin)或发 泡包(blisterpack)，借助吸入器或吹入器，可由上述剂型施用所述4分末。
其它的制剂包含可释放治疗剂的可植入装置及粘性贴片(adhesive patches)。
需要时，可以采用适于緩释活性成分的上述制剂。药物组合物中还可 以含有其它活性成分，诸如抗微生物药物，免疫抑制剂和/或防腐剂。
应当理解除上述具体提及的成分外，本发明的制剂可含有本技术领域 对于所述制剂类型常用的其它试剂，例如适于口服给药的制剂可以含有调 味剂。
优选的单位剂量制剂如下述形式含有有效剂量或合适的部分有效剂量 的活性成分。
对于前述的各种情况，可以以约0.1-约250mg/kg每天的剂量范围口服 或通过注射施用所述组合物，例如多肽和有机化合物。成人的剂量范围通 常为约5 mg-约17.5 g/天，优选为约5 mg-约10 g/天，更优选为约100 mg-约 3 g/天。片剂或其它以分散单元提供的单位剂型可适宜地含有以这样的剂量 或者作为多个这样的剂量有效的量，例如含有约5mg-约500mg,更通常为 约100mg-约500 mg。
所用剂量依赖于多种因素，包括受试者的年龄和性别、治疗的确切疾 患及其严重程度。此外，给药途径也依赖于病症及其严重程度而变化。然 而无论怎样，本领域技术人员都能在考虑上述因素的基础上常规地计算出 合适的最佳剂量。
以下的实施例中将描述本发明的各个方面，但其并非意欲限制权利要 求书中所述的本发明的范围。以下的实施例，将对BRC细胞中差异表达的 基因的鉴定与表征进行说明。然而，与本说明书中的方法和材料类似或等 同的方法和材料均可用于实施或检验本发明。 实施例
BRC中ZNFN3A1表达的增强
使用cDNA微阵列对92例乳腺癌进行分析获得的全面基因表达分布图 数据表明将肿瘤/正常组织比例的截留值(cut-off)设置为大于2时，在 69例浸润性乳腺导管癌(IDC )中的36例，和1 1例原位乳腺导管癌(I)CIS ) 的6例中ZWFA04/表达上升(图la )。使用用于微阵列的cDNA进行半定 量RT-PCR,通过与正常乳腺导管细胞进行比较，在随机选取的12例IDC 的7例中证实了所述上升(图lb)。为了考察BRC组织中的ZNFN3A1蛋白 表达，从6例块状BRC组织及与其相应的非癌性乳房组织中提取蛋白，使 用这些蛋白进行了 western印迹分析。在6例肿瘤组织中一致确认了 ZNFN3A1的显著蓄积(图lc)。
在所有ZNFN3A1蛋白的western印迹分析中，均检测出大小为43kDa 和45kDa的2个条带(图lc),因此对这两种形式的蛋白做进一步研究。 提取物经磷酸酶处理，2个条带的强度均未见变化(数据未给出)。令人感 兴趣的是，当使用用野生型质粒转化的细胞的提取物进行western印迹分析 时，用抗ZNFN3A1抗体可以显示出2个条带(图2b，左，泳道1)，而用抗 Flag抗体只能显示出单一的45kDa条带(图2b，右，泳道l)。所述质粒表达在其氨基酸末端与Flag标签融合的野生型ZNFN3A1,因而推断较小的条带 为ZNFN3A1蛋白的切断型。因此，制备了表达各种缺失型ZNFN3A1的 ZNFN3A1质粒(图2a),采用western印迹分析对突变型蛋白进行了考察。 用抗ZNFN3A1 抗体处理不含氨基酸末端的缺失突变体 (p3xFlag-ZNFN3Al-A1,- A2,和-A3),显示出单一条带(Figure 2b,左)。该 数据与43kDa型的ZNFN3A1起因于密码子1和45之间的断裂的意见相符。
蛋白(p3xFlag-ZNFN3Al-A4和-厶5)的条带(图2b左)，因此该抗体应该是识 别位于密码子250和428之间的表位。
使用该抗体进行ZNFN3A1的免疫组织化学染色时，在考察的4个癌组 织中，在乳腺癌细胞中观察到强染色，而在基质细胞中未观察到染色(图3)。 ZNFN3A1 siRNA对BRC细胞的增殖抑制
为了测试抑制ZA^—W3/(/是否能够在BRC细胞中诱导细胞凋亡，使用 ZNFN3A1 siRNA-12(见WO2004/076623,其全部内容通过参考引入本说明 书)进行了细胞生存试验，所述ZNFN3A1 siRNA-12在结肠癌细胞和肝癌细 胞中可有效抑制ZiVFA047表达。在ZNFN3A1 siRNA表达载体的构建中使 用的寡核苷酸(对于SEQIDNO: 1的靶序列)如下 psiU6BX-ZNFN3Al-12，
GTAGATGTT-3' (SEQ ID NO; 2)，
TAGATGTT-3' (SEQ ID NO; 3)。
对10种BRC纟田胞系的western印迹分析表明在例如BT-20 、 HBL-100 、 MDA-MB-231、 MCF7和T47D纟田月包等8种BRC细月包中，ZN''N3A1大量 表达(图4a)。用psiU6BX-ZNFN3Al-12、 psiU6-萤光素酶(psiU6-Luciferase ) 或psiU6 (模拟)转染MDA-MB-231、 MCF7和T47D细胞，并与适宜浓度 的G418共培养，用细胞计数试剂盒分析了细胞生存力。其结果，与psiU6BX-萤光素酶或psiU6BX-模拟相比，psiU6BX-ZNFN3A1-12在3种细胞株中显 示显著的增殖抑制效果(图4b)。因而，可以认为抑制ZNFN3A1是治疗BRC. 的合理策略。 工业实用小生
本说明书所述的BRC的基因表达分析是通过激光捕获切割 (laser-capture dissection)和全基因组cDNA微阵列的组合而获得的，其鉴定 了特异性基因ZNFN3A1作为预防和治疗癌症的靶标。基于这个差异表达的 基因的表达，本发明提供用于鉴定和检测BRC的分子诊断标记。
本说明书中所述的方法还用于鉴定其它用来预防、诊断和治疗BRC的 分子靶标。本发明中报导的数据增加了对BRC的全面理解，促进新型诊断 策略的开发，提供用于鉴定治疗药和预防剂的分子靶标的线索。这样的信 息有助于对乳房肺瘤发生的更深的理解，为开发用于诊断、治疗和最终预 防BRC的新策略提供了启示。
另外，尽管已经详细地并且参考本发明的具体实施方案描述了本发明， 但可理解的是上述说明书实际上是例示性和解释性的，意欲阐明本发明及 其优选实施方案。通过常规的实验，本领域技术人员将容易地认识到，可 对本发明进行各种变化和修饰而不背离本发明的精神和范围。因此，本发 明并不意欲受到上述说明的限定，而应由所附的权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.一种诊断受试者中乳腺癌或发展为乳腺癌倾向性的方法，该方法包括测定源自患者的生物样品中ZNFN3A1的表达水平，其中与该基因的正常对照水平相比、该样品的表达水平上升表示该受试者患有乳腺癌或存在罹患乳腺癌的风险。
2. 权利要求l的方法，其中与所述正常对照水平相比、所述样品的表 达水平至少高10%。
3. 权利要求l的方法，其采用选自如下的方法测定基因的表达水平 (a)才企测ZNFN3A1的m脂A,(b )检测由ZNFN3A1编码的蛋白质，和(c) 4全测由ZNFN3A1编码的蛋白质的生物活性。
4. 权利要求1的方法，其中所述源自患者的生物样品包括上皮细胞。
5. 权利要求1的方法，其中所述源自患者的生物样品包括孔腺癌细胞。
6. 权利要求1的方法，其中所述源自患者的生物样品包括源自乳腺癌 细胞的上皮细胞。
7. —种筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括以 下步骤a) 使受试化合物与多肽接触，其中所述多肽由ZNFN3A1的多核苷酸 编码；b) 检测多肽与受试化合物之间的结合活性；和c) 选择与所述多肽结合的受试化合物。
8. —种筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括以 下步骤a) 使候选化合物与表达ZNFN3A1的细胞接触；和b) 选出这样的候选化合物，其中，与不存在该候选化合物时检出的 ZNFN3A1的表达水平相比，该候选化合物降低ZNFN3A1的表达水平。
9. 权利要求8的方法，其中所述细胞包括乳腺癌细胞。
10. —种筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括以 下步骤 a) 使受试化合物与多肽接触，其中所述多肽由ZNFN3A1的多核苷酸 编码；b) 检测步骤a)的多肽的生物活性；和c) 选出这样的受试化合物，其中，与不存在该受试化合物时检出的该 多肽的生物活性相比，该受试化合物抑制步骤a)的所述多肽的生物活'f生。
11. 一种筛选用于治疗或预防乳腺癌的化合物的方法，所述方法包括以 下步骤a) 使候选化合物与导入了载体的细胞接触，其中所述载体含有 ZNFN3A1的转录调控区及在该转录调控区的调控下表达的报告基因；b) 测定所述报告基因的表达水平或活性；和c) 选择这样的候选化合物，该候选化合物降低所述报告基因的表达水 平或活性。
12. 用于乳腺癌检测的试剂盒，其含有与(a) ZNFN3A1或者(b)由 ZNFN3A1编码的多肽结合的检测试剂。
13. —种治疗或预防受试者中乳腺癌的方法，其包括对所述受试者施用 反义组合物，该反义组合物包含与ZNFN3A1的编码序列互补的核芬酸序 列。
14. 一种治疗或预防受试者中乳腺癌的方法，其包括对所述受试者施用 siRNA组合物，该siRNA组合物降低ZNFN3A1的表达。
15. 权利要求14的方法，其中，所述siRNA包含含有SEQIDNO: 1的 核苷酸序列的有义链。
16. 权利要求15的方法，其中，所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，， 上式中[A] 为对应于SEQIDNO: 1的序列的核糖核苦酸序列，[B] 为由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸环序列， [A，]为由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。
17. —种治疗或预防乳腺癌的方法，所述方法包括给所述受试者施用药 物有效量的抗体或其免疫学活性片段的步骤，其中所述抗体或其免疫学活 性片段与ZNFN3A1的蛋白质结合。
18. —种治疗或预防受试者中乳腺癌的方法，其包括对所述受试者施用 疫苗，该疫苗包含选自如下的至少一种(1 )由ZNFN3A1的核酸编码的多肽；(2) 所述多肽的免疫学活性片段；或(3) 编码所述多肽的多核苷酸。
19. 一种诱导抗肺瘤免疫的方法，所述方法包括如下步骤使由 ZNFN3A1编码的多肽、ZNFN3A1多核苷酸或含有ZNFN3A1多核苦酸的载 体与抗原呈递细胞接触。
20. 权利要求19的诱导抗肺瘤免疫的方法，其进一步包括对受试者施 用所述抗原呈递细胞的步骤。
21. —种治疗或预防受试者中乳腺癌的方法，所述方法包括施用根据权 利要求7-11中任一项的方法获得的化合物的步骤。
22. —种治疗或预防乳腺癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的针 对ZNFN3A1的多核苷酸的反义多核苷酸或siRNA。
23. 权利要求22的组合物，其中，所述siRNA包含含有SEQ ID NO: 1 的核苷酸序列的有义链。
24. 权利要求23的组合物，其中，所述siRNA具有通式 5，-[A]-[B]-[A，]-3，，上式中[A] 为对应于SEQ ID NO: 1的序列的核糖核苷酸序列，[B] 为由3-23个核芬酸组成的核糖核苷酸环序列， [A，]为由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。
25. —种治疗或预防乳腺癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的抗 体或其免疫学活性片段，其中所述抗体或其免疫学活性片段与由ZNFN3A1 编码的蛋白结合。
26. —种治疗或预防乳腺癌的组合物，所述组合物含有药物有效量的通 过权利要求7-11中任一项的方法选择的化合物作为有效成分，和药物可接 受的载体。
全文摘要
本说明书中记载了检测和诊断乳腺癌(BRC)的客观方法。本发明还提供治疗、预防乳腺癌和乳腺癌转移的方法，以及评价乳腺癌受试者的预后和乳腺癌治疗的有效性的方法。在一类实施方式中，本发明的诊断方法包括测定ZNFN3A1的表达水平，在乳腺癌中，ZNFN3A1的表达显著上升，因此其可用于识别BRC细胞和正常细胞。本发明还进一步提供用于BRC治疗的治疗剂的筛选方法、治疗BRC的方法和为受试者接种BRC疫苗的方法。
文档编号C12Q1/68GK101189346SQ20068001458
公开日2008年5月28日 申请日期2006年2月9日 优先权日2005年2月28日
发明者中村佑辅, 中鹤修一, 古川洋一 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司;国立大学法人东京大学