专利名称：用于修复上皮和其它细胞及组织的方法和组合物的制作方法
用于修复上皮和其它细胞及组织的方法和组合物发明领域本发明涉及组织修复，更具体地讲是涉及使用在TVEMF生物 反应器中制备的血液干细胞修复皮肤、口和内耳组织以及其它包含 上皮细胞的组织，还涉及该制备方法、其组合物以及使用所述细胞 或组合物治疗哺乳动物的方法。发明背景哺乳动物、尤其人类组织的再生长期以来一直是医学界的愿望。 迄今为止，人体组织的修复大部分是依靠移植来自供体的相似组织 来实现。组织移植基本上是以自Herrick双胞胎中一个到另一个的 肾脏移植开始的，后来，南非医生Christian Barnard在1967年12 月3日将Denise Darval的心脏移植给Louis Washkansky，这4吏得这 一技术举世闻名，从此组织移植成为了用于延长晚期病人寿命的广 泛接受的方法。人体组织移植从其最初应用开始就遇到了重大问题，主要是由 于身体的天然免疫系统而产生的组织排斥。这经常造成应用组织移 植仅能延长非常有限的寿命(Washkansky手术后只活了 18天)。为了克服身体免疫系统的问题，很快开发出了许多抗排斥药(比 如Imuran、环孢霉素)以抑制免疫系统并因此延长组织在排斥之前 的应用。但是，排斥问题仍然产生了对组织移植替代方法的需求。骨髓移植也已用于修复某些组织如骨髓，并且仍是治疗一些疾 病如白血病的优选疗法，但是骨髄移植也存在问题。它需M体匹 配(能找到的情况低于50%);它会引起疼痛，且昂贵并具有风险。 因此，非常希望得到骨髓移植的替代方法。组织干细胞的移植比如 在美国专利No. 6，129，911中的肝脏干细胞移植也有类似的局限性， 使得它们的广泛应用存在疑问。近年来，研究人员使用多能性胚胎干细胞作为组织移植的替代 方案进行了实验。使用胚胎干细胞所基于的理论是它们在理论上能
够用于再生身体内几乎任何组织。然而，胚胎干细胞在组织再生上 的应用也遇到了问题。在这些问题中较为严重的有，所移植的胚胎 干细胞的可控性有限，它们有时生长成为肺瘤，并且可用于研究的人胚胎干细胞将受到患者免疫系统的排斥(Nature, June 17, 2002: Pearson, "Stem Cell Hopes Double", news@imturc.com, published online: 21 June 2002 )。另夕卜，胚胎干细胞的广泛应用还负担了伦理、 道德和政治因素，使得其广泛应用仍然存在疑问。修复包含上皮细胞的组织是特别期望的。上皮细胞包^^覆盖在 哺乳动物整个身体表面(皮肤)上的上皮组织。甚至口腔的覆膜也 包含上皮细胞，并与多种其它组织和细胞类型相互关联。这些细胞 支持牙齿，帮助产生唾液或者有助于其它口腔功能。并且， 一些上 皮细胞特化成为感受器，比如内耳上皮毛细胞。皮肤、口和耳对于 哺乳动物的存活和健康生活以及感觉感知是至关重要的。因此，口和皮肤组织的修复和再生已经通过使用抗生素和其它 产品的治疗来实现，其通过防止损伤部位感染来促进愈合，这些损 伤对于口组织来说主要来自于手术。但是，这些方法不显著降低身 体通过使用其自身修复系统修复组织所花费的时间。听觉损伤在哺乳动物中通常是普遍的，是影响数百万人的严重 残障。听觉损伤可由多种原因引起，包括感染、机械损伤、巨响、 衰老以及化学品诱导的耳毒性，其损伤神经元和/或外周听觉系统的 毛细胞。外周听觉系统由听觉感受器、柯蒂氏器中的毛细胞以及主 要听觉神经元(耳蜗中的螺旋神经节神经元)组成。外周听觉系统 的损伤是大部分听觉缺损的原因。螺旋神经节神经元("SGN，，)是主要的传入听觉神经元，将信 号从外周听觉感受器(柯蒂氏器中的毛细胞)通过耳蜗神经传递到 脑。第八神经将螺旋神经节中的主要听觉神经元与脑干连接起来。 第八神经还将前庭神经节神经元("VGN，，)与脑干连接起来，前庭 神经节神经元是负责平衡的主要传入感觉神经元，并且将来自内耳 椭圆嚢、球嚢和壶腹的信号传递到脑。螺旋神经节中主要传入神经 元的破坏已被归结为听觉损伤的主要原因。另外，沿着从外耳道到中枢神经系统的听觉通路中任何地方的
损伤都可导致听觉丧失。听觉器官可分为外耳和中耳、内耳以及听 觉神经和中枢听觉通路。尽管在物种之间有一些变化，但一般特征 对所有哺乳动物来说都是共同的。听觉刺激通过外耳道、鼓膜和听 骨链机械传递到内耳。中耳和乳突正常情况下充满空气。外耳和中 耳疾病通常通过干扰这种机械传递而产生传导性听觉丧失。传导性 听觉丧失的常见原因包括外耳道阻塞，例如可由外耳道闭锁或耵聍造成；鼓膜增厚或穿孔，例如可由外伤或感染造成；听骨链成员的 固定或吸收；以及咽鼓管阻塞造成的中耳空间中积液。听觉信息通过神经上皮细胞(毛细胞)和内耳中SGN的作用由 M信号转换成神经传导的电脉冲。所有SGN的中央纤维在脑桥脑 干的耳蜗核中形成突触。来自耳蜗核的听觉投射是双侧性的 (bilateral),主要神经核位于下丘、丘脑的内侧膝状体以及颞叶的 听觉皮层中。涉及听觉的神经元数量从耳蜗到听觉脑干和听觉皮层 显著增加。所有听觉信息通过有限数量的毛细胞进行转换，其中数 量较少的所谓内毛细胞是至关重要的，因为它们形成约90%主要听 觉神经元的突触。比较而言，在耳蜗核的水平上，所涉及的神经元 数目以十万计。因此，听外周(auditory periphery)中相对少量毛 细胞的损伤即可导致显著的听觉丧失。因此，许多感觉神经丧失的 原因都可归结为内耳损伤。这种类型的听觉丧失可以是渐进性的。另外，随着动物的衰老，由于耳解剖学的改变，听觉的敏锐性显著 降低。在胚胎发生过程中，前庭神经节、螺旋神经节以及听囊来源于 相同的神经发生外胚层一一听板。因此，前庭和听觉系统共有许多 特征，包括毛细胞的外周神经元神经分布以及到脑干核的中心投射。 这些系统都对于耳毒素敏感，耳毒素包含治疗性药物、抗肿瘤剂、 食物或药物中的污染物以及环境和工业污染物。耳毒性药物包括广 泛使用的化学治疗剂顺铂(cisplatin)及其类似物，"fi4使用的M 糖苷类抗生素例如用于治疗革兰氏阴性菌引起的感染的庆大霉素， 奎宁及其类似物，水杨酸盐及其类似物和袢利尿药。这些药物对听觉细胞和螺旋神经节神经元的毒效应经常是其治 疗有用性的限制因素。例如，抗菌性^IU^t苷类例如庆大霉素、链 霉素、卡那霉素、妥布霉素等已知具有严重的毒性，尤其是耳毒性
和肾毒性，所述毒性降低了这些抗微生物剂的有用性。@緣苷类 抗生素一般用作广镨抗微生物剂，其有效针对例如革兰氏阳性、革兰氏阴性和抗酸性菌。敏感微生物包含埃希氏菌属(Escherichia spp.)、嗜血扦菌属(Hemophilus spp.)、李斯特菌属(Listeria spp.)、 假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)、耳卩 尔森氏菌属(Yersinia spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、肠杆 菌属 (Enterbacter spp. ) 、 Lalmonella spp.、 葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、分枝杆菌 属(Mycobacteria spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)和沙雷氏菌属(Serratia spp.)。尽管如此，但^Jj瞎苷类主要用于治疗革兰氏阴 性菌引起的感染，例如，与青霉素联合使用以实现协同效应。如该 家族的通用名所指出，所有的^J^糖苷类抗生素都含有以糖苷连接中耳炎是用于描述中耳感染的术语，中耳感染是非常普遍的， 尤其是在儿童中。就中耳感染而言， 一般以例如应答或预防方式全 身性施用抗生素。全身性施用抗生素以对抗中耳感染一般使在中耳 中达到治疗水平的滞后时间延长，并且需要高初始剂量以达到这样 的水平。这些缺陷4吏获得治疗水平的能力复杂化，并且可能妨碍将 一些抗生素一起应用。全身性施用在感染达到晚期时经常是4W效 的，但此时可能已经对中耳和内耳结构造成了永久性损伤。显然， 耳毒性是抗生素施用的剂量限制性副作用。例如，在60到120天中每天给予2克链霉素的患者中有近75% 显示出某种前庭损伤，而在每天给予1克时，发生率降为25% (美 国专利No.5，059,591)。观察到了听觉损伤每天接受1克，持续时 间超过一周的患者中，有4%到15%发生可测量的听觉丧失，其慢 慢恶化，并且如果治疗继续可能导致完全的永久性耳聋。耳毒性也 是顺铂的严重剂量限制性副作用，顺铂是一种铂配位^物，已证 明对多种人类癌症有效，包括睾丸癌、卵巢癌、膀胱癌、以及头和 颈癌。顺铂损伤听觉和前庭系统。由于其抗炎、止痛、抗发热以及 抗血栓效应，7jc杨酸类(例如阿司匹林)是最常用的的治疗性药物。 不幸的是，它们具有耳毒性副作用。它们常引起耳鸣("耳中的鸣响") 和暂时性听觉丧失。但是，如果所述药物在更长的时间中以高剂量
使用，听觉损伤可能变成持久且不可逆的。因此，存在对于预防、 降低或治疗内耳疾病和听觉损伤的发生率和/或严重性的手段的需 求，所述听觉损伤涉及内耳组织尤其是内耳毛细胞以及任选的相关 听觉神经。特别有意义的是作为耳毒性治疗药物的有害副作用出现 的病症，所述耳毒性治疗药物包含顺铂及其类似物、^J4t普类抗 生素、水杨酸盐及其类似物或袢利尿药。所需的是再生内耳毛细胞以恢复听觉的方法。本发明4C供了实现这些目的和其它目的的方法。 干细胞的多能性特点首先在骨髓中得到的成体干细胞中发现。Verfaille, C.M. et al" Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. 7V ftire 417， published online 20 June; doi: 10.1038/nature00900， (2002) cited by Pearson, H. Stem cell hopes double, ncws@naturc.com, published online: 21 June 2002; doi: 10.1038/news020617-ll。Boyse et al.，美国专利No. 6，569，427 Bl公开了低温^!"以及低 温保存的胎儿和新生儿血液可用于治疗或预防多种疾病与病症如贫 血、恶性肿瘤、自身免疫病和多种免疫功能障碍及缺陷。Boyse还7^ 开了使用异源基因序列的造血重建在基因治疗中的应用。但是， Boyse的公开缺乏用于治疗应用的细胞扩增。胯带血库CorCell提供 了对胯带血干细胞扩增、低温保存和移植的统计。"Expansion of Umbilical Cord Blood Stem Cells", Information Sheet Umbilical Cord Blood, CorCell， Inc. (2003). —种扩增方法7>开了4吏用一种生 物反应器，所述生物反应器具有位于中央的基于胶原蛋白的基质。 Research Center Julich: Blood Stem Cells from the Bioreactor. Press release May 17， 2001。在本申请中，术语"外周血，，指在哺乳动物中全身循环或已经循 环的血。术语"外周血细胞，，指可见于外周血中的细胞。尽管成体干细胞可见于多种成熟组织，但其数量较少且更难以 定位。取自哺乳动物时， 一般将外周血抽进一个或多个注射器中，所 述注射器中优选含有抗凝血剂。脐带血优选在出生后以本领域乂i^P 的方式直接取得。可将所^保存在注射器中或者转移到另一容器
中。接着可将所述血分离成其各个部分白细胞、红细胞和血浆。 这在离心机(旋转血容器直至血分离的装置)中实现或通过沉降(将 沉淀物注入血容器中以使血分离的过程)实现。其次，一^S-i6l液被 分离，红细胞(RBC)在底部，白细胞(WBC)在中间，血浆在顶 部，则将白细胞移出用于保存。中间层也称为"血沉棕黄层"，含有 目的血液干细胞；血的其它部分是不需要的。就一些库而言，这就 将是它们处理的范围。但是，其它库会通it^WBC中移出单核细 胞(在此情况下是白细胞的一个亚群)来继续处理血沉棕黄层。尽 管不是所有人都赞同此方法，但其保存的较少，保存细胞所需的低 温氮也较少。处理血液的另一种方法是在分离器比如Cobe Spectra细胞分离 器中对所有收集到的血进行一轮或多轮(优选三轮)连续的流式白 细胞分离术。这一方法将具有一个细胞核的血细胞从其它血细胞中 分离出来。干细胞是具有一个细胞核的组中的一部分。优选地，从血液样品中移除红细胞。尽管人们可能具有相同的 HLA型(是干细胞移植所需的)，但其也可能具有不同的血型。通 过移除RBC可以使对干细胞移植的有害反应最小化。因此，通过除 去RBC，干细胞样品更有可能与更多的A^目容。RBC还可能在融化 时破裂，释放出游离的血红蛋白。这种类型的血红蛋白可严重影响 接受移植者的肾脏。另外，当RBC破裂时，干细胞的生存力降低。同时，尤其是在低温保存血或将血转移至另一哺乳动物时，可 以检测血以确保不存在传染病或遗传性疾病，比如HIV/AIDS、肝炎、 白血病或免疫疾病。如果存在这些疾病，则可弃用所述血，或在指 出未来使用者需要考虑的相关风险后使用。因此，需要提供修复人体组织的方法和过程，其不基于器官移 植、骨髓移植或者胚胎干细胞，而是提供不太可能引起免疫应答扩 增的干细胞组合物，以在数天内应用。更优选地，需要提供再生内 耳毛细胞以修复听觉的方法和过程；修复口组织的方法及其过程； 以及修复皮肤组织的方法及其过程。本发明提供了实现这些目的及 其它目的的方法和过程。发明概述
本发明涉及修复、再生、补充上皮细胞或组织和/或皮肤、口和 内耳的其他相关组织的方法。具体地，本发明针对^"复以下组织的方法受到损伤或擦伤的皮肤组织、接受口腔手术(优选牙龈手术) 的口组织、受到听觉损伤(例如由于药物耳毒性、自然听觉丧失或 巨响造成)的内耳组织。用于治疗患有皮肤、口和/或耳病症的哺乳 动物(优选人)的本发明方法包括将治疗有效量的血来源的经扩增 成体干细胞引入所述哺乳动物，所述经扩增干细胞每单位体积的细 胞数量已被扩增为其来源血中每单位体积的细胞数量的至少七倍， 其中TVEMF扩增的干细胞保持其三维几何结构(geometry)及其 细胞-细胞支持(cell-to-cell support)和细胞-细胞几何结构 (cell-to-cell geometry)。所述方法包括在足以允许人体系统利用所 ^细胞有效<务复受损组织的时间中进行这样的引入。本发明还部分涉及来自哺乳动物优选人的血液干细胞，优选其 中所述血液干细胞是TVEMF扩增的。本发明还涉及来自哺乳动物 优逸人的经TVEMF扩增的血液干细胞，其中所i^jfe液干细胞在单 位体积的数量上是其来源材料(例如TVEMF扩增之前干细胞的血 来源)的至少7倍；并且其中血液干细胞具有与天然存在的(即来 源的)血液中干细胞基^目同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及 细胞-细胞几何结构。本发明还涉及用于治疗皮肤、口或耳疾病的 包含这些细胞的组合物，其按照需要添加其它成分，包括可药用栽 体、低温保存剂和细胞培养基。本发明还涉及通过以下步骤制备用于治疗皮肤、口和耳疾病的 干细胞和干细胞组合物的方法将血混合物置于TVEMF生物反应 器的培养室中，在TVEMF生物反应器中对血混合物施加TVEMF, 以及TVEMF扩增血液干细胞以制备经TVEMF扩增的血液干细胞 和干细胞组合物。优选地，施加在细胞上的TVEMF为约0.05高斯 到约6.0高斯。本发明还涉及通过以下步骤低温保存所述经扩增干细 胞的方法将其温度降低至-120'C到-196。C并持续一年或更长，之后 将温度升高到适于将所述细胞引入哺乳动物的温度。本文也包含了本发明组合物用于治疗对这种治疗有需要的口 、 耳和/或皮肤，或者用于制备用于上述治疗的药剂的用途。附图简述 附图中，图1以示意图方式举例说明了生物反应器的培养栽体流动回^flow loop)的一个优选实施方案；图2是本发明的TVEMF生物反应器的一个优选实施方案的侧视图；图3是图2的TVEMF生物>^应器的一个优选实施方案的侧面投影 图；图4是TVEMF生物反应器的一个优选实施方案的俯视截面图； 图5是TVEMF生物M器的俯,截面图；图6是随时间变化电磁力装置的侧视图，该装置能容纳生物JML器 并向生物反应器提供随时间变化的电磁力；图7是图6所示装置的前视图；图8是图6所示装置的前视图，进一步显示其中的生物^"应器。附图详述用最简单的话来说，旋转式TVEMF生物反应器包含细胞培养 腔室和随时间变化的电磁力源。在运行中，血混合物被置于细胞培 养腔室中。细胞培养腔室旋转一段时间，在此期间，随时间变化电 磁力源在腔室内产生随时间变化的电磁力。在该期间结束时，将 TVEMF扩增的血混合物从腔室移出。在较复杂的TVEMF生物反 应器系统中，随时间变化电磁力源可以集成到TVEMF生物反应器， 如图2-5所示，但是也可与生物反应器相邻，如在图6-8中。另外， 向细胞提供支持的流体载体如培养基或緩冲液(优选与下文讨论的 加入血混合物的培养勤目似)可以周期性更新和移出。本文描述优 选的TVEMF生物>^应器。现在参看图1，其展示了在一个完整的用于培养哺乳动物细胞的 生物反应器培养系统中培养载体流程1的一个优选实施方案，所述 生物反应器培养系统带有细胞培养腔室19,优选旋转式细胞培养腔 室，充氧器21，辅助培养载体定向流动的装置，优选通过4吏用主泵 15，以及供应多支管17,其选择性输入这种培养载体需求，例如但 不限于营养物3、緩冲剂5、新鲜培养基7、细胞因子9、生长因子 11以及激素13。在此优选实施方案中，主泵15提供新鲜流体载体 到充氧器21，流体载体在此被充入氧气并且通过细胞培养腔室19。 来自细胞培养腔室19的已使用流体栽体中的废物被移去并传送到废 物18，剩下的细胞培养载体返回到多支管17，必要时它在此接受新 鲜补充，之后使用泵15通过充氧器21循环到细胞培养腔室19。在培养载体流程i中，培养载体通过腔室19中的活细胞培养物 并且围绕如图1所示的培养载体流动回路1循环。在此回路1中， 根据化学传感器(未显示)进行调节，以维持细胞培养反应器腔室 19中的恒定^Hf。控制二氧化M力并引入酸或碱以校正pH值。 氧气、氮气和二氧化碳溶解在气体交换系统(未显示)中，以支持 细胞呼吸。闭合回路1添加氧气，并从循环气体容量中移去二氧化 碳。尽管图1是可用于本发明的培养载体流动回路的一个优选实施 方案，但是本发明并不限于此。可以手动、自动或者通过其他控制 手段向生物反应器输入培养载体例如但不限于氧气、营养物、緩冲 剂、新鲜培养基、细胞因子、生长因子和激素，比如可以类似于废 物和二氧化碳的控制和移除。图2和3展示了带有集成的随时间变化电磁力源的TVEMF生 物反应器10的一个优选实施方案。图4是以优选方式用于本发明的 一种旋转式TVEMF生物反应器10的橫截面图。图4的TVEMF生 物反应器10举例说明带有集成的随时间变化电磁力源。图5也举例 ^L明带有集成的随时间变化电磁力源的TVEMF生物反应器的一个 优选实施方案。图6-8显示带有相邻的随时间变化电磁力源的旋转式 生物^^应器。现在转到图2，图2展示的是本发明的TVEMF生物反应器10 的一个优选实施方案的侧视图。图2包含由基座112支撑的马达外 革lll。马达113位于马达夕卜罩111内部，且通过第一线114和第二 线115连接至其内带有控制装置的控制盒116，由此通过转动控制钮 U7可对马达113的转速进行增量控制。马达外軍111内部设置有马 达113，使得马达轴118纵向穿过外軍111延伸，且马达轴118是径 向的，使得轴118的中心与在径向腔室119位置的地球平面平行， 优选地用包括但不限于塑料的透明材料制成。在此优选实施方案中，径向腔室119连接到轴118使得腔室119 围绕径向轴旋转，而径向轴与水平面平行。腔室119被线圏120所
缠绕。线團120的尺寸和缠绕團数4吏得，当优选为0.1 mA到1000 mA 的方波电流供应在线團120上时，在腔室119内产生优选为0.05高 斯到6高斯的随时间变化的电磁力。线團120在轴118的末端通过 线123和124连接至第一环121和第二环122。然后，环121和122 与第一电磁传送线125和第二电>^传送线128相接触，使得腔室119 可以旋转同时电流恒定地供应到线團120上。电>^发生装置126与 线125、 128相连接。通过旋转电磁发生装置钮127调节其输出，从 而使得电磁发生装置126提供方波到线125、 128和线團120上。图3是可用于本发明中的图2所示TVEMF生物反应器10的侧 面投影图。现在转到图4展示的带有培养腔室230的旋转式TVEMF生物 反应器IO,该腔室优选是透明的，并且适于在其中含有血混合物， 另外包含外壳220，其包括第一 290和第二 291圆柱形横向末端帽构 件，该构件与第一 228和第二 229末端表面相对，末端表面i殳置成 安装内部圆柱管状玻璃构件293和外部管状玻璃构件294。提#适 的压力密封。在内部293与外部294管状构件之间是环形线加热器 296，其用于获得细胞生长的合适的培养温度。所述线加热器296也 可用作随时间变化的电磁力装置，用以给培养腔室230提供随时间 变化的电场，或者，如图5所述，独立的线圏144可用于揭^供随时 间变化的电磁力。第一末端帽构件290和第二末端帽构件291具有 内部弯曲表面，其与末端表面228、 229相邻，以促进腔室230内的 混合物流动更平滑。第一末端帽构件290和第二末端帽构件291分 别具有第一中央流体传递轴颈构件292和第二中央流体传递轴颈构 件295，其分别旋转式安^fr输入轴223和输出轴225上。每个传递 轴颈构件294、 295具有凸缘以承载在末端帽构件290、 291中的凹 陷沉孔中，并且其上附着第一锁紧垫圏环297和第二锁紧垫圏环298 以防止相对于轴223、 225的径向运动。每个轴颈构件294、 295具 有中间环形凹陷，其与径向扩展的、沿圆周布置的通il^目连。轴颈 构件292、 295上的每个环形凹陷通过末端帽构件290和291中的第 一放射状设置通道278和第二放射状设置通道279分别与第一输入 偶合件203和第二输入偶合件204相偶合。放射状通道278或279 中的载体流动通过轴颈构件294或295中的第一环形凹陷和径向通
道，以允许载体通过轴颈构件292、 295 1到达轴颈292、 295的 每个末端，在此其进入围绕轴223、 225。附着在末端帽构件290和291的是包含M轴承的第一管状轴 承支架205和第二管状轴承支架206，该滚珠轴^目对地支撑输入轴 223和输出轴225上的外部支架220。第一轴承支架205具有附着的 第一链轮210，其用于为外部支架220提供旋转驱动，其旋转方向围 绕输入轴223和输出轴225以及径向轴221。第一轴承支架205和第 二轴承支架206也具^^从线加热器296和任何其它传感器向外供电 的功能。内部滤器装置235包括内部管状组件215和外部管状组件216，其沿它们的长度方向具有孔或洞，该装置有带孔的第一 217和第二218内部滤器装置末端帽组件。内部管状组件215构建成两部分，其 两部分带有互锁的位于中央的偶合部分，其每一部分分别附着于末端帽217或218。外部管状组件216 "^殳置在第一 217和第二内部滤器 装置末端帽组件之间。所述末端帽组件217、 218分别被旋转式支持在输入轴223和输 出轴225之上。内部组件215通过钉和中央定位的(interfitting)凹 槽219旋转式附着至输出轴225。十微米织法的聚酯布224布置在外 部组件216的外表面之上，并且附着在任一末端的O环。因为内部 组件215被偶合钉附着在输出驱动轴225上的槽，所以输出驱动轴 225可旋转内部组件215。所述内部组件215与第一 217和第二 218 末端帽相偶合，所述帽支持外部组件216。输出轴225延伸通过第一 静止支架240中的轴承，并与第一链轮241相偶合。如举例所示， 输出轴225具有管状孔222，其从位于密封之间的第一静止支架240 中的第一端口或通道289延伸至内部组件215，使得流体栽体的流动 可从内部组件215中通过静止支架240而退出。内部组件235的第一 217和第二 218末端帽与外部支架220中 的轴颈292、 295之间是叶片组件50a和50b的第一 227和第二 226 毂。在输入轴223上的第二毂226通过钉231偶合至输入轴223, 4吏 得第二毂226随输入轴223旋转。每个毂227、 226具有轴向延伸的 通道，用于传送载体使之穿过毂。
输入轴223延伸穿过第二静止支架260中的轴承，该支架用于 旋转式支持输入轴223。第二径向通道267延伸穿过输入轴223到保 持垫圏和环的过渡位置，所述垫團和环设置在面板与支架260之间 的第二环状凹陷232中。第二末端帽组件291中的第三^L射状通道 272允许凹陷中流体载体从第二末端帽组件291中退出。尽管没有显 示，第三通道272通过管线和Y型连接头连接至通道278和279的 每个。图4中显示样品端口，其中沿第一轴延伸的第一钻孔237与腔 室230的角233相交，形成受限的开口 234。该钻孔237在一端带有 沉孔和带螺紋的环，以螺紋形容纳圆柱形阀组件236。阀组件236 具有互补成形的顶端，以掩^开口 234并稍微突出到腔室230的内 部。阀组件236上的O环243提供密封。沿第二轴的第二钻孔244 与第 一钻孔237相交在O环243与开口 234之间的位置。弹性体或 塑料阻塞物245封闭了第二钻孔244，并且可用皮下注射器i^用以 取样品。为了取样品，阀组件236向后移，以使得开口 234和钻孔 244可以t。然后可4吏用注射器提取样品，开口 234可被重新封闭。 没有外部污染到达TVEMF生物反应器10的内部。在运行中，载体输入到第二端口或通道266,而后到轴通道，由 此通过第三it射状通道272到达第一^L射状i殳置的通道278和第二 放射状设置的通道279。当载体通过轴颈292、 294中的径向通道进 入腔室230时，栽体撞击在毂227、 226的末端表面228、 229上， 并^L射状以及轴向分軟而通过毂227、 226中的通道。通过毂227、 226的载体撞击在末端帽组件217、 218上，并且ii射状^:开来。 1流体载体的液流因此放射状向外离开径向轴221,并以螺旋管形 式流动，通过聚酯布224以及滤器装置235中的开口从每个末端退 出，以经过通道266和289退出。通过控制外部支架220、腔室230 和内部滤器装置235的旋转iiA和旋转方向，可获得任何期望类型 的载体动作。然而，很重要的是可以在连续供应新鲜流体载体的同 时获得回转器操作这一事实。如果不使用集成式环形线加热器296施加随时间变化的电磁力， 可通过另一个优选的随时间变化电磁力源进行施加。例如，图6-8 举例说明了随时间变化电磁力设备140，其提供电磁力给生物反应器 中的细胞培养物，所述生物反应器不带有集成式随时间变化电磁力、
而是带有相邻的随时间变化电磁力装置。具体地，图6是随时间变 化电磁力装置140的一个优选实施方案。图6是装置140的侧面投 影图，其中包含支持基座145，支持在基座145之上的圆柱体线團支 持物146，其中线圏147围绕支持物146缠绕。图7是图6中举例说 明的随时间变化电磁力装置140的前投影图。图8是随时间变化电 磁力装置140的前投影图，其举例说明在运行中整个生物反应器148 放入圆柱体线團支持物146中，该支持物146由支持基座145所支 持并由线團147所缠绕。因为随时间变化电磁力装置140邻近生物 反应器148，随时间变化电磁力装置140可重复使用。另外，因为随 时间变化电磁力装置140邻近生物反应器148,装置140可用于在所 有类型的生物反应器中产生电磁力，优选旋转型。
运行中，在TVEMF扩增期间，本发明的TVEMF生物反应器 IO在细胞培养腔室中包含血混合物。在TVEMF扩增期间，可以评 估并调节含有血混合物的腔室的旋转速度，以使得血混合物基本上 保持在径向轴处或者在径向轴周围。确保提高转速以防止与壁撞击。 例如，如果血混合物中的血液干细胞在旋转循环的向下侧时过分向 内向下落以及在旋转循环的向上侧时过分向外并且不充分向上，则 优选提高转速。最优情况下，建i义用户优选地选择旋转速率以4吏得 壁碰撞频率和强度尽可能小，从而维持血液干细胞的三维几何结构 以及它们的细胞-细胞支持和细胞-细胞几何结构。本发明优选的速率 是从5到120 RPM，更优选从10到30 RPM。
血混合物可优选地通过优选为透明的培养腔室视觉上评价，并 手动调节。血混合物的评价和调节也可通过传感器(例如，激光) 自动进行，该传感器监测血液干细胞在TVEMF生物反应器10中的 位置。指示过多细胞运动的传感器读数将自动引起相应调节转速的 机制。
另外，在运行中，本发明预期电磁发生装置被打开并调节，使 得方波输出在含有血混合物的腔室中产生期望的电磁场，优选在 0.05高斯到6高斯的范围。
优选地，所述方波具有约2到约25周/秒的频率，更优选约5到 约20周/秒，例如约10周/秒，并且导体的RMS值为约1到1000 mA，
优选l到6mA。但是，这些参数并不意在限制本发明的TVEMF， 因为它们可基于本发明的其它方面而变化。例如，可通过标准i殳备 比如EN131Cdl Sensor Gauss Meter测量TVEMF。
按照本发明所预期，在不偏离本发明范围的情况下，可对受到 随时间变化电磁力的旋转式生物反应器作出多种改变，因此上文描 述中所含的所有内容应该被理解为举例说明，而不是限制。
本发明优选实施方案详述
本发明涉及修复、补充和再生人体皮肤、口和耳组织特别是其 中的上皮组织的方法。
本发明可通过下文所述优选实施方案更完整的进行描述，但并 不仅限于此。
在本发明的优选实施方案中描述了制备成体干细胞的方法，所 述干细胞可协助身体修复、替换和再生组织，尤其是皮肤、口和耳 组织，尤其是其中的上皮组织。从患者体内移出血细胞。这些细胞 的亚群目前称为成体干细胞。将所述血细胞置于如本文所述的生物 反应器中。所述生物反应器容器以一定速度旋转，使得血细胞悬浮 以维持其三维几何结构及其细胞-细胞支持和几何结构。在所述细胞
在所述反应器中的时间内，可以对其提供营养物，使其暴露于激素、 细胞因子或生长因子，和/或进行遗传修饰，并且优选除去有毒物质。 通常所除去的有毒物质是来自血细胞，其包括死亡细胞的有毒颗粒 物以及颗粒细胞和巨嗜细胞的有毒物质。扩增这些细胞的亚群，产 生大量细胞。所述细胞的扩增是受控的，使得这些细胞在足够的时 间里(优选在七天内)扩增至少七倍。接着所述细胞优选静脉注射， 但也可直接注射进需要修复的组织中或者与其紧邻部位，使身体的 天然系统修复和再生组织。
下文的定义意在辅助描述和理解本发明内容中所定义的术语。 这些定义并不意味将这些术语限制在少于通过本申请所描述的内 容。另外，关于TVEMF包括几种定义，在此方面的所有定义应被 理解为互相补充，而不应理解为互相抵触。
本申请全篇中使用的术语"成体干细胞"指多能性细胞，其是未 分化的且能产生多种分化细胞。在本发明中，成体干细胞优选
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CD34+/CD38-。成体干细胞也称为体细胞干细胞(somatic stem cells),并且不是直接来源于胚胎的胚胎干细胞。
本申请全篇中使用的术语"血"指哺乳动物中成体干细胞的两种 主要来源外周血或脐带血。"外周血，，是全身性血，即哺乳动物中 全身性循环的或者已循环的血。所述哺乳动物不指胎儿。就本发明 目的而言，没有理由区分位于相同循环回路中不同部分的外周血。 术语"胯带血"指来自胎儿或嬰儿的脐带和/或胎盘的血。脐带血是已 知最丰富的干细胞来源之一。术语"脐带"不以任何方式将本发明的 术语"脐带血，，限制在来自脐带的血；胎儿或嬰儿胎盘的血与脐带的 血是混合的。就本发明目的而言，没有理由区分位于相同循环回路 中不同部分的血。 一般可以在婴儿出生后立刻收集50-100 ml脐带 血。优选地，所有这些血均可用于本发明的治疗方法。
本申请全篇中使用的术语"血细胞，，指来自血的细胞；"外周血细 胞"指来自外周血的细胞；"脐带血细胞"指来自脐带血的细胞。能够 复制的血细胞可经过TVEMF生物>^应器中的TVEMF扩增，并可 存在于本发明的组合物中。
本申请全篇中使用的术语"血液干细胞，，指来自血的成体干细 胞。血液干细胞是成体干细胞，其如上文所述也称为体细胞干细胞， 而不是直接来源于胚胎的胚胎千细胞。优选地，本发明的血液干细 胞是CD34十/CD38-细胞。
本申请全篇中使用的术语"血液干细胞组合物"或其提法指本发 明的血液干细胞，所述血液干细胞(1)其每单位体积数量是天然存 在血液来源的至少7倍，并且具有与自然存在的血液干细l^目同或 非常相似的三维几何结构和细胞-细胞几何结构和细胞-细胞支持，和 /或(2)已经过TVEMF扩增，并保持了上述的三维几何结构和支 持。本发明血液干细胞组合物中的血液干细胞与某种载体在一起， 所述载体可以是可药用载体、血浆、血、白蛋白、细胞培养基、生 长因子、铜螯合剂、激素、緩冲剂、低温保存剂或某种其它物质。 涉及天然存在的血时，优选将本发明的血液干细胞与其原始的血(即 外周血、脐带血、混合外周血与脐带血或其它血)来源相比。但是， 如果这一比较不可用，则天然存在的血可指这些血的平均或典型特 征(优选相同的哺乳动物物种)作为本发明血液干细胞的来源。
本发明的"血液干细胞药物组合物"是适于对哺乳动物优选Aj^ 用的血液干细胞组合物。这样的组合物包含治疗有效量的经扩增(优 选TVEMF扩增)血液干细胞以及可药用载体。经扩增的血液干细 胞的治疗有效量(本文其它部分也有讨论)优选为至少1000个干细 胞，更优选至少104个干细胞，还更优选至少105个干细胞，更优选 至少107到109个干细胞或甚至更多的干细胞，比如1012个干细胞。 这些数量的经扩增干细胞可以以一次或多次剂量施用。如本申请全 篇中所指出，施用于患者的干细胞的数量可能受限于才艮据本发明扩 增增殖的来源血中原始可用的干细胞数量。不限于理论地，相信在 施用之后未被身体利用的干细胞将简单的通过天然身体系统除去。
本申请全篇中使用的术语"血混合物，，指血/血细胞与辅助所述细 胞扩增的物质的混合物，该物质比如用于细胞生长的培养基，该物 质将放置于TVEMF生物反应器中(比如在细胞培养腔室中)。所述 "血混合物"血细胞可简单地通过将全血与诸如细胞培养基之类的 物质混合而存在于血混合物中。血混合物也可由本申请全篇中所述 含有血液干细胞的来自血的细胞制备物(如"血沉棕黄层")制成。 优选地，血混合物包含€034+/€038-血液干细胞以及011 ^"0，8培 养基(DMEM )。优选地，约一半的血混合物是细胞培养基如DMEM。
本申请全篇中使用的术语"TVEMF，，指"随时间变化的电磁力 (Time Varying Electromagnetic Force)，，。如上文所讨论的，本发 明的TVEMF是方波(遵循傅立叶曲线)。优选地，方波频率为约 10周/秒，导体RMS值为约1到1000 mA,优选1到6 mA。但是， 这些参数并不意在限制本发明的TVEMF,因为这些可才艮据本发明 的其它方面而变化。例如，可通过标准设备比如EN131Ce11 Sensor Gauss Meter进行测量TVEMF。
本申请全篇中使用的术语"TVEMF生物及J[器，，指施加TVEMF 的旋转式生物反应器，如上文
中所更详细描述的。施加到 生物>^应器上的TVEMF优选为0.05到6.0高斯，优选0.05-0.5高 斯。参阅如图2、 3、 4和5,作为TVEMF生物>^应器的实例(不 意味着限制)。在一个简单的实施方案中，本发明的TVEMF生物反 应器使得封闭的血混合物在适当的高斯水平下(根据施加的 TVEMF)旋转，并允许其中的血细胞(包括干细胞)扩增。优选地，
TVEMF生物反应器允许交换生长培养基(优选带有添加剂)并允 许对血混合物充氧气。所述TVEMF生物反应器提供用于细胞生长 数天或更多的机制。不限于任何理论地，所述TVEMF生物>^应器 使得反应器中的细胞受到TVEMF，以使TVEMF穿过细胞或接触 细胞，从而4吏细胞经历TVEMF扩增。在TVEMF扩增过程中， TVEMF生物反应器优选以5到120 rpm、更优选10到30 rpm的速 率旋转，以使壁碰撞频率和强度尽可能小，从而维持血流细胞的三 维几何结构以及细胞-细胞支持和细胞-细胞几何结构。
本申请全篇中使用的术语"TVEMF扩增的血细胞"指在置于 TVEMF生物反应器中并受到约0.05至6.0高斯的TVEMF之后每 单位体积数量增加的血细胞。每单位体积数量上的增加是细胞在 TVEMF生物反应器中复制的结果，使得生物反应器中细胞总数增 加。每单位体积中细胞数量增加明确地不是因为流体体积的简单減 少，例如，血液体积从70 ml减少到10 ml从而每ml细胞的数量增 加。
本申请全篇中使用的术语"TVEMF扩增的血液干细胞，，指在置 于TVEMF生物>^应器并受到约0.05至6.0高斯的TVEMF之后每 单位体积数量增加的血液干细胞。每单位体积干细胞数量上的增加 是细胞在TVEMF生物反应器中复制的结果，使得生物反应器中干 细胞总数增加。每单位体积中干细胞数量的增加明确地不是因为流 体体积的简单减少，例如，血液体积从70 ml减少到10 ml从而每 ml干细胞的数量增加。
本申请全篇中使用的术语"TVEMF扩增，，(TVEMF國expanding) 指在TVEMF (旋转)反应器中在TVEMF存在下TVEMF反应器 中细胞进行复制(分裂并生长)的步骤。血液干细胞(优选 CD34十/CD38-干细胞)优选复制且不经历进一步分化，使得所有或 基本上所有根据本发明扩增的CD34+ZCD38-干细胞在其处于生物反 应器中的时间内进行复制而不发生分化。"基本上所有"意在指至少 70%、优选至少80%、更优选至少90%、再优选至少95%、再优选 至少97%、最优选至少99%的CD34十/CD38-细胞不因为发生分化而 使其在TVEMF扩增过程中不再是CD34+/CD38-.
本申请全篇中使用的术语"TVEMF扩增"指通过让细胞受到约
0.05到约6.0高斯的TVEMF而使TVEMF生物反应器中的血细胞 (优选血液干细胞)数量增加的过程。优选地，血液干细胞数量的 增加在每单位体积的数量上是原始血来源的至少7倍。才艮据本发明 的TVEMF生物反应器中的血液干细胞的扩增提供了维持或具有与 TVEMF扩增前血液干细^^本相同的三维几何结构和细胞-细胞支 持以及细胞-细胞几何结构的血液干细胞。TVEMF扩增的其它方面 也可提供本发明的血液干细胞的异乎寻常的特征。不限于理论地， TVEMF扩增不只提供高浓度的维持三维几何结构和细胞-细胞支持 以及几何结构的脐带血干细胞。不限于理论地，TVEMF可以在 TVEMF扩增期间影响干细胞的一些特性，例如上调促进生长的基 因，或者下调阻止生长的基因。总之，TVEMF扩增使得促进血液 干细胞生长而不发生分化。
本申请全篇中使用的术语"TVEMF扩增的细胞，，指经历了 TVEMF扩增过程的细胞。
本申请全篇中使用了术语"修复"、"补充"和"再生"。这些术语 并不意在彼此抵触，而是涉及总体的组织修复。
在本申请全篇中，提到修复皮肤、口或耳组织、治疗皮肤、口 或耳疾病或病症等并不是排他性的，而是指组织修复的总体目标， 其中组织中的改善源于施用本文讨论的干细胞。就这些组织而言， 补充和修复上皮细胞和组织是优选的，但是也可以进行其它形式的 修复，比如修复与耳中听觉及听觉丧失相关的神经，例如本发明中 可存在皮肤和口中的结締组织和/或神经组织。尽管本发明部分涉及 有症状、可能危及生命的疾病或病症，但是本发明也意在包括对较 小修复的治疗，甚至是在哺乳动物(优选人)健康上的症状或问题 被注意到之前，通过早期51入扩增的干细胞对这些疾病/病症进行防 止/预防。
本申请全篇中使用的术语"有毒物质"或者相关术语可指对细胞 (优选血液干细胞)或者对患者有毒性的物质。具体地，术语有毒 物质指死细胞、巨噬细胞以及可以是血中特有的或不常见的物质(如 外周血中的镰刀状细胞、脐带血中的母体尿或废物或者其它组织或
废物)。其它有毒物质在本申请中有所讨论。从血液中除去这些物质 是本领域中特别是将血制品引入患者的相关领域中公知的。
本申请全篇中使用的术语"骨髄采集术"指将针插入骨髓并抽取 骨髓。这样的采集术是本领域公知的。本申请全篇中使用的术语"自体，，指供体(扩增之前血液干细胞 的来源)和受体是同一哺乳动物的情况。本发明包括自体皮肤、口 和耳组织的修复及补充。本申请全篇中使用的术语"异体，，指供体(扩增之前血液干细胞 的来源)和受体不是同一哺乳动物的情况。本发明包括异体皮肤、 口和耳组织的修复及补充。本申请全篇中使用的术语"CD34+"指血细胞表面存在表面抗原 (CD34)。在所有的发育状态下，CD34蛋白都存在于it^干细胞的 表面。本申请全篇中使用的术语"CD38-，，指血细胞表面缺乏表面抗原 (CD38 )。 CD38不存在于本发明干细胞的表面。本申请全篇中使用的术语"细胞-细胞几何结构"指细胞的几何结 构，包括细胞彼此之间相对的间距、距离和物理关系。例如，本发 明的TVEMF扩增干细胞波此保持与在体内相同的关系。所述扩增 的细胞处于细胞之间自然间距的范围内，这与例如无法保持这种距 离的二维扩增容器相反。本申请全篇中使用的术语"细胞-细胞支持"指一个细胞对相邻细 胞提供的支持。例如，在体内健康组织和细胞与其它细胞保持相互 作用，例如化学的、激素的、神经的(可用/合适时)相互作用。在 本发明中，这些相互作用维持在正常的功能参数范围内，例如，这 意味着它们不会开始对其他细胞传送有毒或损伤信号(除非这是天 然血环境中存在的)。本申请全篇中使用的术语"三维几何结构"指细胞在三维状态下 的几何结构(与其天然状态相同或非常近似)，这与例如在培#^中 培养的细胞的二维几何结构相反，在培#^中所述细胞变得扁平和/ 或伸展。对于上述三个定义中的每一个而言，涉及维持本发明干细胞的 细胞-细胞支持和几何结构以及三维几何结构时，术语"基4^目同"指 本发明的TVEMF扩增细胞中提供正常的几何结构和支持，使得所
述细胞不以例如失去功能、不能修复组织或者对其它细胞有毒或有 害的方式发生改变。为了更完整的描述耳的功能以及本发明提供的再生，给出如下定义本申请全篇中使用的术语"外耳"或相关术语包括耳廓、耳道和 鼓膜外层。声音进入耳道。在鼓膜处，声能(气压的改变)转换成 鼓膜运动的M能。本申请全篇中使用的术语"中耳"或相关术语作为阻抗匹配转换 器(impedance-matching transformer), 匹配耳道中空气的阻抗与 内耳外淋巴的阻抗。本申请全篇中使用的术语"内耳"或相关术语提供转换成基底膜 行波模式的M能。最后的能量转叛&生在这里。本申请全篇中使用的术语"外毛细胞"或相关术语包括三排约 12000个细胞。尽管它们比内毛细胞多很多，但是它们仅接收来自 VIII神经听觉部分的神经纤维的神经分布中的约5%。这些细胞含 有肌肉样纤维，其在受到刺激后收缩并微调基底膜对行波运动的反 应。由于其反应受到调节，因此健康的内毛细胞将随着刺、^L出响 声。此"响声，，提供了耳声发射(Otoacoustic Emissions )的声源。本申请全篇中使用的术语"内毛细胞"或相关术语是一排约3500 个细胞。这些细胞接收来自VII神经声音部分的神经纤维的神经分 布中约95%。这些细胞主要负责产生人的听觉。丧失或损坏时，通 常发生重度至完全的听觉丧失。本申请全篇中使用的术语"内沟(inner sulcus )，，或相关术语是 内毛细胞的惰性支持细胞。关于上文所定义术语或其它本申请全篇中所使用术语的其它表 述不意味着受到上述定义的限制，而是可对这些定义作出贡献。在 本申请全篇中提供了关于本发明多个方面的信息，这并不意味着只 限制在它所包含的章节，而是意味着对从整体上理解本发明作出贡 献。本发明涉及提供快速可用的TVEMF扩增的血液干细胞来源，
所述干细胞用于修复、补充和再生人的内耳、皮肤和口组织。本发 明可通过如下文所描述的优选实施方案进行更完整的描述，但是并 不意在仅限于此。关于上文所定义术语或其它本申请全篇中所使用术语的其它表 述不意味着受到上述定义的限制，而是可对这些定义作出贡献。在 本申请全篇中提供了关于本发明多个方面的信息，这并不意味着只 限制在它所包含的章节，而是意味着对从整体上理解本发明作出贡 献。操作方法-制备TVEMF扩增的血液干细胞组合物在本发明的优选实施方案中描述了用于制备TVEMF扩增的血 液干细胞的方法，所述干细胞可协助身体修复、替换和再生皮肤、 口或耳组织和/或补充细胞如内耳上皮细胞，或者可用于皮肤、口或 耳病症的研究或治疗。在此优选方法中，血收集自哺乳动物，优选灵长类哺乳动物， 更优选人，例如按照本申请全篇所述和按照本领域已知完成，优选 如本领域公知地通过注射器完成。血液可在收集后立即扩增并使用， 或以扩增或未扩增的形式低温保存备用。只以不威胁到受试者的量 :^Ufe。优选地，收集约10到约500 ml血；更优选约100-300 ml,甚 至更优选150-200 ml。本发明的血收集不意味着限制，而是也可包 括例如其它直接收集哺乳动物血的方法、合并来自 一个或多个来源 的血的方法、例如通过由商品或其它来源间接获得血的方法，包括 例如来自"血库，，的低温保存的外周血或脐带血或以其它方式保存的 以M来使用的血液。当从哺乳动物直接收集时， 一般将血抽入一个或多个注射器中， 其中优选含有抗凝血剂。血可保存在注射器或者转移到其他容器中。 接着可将血分离成其各个部分；白细胞、红细胞和血浆。这在离心机(旋转血液容器直至血分离的装置)中实现或者通过沉降(将沉 淀物注入血液容器中以使血分离的过程)实现。其次，一^jk液被 分离，红细胞(RBC)在底部，白细胞(WBC)在中间，血浆在顶 部，则将白细胞移出用于保存。中间层也称为"血沉棕黄层"，含有 目的血液干细胞；血的其它部分是不需要的。就一些库而言，这就
将是它们处理的范围。但是，其它库会通it^WBC中移出单核细 胞(在此情况下是白细胞的一个亚群)来继续处理血沉棕黄层。尽 管不是所有人都赞同此方法，但其保存的较少，保存细胞所需的低 温氮也较少。分离血细胞的另一种方法是在分离器比如Cobe Spectra细胞分 离器中对所有收集到的血进行一轮或多轮(优选三轮)连续的流式 白细胞分离术。这一方法将具有一个细胞核的血细胞从其它血细胞 中分离出来。干细胞是具有一个细胞核的组中的一部分。分离血细 胞的其他方法是本领域已知的。优选地，从血液样品中移除RBC。尽管人们可能具有相同的 HLA型(是干细胞移植所需的)，但其也可能具有不同的血型。通 过移除RBC可以使对干细胞移植的有害反应最小化。因此，通过除 去RBC，干细胞样品更有可能与更多的A^目容。RBC还可能在融化 时破裂，释放出游离的血红蛋白。这种类型的血红蛋白可严重影响 接受移植者的肾脏。另外，当RBC破裂时，干细胞的生存力降低。同时，尤其是在低温保存血或将血转移至另一哺乳动物时，可 以检测血以确保不存在传染病或遗传性疾病，比如HIV/AIDS、肝炎、 白血病或免疫疾病。如果存在这些疾病，则可弃用所iiik，或在指 出未来使用者需要考虑的相关风险后使用。在本发明的另一个实施方案中，血细胞可从供体获得。在收集 之前，在3天中每12小时使用G-CSF (优选以0.3 ng到5照的量， 更优选lng/kg多J 100ng/kg，再优选5 ng/kg多』20 ng/kg，再优选6 ng/kg)处理供体，然后第四天处理一次。在优选方法中，还施用相 似量的GM-CSF。其它替代方案是单独使用GM-CSF或其它生长因 子分子、白介素。接着从供体收集血，其可以以血液混合物整体使 用或者首先如本申请全篇中所讨论地分离成细胞组分，其中包括干 细胞(CD34+/CD38-)的细胞部分用于制备待扩增的血液混合物。 细胞可被分离，例如，通过分离器如Cobe Spectra细胞分离器使供 体的总血液体积进行3轮连续的流式白细胞分离术。优选地，将扩 增的干细胞再引入同一供体，该供体需要修复皮肤、口或耳，如本 文所述。但是，也可应用异体引入，如本文所述。其它收集前施用 (pre-collection administration)对于本领域技术人员来i兌是显而易见的。优选地，从血中除去红细胞，并将包括血液干细胞的剩余细胞与合适培养基一起置于TVEMF生物反应器中(见"血混合物")，如 本文所述。在本发明更优选的实施方案中，置于TVEMF生物反应 器中的细胞材料仅为上文所述的"血沉棕黄层，，(其包括血液干细胞，如本文所述)。其它实施方案包括移除其他非干细胞以;^血成分，以制备不同的血制备物。这些血制备物甚至可含有作为剩下的仅有血 组分的€034+/€038-血液干细胞。除去血细胞中的非干细胞类型可 通过负性分离技术(negative separation techniques)来实现，其比 如但不限于沉降和分离。许多负性分离方法是本领域公知的。但是， 正性选择技术也可使用，并且在本发明中是优选的。用于除去血中 多种组分和正性选择CD34十/CD38-的方法是本领域中已知的，只要 它们不裂解或者不可逆地损伤所需的血液干细胞就可以使用。例如， 可应用对CD34+ZCD38-有选择性的亲和方法。优选地，从血中制备 如上文所述的"血沉棕黄层"，然后从"血沉棕黄层，，中分离出其中的 CD34十/CD38-细胞用于TVEMF扩增。所收集的血或如上文所述的所需细胞部分必须置于TVEMF生 物>^应器中用于TVEMF扩增。如上文所讨论的，术语"血混合物" 包括血(或者所需细胞部分，例如没有红细胞的血，或者优选v^uk 中分离出的CD34十/CD38-血液干细胞)与允许这些细胞扩增的物质 的混合物，这些物质比如用于细胞生长的培养基，其将置于TVEMF 生物反应器中。细胞培养基、允许细胞生长和扩增的培养基是本领 域公知的。优选地，允许细胞扩增的物质是细胞培养基，更优选是 Dulbecco，s培养基。显然，细胞培养基的组分必须不杀死或损伤细 胞。在TVEMF扩增之前或期间，其它组分也可添加到血混合物中。 例如，可将血置于带有Dulbecco，s培养基的生物反应器中，并且另 外添加5% (或者其它所需量，比如在约1%到10%的范围)人血清 白蛋白。也可在将血置于生物反应器中之前，在生物反应器外部或 内部在血中加入血混合物的其它添加物，包括但不限于生长因子、 铜螯合剂、细胞因子、激素和其它可增强TVEMF扩增的物质。优 选地，来自一名个体的血收集物的全部体积(优i^/ok的量为约10 ml到约500 ml,更优选约100 ml到约300 ml血，再优选约150 ml
到约200 ml血)与细胞培养基如Dulbecco，s培养基(DMEM)混 合，并且添加5。/。Aj6l清白蛋白，以制备用于TVEMF扩增的血混 合物。例如，对于50到100 ml血样品，优选使用约25到约100 ml DMEM/5。/。人血清白蛋白，使得血混合物的总体积在置于生物反应 器时为约75到约200ml。作为一皿则，收集的血越多越好；如果 从一个个体收集了超过100 ml，则优选使用所有的这些血。在可获 得更大体积的情况下，例如通过合并(来自相同或不同来源的)血， 可以优选多于一个剂量。当合并血收集物并一起TVEMF扩增时， 使用灌注式TVEMF生物反应器是特别有用的。本发明的铜螯合剂可以是任何无4^螯合剂，优选为青霉胺或 盐酸曲恩汀。更优选地，青霉胺是溶于DMSO中的D(-)-2-#J^-3-巯基-3-曱基丁酸(Sigma-Aldrich )，以约10 ppm的量添加到血混合 物中。从哺乳动物直接收集血时，也可对所述哺乳动物施用所述铜 螯合剂。优选在从哺乳动物收集血之前一天以上、更优选两天以上 进行这样的施用。铜螯合剂的目的是在TVEMF扩增之前降lMi液 中铜的量，无论是加入到血混合物或施用给血供体哺乳动物或者两 者皆有。不限于理论地，相信可用铜量的减少可增强TVEMF扩增。术语"置于TVEMF生物>^应器中，，没有限制性含义，血混合 物可完全在生物反应器外部制成，然后再将混合物置于生物反应器 中。血混合物也可全部在生物反应器内部混合。例如，可将血(或 其细胞部分)置于生物反应器中并补充Dulbecco，s培养基和5%人 血清白蛋白，所述培养基和血清白蛋白预先存在于生物反应器中、 与血同时添加到生物及^应器中或者在血之后添加到生物^^应器中。本发明的优选血混合物包含以下成分分离自血样品的血沉棕 黄层的CD34+/CD38-干细胞和Dulbecco，s培养基，含有 CD34十/CD38-细胞的所述培养基总体积约为150 - 250 ml，优选200 ml。更优选地，血混合物中包含G-CSF (粒细胞集落刺激因子)。 优选地，G-CSF的存在量足以增强血液干细胞的TVEMF扩增。更 优选地，在TVEMF扩增之前血混合物中存在的G-CSF的量是约25 到约200 ng/ml混合物，更优选约50到约150 ng/ml混合物，再优 选是约100 ng/ml。TVEMF生物反应器容器(含有包括血液干细胞的血混合物)
以一定速度旋转，该速度使得血液干细胞悬浮并维持其三维几何结 构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。优选地，旋转速度为5-120 rpm，更优选10-30 rpm0 这些ii^并不意在限制》旋转速度 将至少部分取决于生物反应器的类型和细胞培养腔室的尺寸以及其 中放置的样品。在细胞位于TVEMF生物反应器期间，优选对其供 应营养物和新鲜培养基(DMEM和5。/。Ajfe清白蛋白，见上文流体 载体的讨论)，使其接触激素、细胞因子和/或生长因子(优选 G-CSF);并除去有毒物质。从TVEMF生物反应器中的血细胞中除 去的有毒物质包括垂死细胞的有毒颗粒物质以及粒细胞和巨噬细胞 的有毒物质。细胞的TVEMF扩增受到控制，使得细胞优选在足够 量的时间内扩增(每单位体积的数量增加)至少七倍。优选地，血 液干细胞(以及其它细胞，如果存在的话)经过至少4天的TVEMF 扩增，优选约7到约14天，更优选约7到约10天，再优选约7天。 TVEMF扩增可在TVEMF生物>^应器中持续到长达160天。尽管 TVEMF扩增甚至可长于160天，但此种长度的扩增不是本发明的 优选实施方案。优选地，TVEMF扩增在TVEMF生物反应器中以约26到约 41'C的温度实施，更优选地，以37。C的温度实施。监测正在经历TVEMF扩增的细胞的总体扩增的一个方法是 通过视觉检查。血液干细胞一般为暗红色。优选地，用于形成血混 合物的培养基的颜色为浅色或无色。 一旦生物反应器开始旋转并且 施加TVEMF,细胞优选聚集在生物反应器容器中央，培养基围绕 在有颜色的细胞簇周围。通氧气和添加其它营养物通常不影响通过 构建在生物反应器上的观察窗(一般是透明塑料的)观察细胞簇。 簇的形成对于帮助干细胞保持它们的三维几何结构和细胞-细胞支持 以及细胞-细胞几何结构是重要的；如果所述簇^t且细胞开始接触 到生物反应器容器的壁，则提高转速(手动或自动)4吏得中央的细 胞簇可再次形成。在细胞蔟形成后迅速测量可观察的细胞簇直径， 其可与此后的簇直径做比较，以显示出TVEMF生物反应器中细胞 大概的增长数。在TVEMF扩增期间细胞数量增加的测量也可以按 照本领域已知用于常规生物反应器的许多方法进行。TVEMF生物 反应器中也可包括自动传感器，以监测和测量蔟尺寸的增加。TVEMF扩增过程可被仔细监测，例如由实验室技术人员监 测，其将检查细胞簇的形成以确保细胞在生物反应器中保持成簇状 态，并且当细胞蔟开始^t时将增加生物反应器的旋转。用于监测 细胞蔟和监测生物反应器内血混合物粘性的自动系统也可用于监测 细胞蔟。细胞簇粘性的改变在TVEMF扩增过程开始约两天后就可 明显观察到，并且可在该时间附近增加TVEMF生物反应器的旋转 速度。TVEMF生物反应器转速在TVEMF扩增过程中可以变化。 优选地，旋转速度适时改变使得正在经历TVEMF扩增的细胞不与 TVEMF生物反应器容器的侧面接触。并且，在TVEMF扩增过程中，实验室技术人员可以例如一 天一次、或每两天一次地人工(例如使用注射器)向生物反应器中 加入新鲜培养基和优选的如上文所述其它所需添加剂如营养物和生 长因子，并且抽出含有细胞废物和毒素的旧培养基。新鲜培养基和 其它添加剂也可在TVEMF扩增期间自动泵入TVEMF生物>^应器， 废物则自动排出。在置于TVEMF生物反应器并ii行TVEMF扩增之后约7到 约14天，血液干细胞可增加到它们初始数量的至少七倍。优选地， TVEMF扩增持续约7到10天，更优选约7天。因此不需要在TVEMF 扩增期间进行干细胞数量的测量。如上文及本申请全篇中所述，本 发明的TVEMF扩增的血液干细胞具有与天然存在的非TVEMF扩 增的血液干细胞基本上相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。TVEMF扩增完成后，TVEMF生物反应器中的细胞物质包含 本发明组合物中的本发明干细胞。对于其他应用，可从组合物中除 去或加入多种物质。本发明的另一个实施方案涉及离体哺乳动物血 液干细胞组合物，其功能为协助身体系统或组织修复、补充和再生 组织，例如，本申请全篇中描述的组织。所述组合物包含TVEMF 扩增的血液干细胞，优选其数量为原始血液来源中每单位体积血液 干细胞数量的至少7倍。例如，优选地，如果X数量的血液干细胞 以某体积置于TVEMF生物反应器中，那么TVEMF扩增后，TVEMF 生物反应器中血液干细胞的数量将是至少7X (不包括扩增过程中移 出的细胞)。尽管这种至少7倍的扩增并不是实行本发明所必需的， 但是这种扩增对于治疗目的而言是特别优选的。比如，需要时，TVEMF扩增的细胞可以只是天然存在的血中血液干细胞数量的2 倍。优选地，TVEMF扩增的细胞的范围为每单位体积天然存在的 血中干细胞数量的约4倍到约25倍。本发明还涉及包含来自哺乳动 物的血液干细胞的组合物，其中所述血液干细胞每单位体积的数量 是来自哺乳动物的天然存在的血的至少7倍；并且其中所述血液干 细胞具有与天然存在的血中的干细胞相同或相似或基^目同的三维 几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。本发明的组合物 可包含可药用载体；包括但不限于血浆、血、白蛋白、细胞培养基、 生长因子、铜螯合剂、激素、緩冲剂或低温保存剂。"可药用栽体，， 指允许将所述干细胞导入哺乳动物(优选人)的试剂。这种载体可 包括本文提及的物质，具体地，包括任何可用于输血的物质，例如 血液、血浆、白蛋白，还包括盐水或緩冲液(优选补充了白蛋白的 緩冲剂)，优选来自待引入所述组合物的哺乳动物。术语将组合物"引 入"哺乳动物意在指向动物"施用"组合物。优选地，通过静脉内对哺 乳动物施用本发明的干细胞。但是，如本领域公知地，也可应用其 它施用形式。具体地，可应用例如直接注射到口或耳，或者口或耳 附近的组织，或者对皮肤局部给药或例如皮下注射。甚至更优选地， 这种注射还包含可接受量的GCSF,例如以0.3 ng到5 ng的量，更 优选1 ng/kg多100 ng/kg，更优选5 ng/kg至'20 ng/kg，甚至更优选 6 ng/kg。施用干细胞可包含可药用载体，例如本领域的一般描述所 述。待施用的本发明扩增干细胞的量为治疗有效量(下文也有讨论)， 优选至少1000个干细胞，更优选至少104个干细胞，更优选至少105 个干细胞，甚至更优选至少107到109个干细胞的量，或者甚至更多 干细胞，比如1012个干细胞。可以以一次剂量或多次剂量施用这些 数量的扩增干细胞。如本申请所述，施用于患者的干细胞数量可受 限于通过本发明的扩增来增殖的来源血中原始可用的干细胞数量。 不限于理论地，相信在施用之后未被身体利用的干细胞将简单地通 过天然身体系统移除。"可用载体，，通常指本发明血液干细胞可在其 中存活的任何物质，即无论是TVEMF扩增之后、低温M之前或 之后、还是引入(施用)哺乳动物之前都对细胞没有毒性。这种栽 体是本领域公知的，并且可以包括多种物质，包括本申请全篇中就 此目的描述的物质。例如，血浆、血、白蛋白、细胞培养基、緩冲
剂和低温保存剂都是本发明的可用载体。期望的载体部分取决于期 望的用途。本领域已知的其它扩增方法(不使用TVEMF )不提供血液干 细胞在数量至少是天然存在血的至少七倍的扩增并且同时还保持血 液干细胞三维几何结构和细胞-细胞支持不变。TVEMF扩增的血液 干细胞具有与所来源血相同或基^M目同的三维几何结构和细胞-细胞 支持以及细胞-细胞几何结构，或保持其不变。所述组合物可包含 TVEMF扩增的血液干细胞，优选地悬浮在Dulbecco，s培养基中或 者准备用于低温保存的溶液中。所述组合物优选没有有毒颗粒物质， 例如垂死细胞以及粒细胞和巨噬细胞的有毒物质或内容物。所述组 合物可以是包含TVEMF扩增的血液干细胞的低温保存组合物，这 是通过降低组合物到-120。C到-196。C的温度，并且保持低温M组合 物在此温度范围直到其用于治疗或其它应用。如下文所讨论地，优 选在低温保存之前尽可能多的从组合物中除去有毒物质。本发明的另一个实施方案涉及使用TVEMF扩增的血液干细 胞药物组合物再生组织和/或细胞以修复皮肤、耳和口组织以及治疗 相关病症的方法，所述血液干细胞组合物是经过低温保存的或者是 刚刚完成TVEMF扩增的。可通过如静脉内注射或直接注射到待修 复的组织来将细胞引入哺乳动物体内(优i^A),以允许身体的天然 系统修复和再生组织。优选地，引入哺乳动物身体的组合物不含有 毒物质以及可造成对所施用TVEMF扩增的血液干细胞有不利反应 的其它物质。当治疗或研究需要个体血细胞，尤其是如果已经发生 疾病并且需要无该疾病的细胞时，所述细胞可便利地用于所述治疗 或研究。对于例如在生命后期发生听觉丧失的人来说，保存的扩增 外周血或脐带血可能是有用的。实施例l-TVEMF生物及^应器中细胞的实际TVEMF扩增收集外周血并如表1所示扩增外周血细胞，描述如下。A)收集与维持细胞如上文所述通过注射器从10个人类供体中收集人外周血(75 ml;约0.75xl()6个细胞/ml),并悬浮在同样体积为约75 ml的Iscove，s 改良的Dulbecco，s培养基(IMDM) (GIBCO, Grand Island, NY)
中以制备血混合物，所述培养基中补充了 20%的5%人白蛋白(HA )， 100 ng/ml重组人G-CSF (Amgen Inc" Thousand Oaks， CA)和100 ng/ml重组人干细胞因子(SCF) (Amgen)。 10个小的血样(每名 供体一个)留作对照样品。将外周血混合物置于如本文图2和3所 示的TVEMF生物反应器中。TVEMF扩增在37°C ， 6% <:02及正 常空气中02/N比例下进行。TVEMF生物反应器最初以10转/分钟 (rpm)的速度旋转，然后如本申请所述按需要进行调节，以保持外 周血细胞悬浮在生物反应器中。对生物反应器施加6 mA随时间变化 的电流。对外周血混合物施加的方波TVEMF约为0.5高斯。(频率 约10周/秒)。TVEMF生物反应器中外周血混合物中的培养基每一 到两天进行更^/更新。在第10天，将细胞从TVEMF生物反应器 中移出，用PBS洗涤并进行分析。结果示于表l。对照数据指没有 进行扩增的人外周血样品；扩增样品指TVEMF扩增后的各个对照样品。表l
对照1细胞计数310,000成活力绍0/ 对照2细胞计数330,000成活力100%对照3细胞i-数320,000成活力诉％对照4细胞+数340，咖成活力100%对照5细胞》-数250,000成活力98%对照6细胞T数360,000成活力100%对照7细胞卡卜数300,000成活力98%对照8细胞计数350,000戍活力100%4照9细胞计数加O，OOO成活力站％对照10细胞计数350,000成活力100%扩增样品l细胞计数3,200,000 对应CD34十 增加是成活力诉％扩增样品2细胞计数3,550,000 对应CD34十 增加是.成活力扩增样品3细胞计数3,350,000 对应CD34十 增加是成活力98%扩增冲羊品4细胞计数4,200,000 增加是成活力980/。扩增样品5细胞计数3,100,000 对应CD34十 增加是成活力98%扩增样品6细胞计数3,950，000 对应0034+ 增加是成活力98。/。扩增样品7细胞计数3，000，000 对应CD34十 增加是成活力98%扩增样品8细胞计数3,750,000 对应CD34十 增加是成活力诉％扩增样品9细胞计数3,000,000 对应CD34十 增加是i 成活力邻％扩增样品IO细胞计数4,000,000 对应CD34十 增加是成活力诉％从表1中可以看出，与未扩增的对照相比，外周血细胞的TVEMF扩增使得其细胞数量在10天里增加了约10倍，CD34+细 胞也有相应地增加。细胞生长的培养基每1-2天更^/更新一次。B)分析TVEMF扩增的细胞使用计数板(例如血细胞计数器之类的装置，其使用是通过将 一定体积的对照细胞悬浮液或扩增样品置于特制的带有微网的显微 镜载玻片上，并对样品中的细胞数进行计数)获得对照和扩增样品的总细胞计数。对照样品和TVEMF扩增10天后的扩增样品中的总 细胞计数的结果在表l中显示。如下测定表1中显示的相应CD34+的增加使用人CD34选 择试剂盒(EasySep阳性选择，StemCell Technologies )将扩增样品 中的CD34+细胞与其它细胞分离开，并如上文所述使用计数板进行 计数，然后使用FACScan流式细胞仪(Becton-Dickinson)进行确 认。通过克隆发生测定对CFU-GEMM和CFU-GM进行计数。通过 台盼兰排除测试测定细胞成活力(其中成活细胞是活细胞，非成活 细胞是死细胞)。在所有扩增样品中，答案"是"表示CD34+细胞以与 总细胞计数相应的量增加。操作方法-修复口组织从至少15位将要接受口腔手术(优选牙龈手术)的人类患者 中提取外周血(优选约250 ml)，并例如按以上实施例中所述进行 TVEMF扩增。还制备来自每位供体的血浆。在10天的TVEMF扩 增之后，将TVEMF扩增细胞从生物反应器中移出，并用含有5% 人血清白蛋白的肝素化盐水洗涤，然后使用例如100微米尼龙筛或 其它合适的过滤系统进行过滤，以除去细胞聚集体。有毒物质也将 被除去。接着，如下文的讨论，所述细胞可分别与约1.0ml或约20 ml各个供体的血浆混合，以制备血液干细胞药物组合物，用于将所 有TVEMF扩增细胞自体引入到W^身体。(也可应用异体引入。) 优选引入的干细胞数量在本申请中有所讨论，最优选在约1 ml或约 20 ml的体积中有约105到约109个干细胞。在5个已经接受了牙龈手术的供体中，包含1 ml血浆和 TVEMF扩增血液干细胞的血液干细胞组合物将直接注射进妣邻牙 龈手术中受损组织的口组织。在另外5个供体中，包含20ml血浆 和TVEMF扩增血液干细胞的血液干细胞组合物将注射1供体的 外周血流。这些实验的预期结果是，口腔医生监测的复原时间将显著短于 不进行细胞治疗的患者。
在上文所述条件下在动物模型上进行的实验也预期展示出使 用本发明对口组织的修复，从而使所述修复的相关病症、疾病或目的在施用本发明的组合物后得到改善，所i^艮示是基于组织学或病 理学分析，或者其它所需分析。操作方法-修复皮肤组织从至少15只兔中提取夕卜周血(优选约50 ml )，并例如按以上 实施例中所述进行TVEMF扩增。还制备来自每只供体的血浆。在 对约40 ml所收集的血进行10天的TVEMF扩增之后，将TVEMF 扩增细胞从生物反应器中移出，并用含有5%人血清白蛋白的肝素化 盐水洗涤，然后4吏用例如100微米尼龙筛或其它合适的过滤系统进 行过滤，以除去细胞聚集体。有毒物质也将被除去。接着，将5个TVEMF扩增的组合物与市售的Neosporin (Warner-Lambert)混合(优选将所有细胞与约1 ml到约100 ml、 优选约10 ml到约50 ml、在此情况下为约15 ml的Neosporin混合)， 以制备用于局部给药的血液干细胞药物组合物。每只兔有两块皮肤 擦伤(即去掉皮肤层，刮擦，而不是深入的伤口)，两块相距接近， 但是不互相接触。优选地，擦伤是(尽管本实施例涉及自体引入， 但异体引入也可使用)。优选引入的干细胞的数量在本申请中有所讨 论，最优选约105到约109个干细胞。将用于局部施用的药用组合物 直接应用于一个擦伤；另 一个应用纯Neosporin。预期覆盖所述干细胞组合物的擦伤的愈合时间将为只覆盖纯 Neosporin的一半以内。在5个供体中，将如上文所描述进行洗涤的TVEMF扩增血 液干细胞组合物重悬于5ml,自身血浆中，以制备用于静脉注射 的药物血液干细胞组合物。此组合物将直接注射进每个供体的外周 血流中。在剩下的5个供体中，只把对照血浆与Neosporin混合， 然后血浆注射l供体的血流中。同样，在注射药物血液干细胞组 合物的情况下，每只兔的两个擦J务之一用Neosporin覆盖，另一个 不覆盖任何药剂。预期注射药物干细胞组合物的兔的擦伤愈合时间将为只接受 血浆注射的M兔的一半时间以内.
在动物模型上或其他需要修复皮肤的情况下进行的实验也预 期展示出使用本发明对皮肤组织的修复，从而使所述修复的相关病 症、疾病或目的在施用本发明的组合物后得到改善，所t艮示U 于组织学或病理学分析，或者其它所需分析。还预期对也具有皮肤擦伤的人进行上述操作方法，从收集约100 ml外周血开始。预期接受注射或局部施用药物干细胞组合物的 人的擦伤愈合时间将为具有相似擦伤却只接受血浆注射的人的一半 时间以内。操作方法-修复耳组织从至少5位患听觉丧失的人患者("供体")中提取(通过注射 器抽取)外周血(优选约100ml)。优选的，在取血前，在3天中每 12小时用6 ng/kg G-CSF处理供沐，然后第四天处理一次，之后在 第四天取血。通过用分离器例如Cobe Spectra细胞分离器使所收集 细胞经过3轮连续的流式白细胞分离术来收集外周血细胞。还制备 来自每位供体的血浆。如上文实施例1所述将所述血细胞与相近量 (与所分离的血液体积相近)的IMDM混合，以制备血混合物，接 着仍如上文实施例1所述进行TVEMF扩增。在10天的TVEMF扩 增之后，将TVEMF扩增细胞从生物^^应器中移出，并用含有5% Ajfii清白蛋白的肝素化盐水洗涤，然后使用例如100微米尼龙筛或 其它合适的过滤系统进行过滤，以除去细胞聚集体。有毒物质也将 被除去。将所述细胞悬浮在每个，自己的血浆中，以制备药物血液干 细胞组合物，接着施用给每个供体。在三个供体中，将少量扩增细 胞注射到一个耳中毗邻内耳上皮毛细胞的耳组织中。在另外两个供 体中，将少量扩增细胞注射到一个耳的差^底动脉中。在使用本发明的药物血液干细胞组合物治疗后，预期功能性内 耳上皮毛细胞的数量将显著增加，优选3到20倍，并且听觉能力将 在约一个月的时间里显著改善。在上文所述条件下在动物模型上进行的实验也预期展示出使 用本发明对耳组织的修复，从而使所述修复的相关病症、疾病或目 的在施用本发明的组合物后得到改善，所i2L艮示是基于组织学或病 理学分析，或者其它所需分析。操作方法-低温M如上文所提及的，从哺乳动物(优i^A)中收集血。优选至少 从血中除去红细胞。血液干细胞(及所需的其它细胞和培养基)置 于TVEMF生物>^应器中，受到随时间变化电磁力，并且扩增。如 果在TVEMF扩增前未除去RBC,则优选在TVEMF扩增之后除去。 TVEMF扩增的细胞可低温保存。此处提供关于低温保存TVEMF 扩增的血液干细胞和包含这种细胞的组合物的方法的其他细节，具 体见下文。在TVEMF扩增之后，优选将TVEMF扩增的细胞(包括 TVEMF扩增的血液干细胞)转移到至少一个含有至少一种低温保 护剂的低温保存容器中。优选地，首先用溶液(例如，緩冲溶液或 所期望的低温保存溶液)洗涤TVEMF扩增的血液干细胞，以除去 培养基和TVEMF扩增过程中存在的其它组分，接着将其混入允许 对细胞低温保存的溶液中。这种溶液一般称为低温保存剂、低温保 存液或防冻剂。将所述细胞转移到合适的低温容器中，此容器一般 降温至-120。C到-196。C，优选约-130'C到约-150。C，并且维持在此温 度。优选在冷冻过程中緩慢且小心地降低温度，以不损伤所述干细 胞或至少使损伤最小化。当需要时，将细胞的温度(即低温容器的 温度)上升到与引^A体相容的温度(通常从约为室温到约为体温)， 然后TVEMF扩增的细胞被导入哺乳动物体内，优逸人类，例如如 上文所讨论。冷冻细胞通常有破坏性。不限于理论地，在降温过程中，细胞 内的水结水。然后可能通过对细胞膜的渗透作用、细胞脱水、溶质 浓缩、以及水晶形成而产生损伤。随着在细胞外部形成水，有效水 从溶液中被除去并从细胞中吸取水分，造成渗透脱水并提高溶质浓 度，最终破坏细胞。(讨论参阅Mazur， P., 1977, Cryobiology 14: 251-272.)不同物质具有不同的水点。优选地，待用于低温保存的血液干 细胞组合物包含尽可能少的污染物质，以尽可能使结晶和冷冻过程 中对细胞壁的损伤最小。
这些损伤作用可通过以下来降低或甚至避开(a)应用低温保 护剂，(b)控制冷冻速率，以及(c)在足够低的温度保存，以尽可 能减少降解>^应。在本发明中优选包括低温保存剂。可使用的低温保护剂包括但 不限于足量的二甲基亚砜(DMSO ) (Lovelock, J. E. and Bishop, M. W. H.， 1959， Nature 183:1394-1395; Ashwood-Smith, M. J., 1961， Nature 1卯:1204-1205 )、甘油、聚乙烯吡咯烷酮(Rinfret, A. P., 1960， Ann. N.Y. Acad. Sci. 85: 576 )、聚乙二醇(Sloviter, H. A. and Ravdin， R. Ci， 1962, Nature 196: 548 )、白蛋白、葡l^t、蔗糖、乙二醇、i-赤鲜醇、D-核糖醇、D-甘露醇(Rowe， A. W., et al.， 1962， Fed. Proc. 21:157)、 D-山梨醇、i-肌醇、D-乳糖、氯化^>^(Bender, M. A.， et al.， 1960， J. Appl. Physiol. 15:520 )、氨基酸葡萄糖溶液或者氨基酸(Phan The Tran and Bender, M. A.， 1960， Exp. Cell Res. 20:651 )、甲醇、乙 酰胺、单乙酸甘油酯(Lovelock, J. E.， 1954， Biochem.丄56:265)和 无机盐(Phan The Tran and Bender, M. A., 1960， Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104:388; Phan The Tran and Bender, M. A.， 1961 in Radiobiology, Proceedings of the Third Australian Conference on Radiobiology, IIbery， P. L. T" ed.， Butterworth, London, p.59 )。在优 选实施方案中使用DMSO。 DMSO为液体，低浓度下对细胞无毒。 作为小分子，DMSO可自由穿过细胞并通过与水结合而改变其冷冻 性来保护细胞内的细胞器，以及防止形成冰而造成的损害。添加血 浆(即，至浓度20-25% )可增加DMSO的保护效果。添加DMSO 后，细胞应保持在0。C或更低，因为约1。/。浓度的DMSO在高于4'C 的温度下;i有毒的。我选择的与TVEMF扩增的血液干细胞组合用 于总组合物的优选低温保护剂为在60至80%氨基酸葡萄糖溶液中 的20至40%二甲基亚砜溶液，或者15至25%的羟乙基淀粉溶液， 或者4至6%的甘油、3至5%葡萄糖、6至10。/。葡聚糖T10，或者 15至25。/。聚乙二醇或者75至85%氨基酸葡萄糖溶液。上文所述的 低温保存剂的量优选是整个组合物中低温保存剂的总量(不只是添 加到组合物中的物质的量)。尽管待低温保存的本发明组合物中可存在除血细胞和低温保 护剂之外的其它物质，但例如由于如上文讨论的关于冷冻机制的原
因，本发明的TVEMF扩增血液干细胞组合物的低温保存优选含有 尽可能少的其它物质。优选地，将本发明的TVEMF扩增的血液干细胞组合物冷却 到温度为约-120。C到约-196'C的范围，优选约-130。C到约-196'C，更 优选为-130 'C到约-150 'C 。受控的緩慢冷却速率是重要的。不同的低温保护剂(Rapatz, G, et al.， 1968, Cryobiology 5(1): 18-25 )和不同的细胞类型有不同的最 佳冷却速率(对于降温速度对于外周细胞存活的影响(以及对其移 植潜力的影响)可参阅如Rowe， A. W. and Rinfret, A. P.， 1962, Blood 20:636; Rowe， A. W" 1966， Cryobiology 3(1):12國18; Lewis, J. P" et aL 1967， Transfusion 7(1): 17-32; and Mazur, P" 1970， Science 168:939-949)。水变成冰时的熔化热应该尽可能小。冷却过程可通过 应用例如可编程冷冻设备或者甲醇浴方法来实施。可编程冷冻装置允许确定最佳冷却速率并促进标准的可重现 的冷却。可编程速率控制冷冻装置比如Cryomed或Planar允许将 冷冻方案调整到期望的冷却速率曲线。其它可接受的冷冻装置可以 是，例如，Sanyo Model MDF-1155ATN画152C和Model MDF-2136 ATN-135C, Princeton CryoTech TEC 2000。例如，对于10% DMSO 和20%血浆中的血细胞或者CD34十/CD38-细胞，最优速率为从0。C 到-20(TC， l到3。C/分钟。在优选实施方案中，此冷却速率可用于本发明所述细胞。盛有 所述细胞的低温容器必须在低温下稳定，并且允许快速的热传递， 以便于有效控制冷冻和解冻。密封塑料管(例如Nunc、 Wheaton cryules )或玻璃"^L可用于多个小量(1-2 ml )，而较大体积(100-200 ml)可在聚烯烃袋(例如Delmed)中冷冻，该聚烯烃fL^L在金属板 之间以便在冷却期间更好的传递热量。(骨髓细胞袋通过将其置于 -80'C冷冻装置中成功冷冻，幸好该冷冻装置提供了约3'C/分钟的冷 却速率)。在替代实施方案中，可应用曱醇浴冷却方法。甲醇浴方法特别 适合大,的对多个小物品实施常规低温保存。该方法不需要手动 控制冷冻速率也不需要记录器监测速率。在优选的方面中，DMSO
处理的细胞预先在水上冷却并转移到装满冷冻甲醇的盘中，其|^被置于-130'C机械水箱中(例如Harris或Revco )。甲醇浴和样品的 热电偶检测显示期望的1到3'C/分钟的冷却速率。在至少两个小时 之后，样品达到-80'C，然后可直接将其置于液氮(-196。C)中以永 久絲。完全冷冻之后，TVEMF扩增的干细胞可快速转移到长期低温 M容器中。在优选实施方案中，样品可低温保存在液氮(-196'C ) 中或者其蒸汽(-165'C )中。保存温度应低于-120。C，优选低于-130。C。 高效液氮冰箱的可用性大大方Y更了这种保存，所述冰箱类似于具有 极低真空和内部超绝热的大Thermos容器，使得热量泄漏和氮气流 失都保持在绝对低值。用于低温保存细胞的优选的装置和程序由Thermogenesis Corp., Rancho Cordovo， CA制造，利用它们的程序将细胞温度降低 到低于-130。C。在冷冻和保存期间细胞盛放于Thermogenesis血浆袋 中。其它水箱是市售的。例如，"BioArchive"水箱不但冷冻而且提 供低温保存样品比如本发明的血或细胞的目录，例如同时管理高达 3,626个冷冻血袋。此冰箱具有M臂，当其在得到指示时将取出特 定样品，确保不扰乱其它样品或使其暴露在较高温度中。其它市售 的水箱包含但不限于Sanyo Model MDF-1155 ATN-152C和Model MDF-2136 ATN-135C，和Princeton CryoTech TEC 2000。在TVEMF扩增的血液干细胞组合物的温度降低到低于 -120'C之后，优选低于-130。C，它们可置于装置中，比如 Thermogenesis冷冻装置。它们的温度保持在-120。C到-196。C，优选 -130'。到-150'〇。;^发明的低温M TVEMF扩增的血液干细胞组合 物的温度不应长时间处于约-12(TC。根据本发明的低温保存的TVEMF扩增的血液干细胞或其组 合物可冷冻无限长时间，在需要时将其解冻。例如，组合物可冷冻 长达18年。甚至更长的时间也是可行的，可能甚至长iiA供体的一 生。需要时，可将其中装有细胞的袋置于解冻系统中，比如Thermogenesis Plasma Thawer或Thermoline Thawer系歹寸中的其它 装置。低温保存的组合物的温度升至室温。在另一个优选解冻与低 温保护剂混合的细胞的方法中，可将保存在液氮中的装有本发明的 低温保存的TVEMF扩增的血液干细胞组合物的袋置于液氮的气相 中15分钟，然后暴露在室温环境空气中5分钟，最后在37'C水浴中 尽可能快的解冻。解冻的袋立刻用相同体积的溶液稀释，该溶液是 含有2.5% (重量/体积)Aj6l清白蛋白和5% (重量/体积)葡聚糖 40 (Solplex40; Sifra, Verona, Italy)的等渗盐溶液，接着400 g离 心十分钟。除去上清，用新鲜白蛋白/葡聚糖溶液重悬沉降下来的细 胞。可参阅Rubinstein, P. et al" Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. iVw. 7VW/. Jaw/. 92: 10119-1012 (1995 ) for Removal of Hypertonic Cryoprotectant;此优选解冻细胞方法的一种 变4t形式可见Lazzari, L. et al" Evaluation of the effect of cryopreservation on ex vivo expansion of hematopoietic progenitors from cord blood, fi騰Mat, r腦s. 28:693-698 (2001)。在细胞升温到室温后，它们可用于研究或再生治疗。解冻的 TVEMF扩增的血液干细胞组合物可直接引入哺乳动物体内，优选 人类，或者以其解冻形式用于期望的研究中。其中存在解冻细胞的 溶液可被完全洗去，并换成或加入其他溶液或按需要进行操作。在 引入哺乳动物体内之前，优选在马上将要引入之前，可将多种添加 剂加入解冻组合物(或者非低温保存的TVEMF扩增的血液干细胞 组合物)中。此类添加剂包括但不限于生长因子、铜螯合剂、细胞 因子、激素、适宜的緩冲剂或稀释剂。优选地，添加GCSF。更优 选地，对于人类，以约20到约40吗/kg体重的量添加G-CSF，甚 至再优选地，以约30 jig/kg体重的量。在引入之前，TVEMF扩增 的血液干细胞组合物可与哺乳动物自身或者合适供体的血浆、血液或白蛋白、或者其它物质(例如可伴随输血的物质)混合。解冻的 血液干细胞可用于例如检验对期望用于治疗或可用于治疗的药物是 否有有害>^应。尽管FDA尚未批准在美国将扩增的血液干细胞用于组织再 生，但是这一批准看起来即将来临。直接注射足量的扩增血液干细
胞应能够如本申请中所讨论的用于再生皮肤、耳和口组织。本发明的TVEMF扩增的血液干细胞组合物应以足够实现组 织修复或再生或者足够治疗目标疾病或病症的量引入哺乳动物体 内，优逸人类。优选地，将至少20 ml每ml含l(^到109干细胞的 TVEMF扩增的血液干细胞组合物用于任何治疗，优选一次全部使 用，尤其是当发生外伤后需要立即组织修复的情况。此量对75-80 kg 的人体是特别优选的。待引入其来源哺乳动物的组合物中的TVEMF扩增的血液干细胞的量部分取决于来源血物质中存在的细胞数量 (特别是如果可用的数量相当有限时)。引入患者的TVEMF扩增的 血液干细胞的优选范围可以是，比如，约10 ml到约50 ml的TVEMF 扩增的血液干细胞组合物，其每ml含l(T到109干细胞，或者可能 更多。尽管我们知道高浓度的任何物质施用给哺乳动物都可能是有 毒的或者甚至是致死的，但是引入所有的哺乳动物血液干细胞，例 如在TVEMF扩增后至少7倍，不可能造成TVEMF扩增的血液干 细胞过量。在使用来自多个供体或同一供体多次收集的血的情况下， 引入哺乳动物的血液干细胞的数量可以更高。同样，可引入患者的 TVEMF细胞的剂量不受从一个个体收集所提供的血数量的限制； 多次施用可更容易应用，例如每天一次或两次，或每周一次，或其 它施用时间方案。并且，在治疗组织时，所述组织类型可能准许4吏 用尽可能多的TVEMF扩增的血液干细胞或使用较小的剂量。例如， 与其他组织相比，肝脏可能是最易于治疗的，并且可能需要较少的 干细胞。应该理解，尽管上文所描述的实施方案通常涉及低温保存 TVEMF扩增的血液干细胞，但是TVEMF扩增也可以在对已经过 低温保存的、非扩增、或者非TVEMF扩增的血液干细胞解冻之后 进行。同时，如果期望低温保存，则可以在冷冻细胞之前或之后进 行TVEMF扩增。例如，许多血库有低温保存的组合物，其包含处 于冷冻保存状态的血液干细胞，以备在某时间点的需要。这些组合 物可根据传统方法解冻，然后按照此处所述进行TVEMF扩增，其 包括按照此处所述的TVEMF过程的变化形式。此后，如上文所述， 此TVEMF扩增的血液干细胞被认为是本发明的组合物。在低温保 存之前进行TVEMF扩增是优选的，例如假如发生外伤，已经扩增
了患者的血液干细胞就不需要再花费宝贵的额外数天来准备。同样，尽管不优选，但应注意本发明的TVEMF扩增的血液 干细胞可低温保存，然后解冻，然后如果不使用，再低温保存。在 冷冻所述细胞之前优选进行TVEMF扩增(即数量的增加，而不是 尺寸)。所述细胞也可在冷冻接着解冻之后进行扩增，即便在冷冻之 前已经进行过扩增。血液干细胞的扩增可能需要若干天。在立刻提供血液干细胞是 很重要的情况下，比如生死攸关的情况或外伤的情况，尤其在如果 需要在将细胞重新引入之前完成研究的情况下，可能没有数天时间 去等待血液干细胞扩增。因此，预先估计到治疗每拖延一分钟都可 决定生死的紧急情况，就特别期望从出生时就有可用的扩增血液干 细胞。还应该理解，在TVEMF扩增后经过或不经过低温M，本 申请的TVEMF扩增的血液干细胞均可引入哺乳动物，优选来源哺 乳动物(血来源的哺乳动物)。但是，这样的引入无需仅限于来源哺 乳动物(自体)；TVEMF扩增细胞也可转移给不同的哺乳动物(异 体)。还应该理解，尽管血(脐带血(优选低温保存的)或外周血(优 选新抽取的)是本发明优选的成体干细胞来源，但来自骨髓的成体 干细胞也可以以与本发明血液干细船目似的方式进行TVEMF扩增 并使用。骨髄不是易得的干细胞来源，而是必需通过釆集术 Upheresis)或其它昂贵且疼痛的方法进行收集。本发明也包括研究皮肤、口或耳/听觉病症或其它疾病状态的 方法，包括将TVEMF扩增的干细胞引入用于此疾病状态的测试系 统。这样的系统可包括但不限于例如患有此疾病的哺乳动物、用于 研究所述疾病的适当动物模型或用于研究所述疾病的体外测试系 统。如本领域技术人员所爿i^p， TVEMF扩增血液干细胞可用于研 究多种疾病可能的治疗方法。在扩增、保存、和解冻的完整过程中，本发明的血液干细胞均 维持其三维几何结构及其细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。尽管本文描述了优选的实施方案，本领域技术人员会理解本发
明包括了多种变化与改良。本发明的范围不限于上文所描述的实施 方案。
权利要求
1.修复上皮组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的药物血液干细胞组合物的步骤，所述组合物包含扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然存在的血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天然存在的血中的干细胞基本相同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。
2. 修复上皮组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液干细胞药物组合物的步骤，所^ia合物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少2倍， 其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细JI^;M目同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。
3. 根据权利要求2的方法，其中每单位体积中TVEMF扩增的血液 干细胞数目是至少7倍。
4. 修复皮肤组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液 干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含扩增的血液干细胞，其每 单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述 血液干细胞具有与天然血中的干细胞基4^目同的三维几何结构和细胞 -细胞支持以及细胞-细胞几何结构。
5. 修复皮肤组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液 干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细 胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少2倍， 其中所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基4^目同的三维几何结 构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。
6. 根据权利要求5的方法，其中每单位体积中TVEMF扩增的血液 干细胞数目是至少7倍。
7. 权利要求6的方法，其中所iUfe用步骤包括通it^部、静脉内注 射和皮下注射中的至少 一种施用方法施用所述药物血液干细胞组合 物。
8. 权利要求7的方法，其中所述哺乳动物是人类。
9. 权利要求5的方法，其在施用步骤之前还包括以下步骤 a. 将血混合物置于TVEMF生物>^应器的培养腔室中；b. 使TVEMF生物反应器中的血混合物受到TVEMF，并对血 液干细胞进行TVEMF扩增，直至每单位体积中的TVEMF扩 增血液干细胞数目是置于TVEMF生物反应器中的每单位体积 中血液干细胞数目的7倍以上；和c. 将TVEMF扩增细胞与可药用载体混合，以形成药物血液干 细胞组合物。
10. 权利要求9的方法，还包括从TVEMF扩增细胞中除去有毒物质。
11. 权利要求9的方法，其中所#混合物包含与其它血液成分分离 开的CD34+ZCD38-血液干细胞。
12. ^"复口组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液干 细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含扩增的血液干细胞，其每单 位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所^jfit 液干细胞具有与天然血中的干细胞基^目同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。
13. 修复口组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液干 细胞药物组合物的步骤，所iiia合物包含TVEMF扩增的血液干细胞， 其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少2倍，其中 所述血液干细胞具有与天然血中的干细胞基^M目同的三维几何结构和 细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。
14. 根据权利要求13的方法，其中每单位体积中TVEMF扩增的血 液干细胞数量是至少7倍。
15. 权利要求14的方法，其中所述施用步骤包括通过局部、静脉内 注射和注射进牙龈组织中的至少一种施用方法施用所itA液干细胞药 物组合物。
16. 权利要求15的方法，其中所述哺乳动物是人类。
17. 权利要求13的方法，其在施用步骤之前还包括以下步骤a. 将血混合物置于TVEMF生物反应器的培养腔室中；b. 使TVEMF生物反应器中的血混合物受到TVEMF，并对血 液干细胞进行TVEMF扩增，直至每单位体积中的TVEMF 扩增血液干细胞数目是置于TVEMF生物反应器中的每单位 体积中血液干细胞数目的7倍以上；和c.将TVEMF扩增细胞与可药用载体混合，以形成血液干细胞 药物组合物。
18. 权利要求17的方法，还包括从TVEMF扩增的细胞中除去有毒 物质。
19. 权利要求17的方法，其中所a混合物包含与其它血液成分分 离开的CD34十/CD38-血液干细胞。
20. 修复内耳组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液 干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含扩增的血液干细胞，其每 单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述 血液干细胞具有与天然血中的干细胞基^目同的三维几何结构和细胞 隱细胞支持以及细胞画细胞几何结构。
21. 修复内耳组织的方法，其包括对哺乳动物施用治疗有效量的血液 干细胞药物组合物的步骤，所述组合物包含TVEMF扩增的血液干细 胞，其每单位体积中的数目是天然血中血液干细胞数目的至少2倍， 其中所^jk液干细胞具有与天然血中的干细胞基4^目同的三维几何结 构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何结构。
22. 根据权利要求2的方法，其中每单位体积中TVEMF扩增的血液 干细胞数量是至少7倍。
23. 权利要求22的方法，其中所述施用步骤包括通过局部、静脉内 注射和注射进牙龈组织中的至少一种施用方法施用所述血液干细胞药 物组合物。
24. 权利要求23的方法，其中所述哺乳动物是人类。
25. 权利要求21的方法，其在施用步骤之前还包括以下步骤a. 将血混合物置于TVEMF生物反应器的培养腔室中；b. 在TVEMF生物反应器中使血混合物受到TVEMF，并对血 液干细胞进行TVEMF扩增，直至每单位体积中的TVEMF 扩增血液干细胞数目是置于TVEMF生物反应器中的每单位 体积中血液干细胞数目的7倍以上；和 c.将TVEMF扩增细胞与可药用载体混合，以形成血液干细胞 药物组合物。
26. 权利要求25的方法，其还包括从TVEMF扩增细胞中除去有毒 物质。
27. 权利要求25的方法，其中所i^L混合物包含与其它血液成分分 离开的CD34十/CD38-血液干细胞。
28. 用于修复哺乳动物上皮组织的血液干细胞药物组合物，所述组合 物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然存 在的血中血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天 然存在的血中的干细胞基4^目同的三维几何结构和细胞-细胞支持以 及细胞-细胞几何结构。
29. 用于修复哺乳动物皮肤组织的血液干细胞药物组合物，所述组合 物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血 中血液干细胞数目的至少7倍，其中所#液干细胞具有与天然血中 的干细胞基^目同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几 何结构。
30. 用于修复哺乳动物口组织的血液干细胞药物组合物，所述组合物 包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血中 血液干细胞数目的至少7倍，其中所述血液干细胞具有与天然血中的 干细胞基4^目同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几何 结构。
31. 用于修复哺乳动物内耳组织的血液干细胞药物组合物，所述组合 物包含TVEMF扩增的血液干细胞，其每单位体积中的数目是天然血 中血液干细胞数目的至少7倍，其中所i^jfiL液干细胞具有与天然血中 的干细胞基^目同的三维几何结构和细胞-细胞支持以及细胞-细胞几 何结构。
32. 权利要求28的组合物在制备用于修复上皮组织的药物中的用途。
33. 权利要求29的组合物在制备用于修复皮肤组织的药物中的用途。
34. 权利要求30的组合物在制备用于修复口组织的药物的用途。
35. 权利要求31的组合物在制备用于修复内耳组织的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及哺乳动物血液干细胞优选CD34+/CD38-细胞的TVEMF扩增，还涉及来源于TVEMF扩增细胞的组合物，还涉及使用所述组合物治疗疾病或病症或者修复皮肤、口或耳组织的方法。
文档编号C12N5/00GK101166820SQ200680014300
公开日2008年4月23日 申请日期2006年2月27日 优先权日2005年2月28日
发明者唐尼·拉德 申请人:雷格内泰克公司