在滤器上检测和鉴定微生物的方法

专利名称：在滤器上检测和鉴定微生物的方法
在滤器上检测和鉴定微生物的方法本发明涉及在滤器上特异检测流体中存在的一种或多种微生物的方法，包 括X寸所述微生物的核酸进行特异性瞎显扩增的步骤，本发明还涉及实现所述方 法的检测试剂盒和序列。当今，在工业或医疗活动中，对水和空气以及使用过的或一次性的工具和 材料的微生物学质量监测标准 越严格。为此，工业和健康机构需翻有使得他们尽可能早地检测微生物学污染的 工具，以能尽决并继价船寸其进行补救。传统地，微生物学分析在琼脂培养基上进行。该类型容易实现的培养允许 用剛艮进行微生物计数而且微生物保持存活，如果魏，也允许进行鉴定检测。该鉴定检测通常由提取微生物中所含核酸和用本领域技术人员已矢啲多种链反应技术之一 (PCR:聚合S每链反应或LCR:连接S辭连反应)特异性扩增所述 核酸耐賊。然而，虽然核酸扩增鉴定试验非常可靠，但是由微生物培养、从中提取核 酸以及进行上述链反应技术所组成的步骤相当耗时。为肉眼可辨，微生物需要培养至少24小时。对生长缓慢的微生物诸如分枝 杆菌，或者X寸于受环境^^牛限制的微生物，时间有时会更长。而且，核酸提取不能直接在琼脂培养基中进行，而需要在鉴定之前进行微 生物取样。最后，由不同，下多轮扩增循环所组成的PCR也有缺点，它必须在置于 热循环仪中的小尺寸管中的溶液中进行，使得需要在扩增前后承担转移核酸的 额外工作。禾,各种与固定在固相支持物上的核酸探针杂交的技术，最近发鹏来芯 片实验室(lab-on-a-chip)设备，使得在鉴定微生物步骤中节省时间。然而，该技 术生产成本高，而且不能避免核酸鉴定前的提取和转移步骤。在此斜牛下，对微生物进行计数和鉴定仍需要超过24小时，这在确保擀卖 检测产品质量的工业活动中极为耗时。例如，在用于注射药物溶液组合物的工业用水质量控制特定领±或，导入生 产链的水的质量信息事实上必须要实时获得。微生物检测必须原位进行，如果可能SA^少的设备和人员。 在所要检测水平为每升7jC仅约几个微生物时，进行该检观赂更加困难，因为这需要通ail滤来集中微生物的前期步骤。为了颇劍艮制， 一种腿检领微生物存在或不存在的方法，已由国际申请WO01/59157的申请人首次提出。该方法涉及通爐测微生物的代谢活性來缩减培养时间。对常规代谢标i战行检测，例如微生物戶欣AIP或C02的释放，由此，在 琼脂培养基上出现肉眼可见的 之前，可确定微生物是否存在。顿水中的微生物学进行监领啲实例中，将一定^f只的水(廳ml至lL) 通过滤膜过滤，以捕获水中所含微生物。然后将滤膜置于琼脂培养基上，微生 物利用该培养基开始生长。接着，回惻莫，禾拥ATP与酶(荧光素酶)反应产 生光子来检测膜表面存在的微生物的ATP。用图象分析系统检测所述发光。该系统由申请人以Milliflex^R邵id系统的名称商售，已经使得确定液体中 是否存在微生物所需的时间縮短了几个小时。该系统樹共了定量而不是定性信息。当必须确立所存在微生物的性状时或 者当特异性针对给定的微生物时，必须增加通常iliiPCR进行的鉴定步骤。如 前所述，该PCR鉴定步骤大娥加了检测期。同时，以LAMP (环介导恒温扩增)命名的核酸僻异扩增技术也已发展， 其原理在国际申请WO 00/28082, WO 01/077317和WO 02/024902中有记载。与PCR不同，该方法特点在于恒皿行(恒温条件)并可仍保持高特异性。本发明目的是提供的方法可避免以前的检测方法的缺点，所述方^^括直 接在滤器上通过扩增核酸进行检测。令人惊奇地，通常在培养禾啦酸提取后在溶液中进行的恒温扩增技术例如 LAMP技术可以在捕获了微生物的滤器，行，而无需采取培养微生物和将微 生物核酸转移至管中扩增的步骤。因此，本发明的方法允许存在于一定体积水、空气中的或固体表面上的微 生物，在仅几个微生物检观,情况下，在縮短的时间期中被特异性检出。在优选的方面，本发明允许在捕获了微生物的膜上即在膜的给定部分中原位进行分另'J计数(individual counting)。因此，本发明涉及在滤器上特异性检测流体中存在的一种或多种微生物的 方法，其特征在于包括下列步骤a) 在滤器上将流体中存在的微生物与滤器接触；b) 恒温特异性扩增来自滤器上存在的一种或多种微生物的核酸，以获得扩增产物；c) 雌在臓滤器上检测扩增产物。更特别地，本发明涉及在滤器上特异性检测存在于液体、气体中或表面上的一种或多种微生物的方法，其特征在于包括下列步骤a) 将液体、气体或表面与滤器接触，以便在滤器上捕获一种或多种微生物;b) 将一种或多种微生物中存在的核酸在滤器上特异性瞎显扩增，以获得扩增产物；C)检测所获得的扩增产物。本发明还涉及具体适誠行本发明的方法的装置、试剂盒和弓卿。下列附图目的是为了说明本发明的某^f寺征

图1: L層扩增技术的原理，所述技术适于检测一种或多种微生物中所含信使RNA，，在本发明检测方法的步骤b)中f顿。图2:来自opnL基因的DNA序列(5'》3')，其显示引物，所述弓胸用于根 据本发明的方法通过LAMP技术特异性检测铜绿假单胞菌(i^^bmomy am^'m^)。相应本发明所用引物的序列加有阴影，它们的方向以箭头表示。 图3:实施例1中进行的本发明方法的步骤。 图4:说明实施例1中描述的本发明方法的步骤b)和c)。 图5:实施例2中进行的本发明检测方法的步骤。 图6:实施例2中描述的本发明检测方法的步骤b)和c)。图7:实施例3中进行的本发明检测方法的步骤。图8:意图用于进行本发明方法的核酸扩增装置的透视图。图9:图8，的截面图。图10:没有平壁(flatwall)和封盖的图8體的截面图。图ll:图10，的顶视图。图12:图8CT的透视分解图。 图13:去除贮液器的图8装置的透视图。 图14:图13装置的横切图。 图15:图13装置的透视分解图。
具体实施方式
本发明的检测方齒吏得能够监测流体诸如液体或气体的微生物学质量以及 表面的微生物学质量。因此，本方法可在多种工业和纖产业中应用，例如农业食品或药品的生 产和再处理过程中的7jC质监测，空调系统或无尘室所释放的空气的监测，或实 验室、工厂和手术室的工作平台的无菌水平监测。该方、舰可用于诊断目的，例如用于尿路感染中的尿液分析，脑膜炎中的 脑脊髓液分析，胎儿感染或异常情况中的羊水分析，病毒感染研究中的血浆分 析，或者支气管劍巿部感染中的呼出空气分析。更通常地，与预期的应用无关，本方法可成为用于核酸鉴定的芯片实验室 方法的可替代方法。本发明方法的目标微生物通常选自以下属的病原细菌——假单胞菌属 (psew(i9附o扁)，埃希氏菌属(esc/zer/c/^),军团菌属(Ze^o"e〃a),沙门氏菌属 (似/mo股Z/a),李斯特菌属(丄&^&)，芽孢杆菌属(Bac说w),链球菌属 (S伊eptococcws), 弧菌属(P 6nb),耳P尔森菌属(论ra/ra'a), 葡萄球菌属 (加/ /^/ococcw)，分枝杆菌(，cok cten',)，志贺氏菌属(s/z扭〃a)，梭菌属 (C7os加Wwm)，弯曲杆菌属(G3w;^/o6acte/")，或气单胞菌属(Jerawo腦)；原生动 物——贾第虫属(G/or^z),内阿米巴属(E"tomoe&)，隐孢子虫属(C，toy戸W訓),环孢子虫属(Cyc/o，ra);支原体--支原体属(m少co/ /osma)禾口脲原体属(C/m^ /asma);真菌-曲霉属C4少e厂gz7/ws),念珠菌属(a^M0，或青霉菌属;以及存在于环境中的病原污染物 ——甲型肝炎和戊型肝炎病毒。该列举并不意味着限制，而是仅仅用于确定工 MLt最感兴趣的微生物。其它微生物也可为本发明感兴趣的微生物，这表示它 们也包括在本发明范围内。X寸本发明应用而言，术语"微生物"不限于细菌、真菌和酵母。其也指其它显微的活体形式，例如单细胞藻类如蓝藻，单细胞形式寄生虫如变形虫或线 虫卵，植物或动物配偶子如花粉或精子，以及甚至显微的多细胞生物体，例如 吸虫或蛔虫。根据本发明的一方面，微生物最初存在于液体、气体中或表面上。 本发明意义上的液体可为含固相悬浮物的溶液，更"继水介质溶液。气体优选由混合气体组成，例如空气，但也可延伸为由固体、液体和气体颗粒混合物所组成，例如气溶胶。表面，固体表面，例如无尘室的地板或墙。通过过滤或将污，面接角妙万述滤器，将'微生物捕获，即保留在滤器上或 所述滤器深处。本发明意义上的"滤器"是指主要成分为一种材料的介质，所述材料按其 特性，其大小和/或排列可滞留所通过液体或气体流中所含的悬浮微生物。因此，术语"滤器"可指不同类型的过滤器具，例如滤垫、滤膜或装填有 层析介质例如微珠、凝胶或树脂的微柱。在 的实施方式中，滤器的主要构成材料包被有抗体或化学基团，所述 抗体或化学基团与微生物外膜或其核酸相互作用，以帮助捕获或固定微生物至滤器可为单层或多层。通常，它由一种或多种选自下述的材料构成玻璃、 橡胶、聚四氟乙烯、戮亚乙烯)氟化物、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚醐安、聚砜、 聚醚砜、乙酰纤维素、混合纤维素和硝化纤维素、或者滤器器具领域技术人员 已知的任何材料。在雌的实施方式中，滤器是滤膜。通常，膜孔平均直径为0.1-1.5標妹，雌0.15-0.8 M,更雌0.2-0.6 M。材料雌能与方法步骤b)和c冲所掛凝湘容，特别是能与^l縱生物固定 于滤器上并释放该微生物所含核酸的醇类和醛类相容。"膜"在本申请中是指由具有两个表面的合成支持相组成的滤器，其孔有 已知平均直径。该已知平均直径使得能够Plih至少99%的具有所述平均直径尺 寸大小的微生物通过该膜。用在本发明中的膜通常有高表面粉体积比，恒定厚 度(constantthickness)i^ii 90-200 ^t。本发明的膜雌PVDF滤膜，例如Millipore Corporation公司的商业膜，商品名为MXHVWP124。本发明，的一方面，所述一种或多种微生物通过过滤被捕获在膜上，所 述过滤是通过在膜两表面施加压力差，使液体或气体通过膜孔而进行。然后，所述一种或多种微生物被滞留在膜表面和/劍莫 L中。根据本发明优选的特征，方法的步骤a)包括过滤，其目的是使液体或气体 中微生物集中MII上。当准备滞留酵母和真菌微生物时，建i^I择的平均 L径为0.5-1.5 j棘，优 选0.6-1《 。对于细菌微生物，选择的平均直径为0.2-0.8 ，雌0.3-0.5 '1絲。对于支原体型微生物和病毒，选择的直径少于0.2 '1絲，雌0.1-0.2微 米。孑L径可通过统计分析计算获得，因为通常孔是由每个都具有不规则孔隙率 的相同材料或不同材料的不同层的交叠而形成的。在过滤中i顿含疏u7JC型网的滤膜是有禾啲，戶腐疏冰型网可形成碳隨盐、不可润湿型蜡、凡士林、硅酮蜡或油、环氧树脂、聚氟乙烯、或聚苯乙烯溶液 的网络，从而糊敫生物更好地重新分布于齡膜±^而在步骤c)中能更好计数。 在不过滤的情况下，可简单地通过将微生物与滤器表面进行接触而捕获微 生物。该接触可通过主动将液体或气体朝滤器方向流动(气流、水流)或被动 禾,重力^t生物沉积于滤器上而进行。相反地，也能将滤器应用于微生物所 在固体表面。就该捕获法而言，在滤器表面覆盖有助于微生物粘附的涂层将是有利的。例如，该涂层由甘油制成。如果需要，培养固定于滤器上的一种或多种微生物的步骤可在扩增步骤b) 之前进行。该培养可通过将滤器与营养培养基具体是琼脂培养基接触，而直接 在滤器例如滤膜，行，所述培养如果适当，允许微生物数量增加而不影响所 述一种或多种微生物在滤器上的初始位置。所获，可用作步骤c)的生物材料 或取样用于其它分析，例如ATP生物发光定量。捕获在滤器^J:或深处的一种或多种微生物所含核酸主要包括双链或单链DNA和RNA。特别地，这些核酸可包括染色体DNA、叶绿体DNA、线粒体 DNA、核糖体RNA、转运RNA或信使RNA。本发明 的方面，1敛生物外壁在扩增步骤c)之前裂解以释放微生物戶;ft核酸。裂解步骤可直接在滤器上进行，例如用裂解缓冲液浸渗滤器。如果魏， 裂解步骤也可包括纯化步骤，戶腿纯化步骤包括例如在滤器表面或内部用醇对核酸进行沉淀。本发明优选的方面，将滤器捕获的含核酸微生物通过适当处理固定于滤器。 该固定步骤可防止不同微生物来源的核酸的迁移和混合。该处理包括将滤器用 固定液浸渗，所述固定液例如包括交联剂，如戊二醛、甲醛、或多聚甲醛。当 使用聚翻安S莫时，戊二醛是特别 的。本发明的另一种固定的方式包括用紫外线(uv)照射滤器，以获得滤器组 成材料与核酸之间的交联反应。在本发明方法的步骤b)中，将微生物核酸在滤器上恒温特异扩增，以获得 扩增产物。本文中特异扩增尉旨与模板核酸互补的特异弓l物的杂^0 弓l发的核酸聚合 反应，从而再产生全部或部他含模板核酸的序列，。与PCR技术不同，本发明的扩增步骤b)无需驗的循环变化，因此，既不 需要^ffi热f盾环仪，也不需要使用用于确保向反应介质的有效热传递的相关小 尺寸耗材。本发明 的方面，扩增步骤在滤器上进行，即在滤器表面或内部进行， tt^在控制温度的封闭环境中进行。通常，，保持在35和9(TC，优选50和 70°C，更，60和65。C。恒温扩增核酸的各种方法可用于本发明方法中，例如NASBA技术(基于 核,列的扩增)，或TMA(转录介导扩增)，其允许获得单链RNA扩增子[Nature, 1991,350:91-92]。本发明,的扩增技术为LAMP技术，通过所述LAMP技术DNA模| 过形成茎环的扩增子而得以在产生。LAMP的技术原理记载在国际申请WO00/28082中。本发明中该技术的雌改进如图1戶标。LAMP型扩增技术慰旨任何衍生自LAMP技术盼恒温扩增技术，至少包括 下列步骤具有链取代活性的DNA聚合酶通过特异性"FIP"弓嫩(正向内引 物)，自t鞭核齢成与模板核MS补的DNA链。FIP引物的特征在于，它以5' 部分而不是3'部分与模板杂交。事实上，其3'部分具有可随后与所形成的互补 f游列之一进行杂交的序列。由此， 一旦合成互补链，FIP的3'部分倾向于与 合成链自身杂交而产生茎环结构。该茎环结构然后在后续扩增步骤中再生成。LAMP型扩增，要求有"BIP"第二引物(反向内引物)，其与FIP功能 相同但是在相反^lh。更4M地，使用F1、 F2、 F3 (F:正向)和B1、 B2、 B3 (B:反向)互补引物。Fl、 F2、 F3引物对应编码f游列，而B1、 B2、 B3引 物对应互补 歹|」。F3和B3对应扩增片段5'端，F2和B2对应FIP和BIP 5， 端序列，而F1和B1X寸应FIP和BIP3，端序列的互补序列(称为Flc和Blc)。根据扩增核酸类型，DNA变性期在扩增步骤初期是必要的，戶腐DNA变 性;M过加热到60-8(TC使双链DNA分子的DNA链分离。通常，LAMP型扩增技术^ffi单链或双链DNA作为初始模板。本发明方^(^的方面，初始模板为cDNA。本发明更tt的方面，微生物RNAs用逆转录麟卩BIP弓l物预先逆转录。 如图1所示，该逆转录使得可获得含茎环结构的cDNA，从而使得LAMP型扩 增直接开始。本发明甚至更优选的方面，预先逆转录步骤所用的微生物RNA为信使 RNA。实际上，信使RNA与其转录DNA^T相比，优势在于数量较多。因此， 其可降低本发明方法的检测阈值。LAMP型扩增技术雌包括游列鹏7K平，额外弓嫩环F和环B与扩增 产物进行杂交的P介段。该弓l物可促进自环起始的、含扩增产物的新互补链的合 成，其使得扩增产物的形成速度增加。LAMP型技术获得的扩增产物，通常为含多茎环结构的双链DNA分子。 扩增产物的大小作为合成环数量的函数而变化。通常，扩增法终末期有多种大 小的片段共存而形成图4所示类型的电泳图。本发明{趟的方面，扩增产物检测步骤c)题过直接或间接利用断己^^ 的方法进行，可允许用荧光、比色或化学发光检测扩增产物。然后用图象分析仪记录断己分子劍個谱和标己^ 在滤器上的位置。通 过适当处理信号，特别魏过消除非特异性扩增的寄生(parasitic)信号，可原位 观察扩增产物。当使用膜时，这特别有用，因为大表面积的膜可允许进行精确 定量和定性。通过比色或荧光检测扩增产物的方法，为本领域技术人员所已知。 雌地，本发明方法所用检测方法具有特异性，且可允许单独鉴定已经扩 增核酸的微生物。检测方法例如包括，在本方法的步骤b)中将修饰的嘌呤或嘧啶碱基作为扩 增反应底物，掺入扩增产物中。iM地，标记的嘌呤或嘧啶碱基为dNTP，更优选为dUTP。另一检测方法包括，在步骤b)终末期将所获扩增产物与一种或多种标记特异性探针杂交。可以使用各种不同类型的探针，例如PNA型探针(肽核酸)即 嘌呤和嘧啶碱基取代多肽链而形成的探针，其空间结构类似DNA空间结构 [Nielsen, P. E. et al. (1991) Sequence selective recognition of DNA by strand所用探针优选"分子信标"型探针，即它具有荧光团、淬灭基团和茎环结 构，当探针与扩增产物杂交时才产生荧光。当用杂交探针检测扩增产物时，进行扩增产物预变性步骤证明是必要的， 具体目的在于分离DNA链。本发明方法的另一检测方飽括使用特异性配体，雌^H己的抗原和抗体。 在该情况中，用一种或多种作为抗原的分子例如双氧素(dioxygenin)标记{針布 的嘌呤或嘧啶碱基、或者甚至修饰的特异性探针，所述抗原能被抗体例如双氧 素抗体所特异性识别。另外，可以将检测探针与抗体偶联，然后与标记的抗原 相接触。抗体或抗原可结合荧光团，例如FITC (—种特定形式的异硫氰酸酯)。 .X寸斷布嘌呤或嘧啶鹏或特异性探微行标记，可3M方妇寸性同位素(H3, P32， P33, S35...)或非方謝性产物例如生物素而进行，其中戶脱生物素舰向含有 偶联的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的溶液中加入酶进行检测，所述酶例 如Raifort过氧化物酶或者大豆种子过氧化物酶或碱性磷酸酶。当这些酶底物分 散于例如膜表面时，这些S割每释放出产生可检测的发光反应的光子。本发明fei己雌方、跑括，将上述杂交体或配体与荧光針或荧光团偶联。 具有不同皿光谱的荧光团，，在检测步骤c)中使用，其中所述荧光团与用 以识别不同微生物来源的扩增产物的配体或探针偶联。为此，可tt^使用的荧 光团为，例如Molecular Probes公司生产的ALEXA FLUORINE⑧市售荧光团或 Dyomics公司生产的DY，市售荧光团，因为他们具有不同的對t光谱。由此， 对不同种类微生物的平行检观诚为可能。经过适当图象处理后，颜色代码可对 应每种微生物，邮t允许鉴定每种受检种类的不同微生物或集落。当在作为滤 器介质的膜上进行时，该方法可掛共特别优质的图象。也可以用称为"量子圆点"及商品名为Qdc^的极细颗粒标记步骤C)中所用 的探针或配体。该极细颗粒是由纳米晶体所组成的无机荧光团，该荧光能长时 间稳定。它们特别适合应用于检领懦要通过图象分析仪在较长时间中进行数据 收集的少量革E目标。"量子圆点"也可与多色标记兼容，因此，它们也允许同时 检测不同种类微生物。本发明范围中，当使用膜为滤器时，为了避免组成膜的合成材料产生的荧光，雌i顿近红外荧光染料，例如LiCo,市售的名称为IRdye 700和IRDye 800 近红外荧光染料，或Dyomics 的例如名称为DY-700, DY-730, DY-750和DY-780的近红外荧光染料。实际上观察到，膜在近红外通常发很少的荧光。本发明方法目的为，在气体、液体或表面上检测少于1000个的同种微生物，优选少于50个的同种微生物，更tt^少于5个的同种微生物，甚至低至只有1个的给定种的微生物。为了避免微生物或其核酸在上述方法步骤之一期间在滤器表面上发生位移，特别是当滤器为滤膜时，4顿限制所述表面各区之间发生交换的手段是有利的，戶，手段可M反应溶^a行操作。限制这种交换的一禾中方齒列如包括，M浸润有反应液的滤垫将反应液与微生物或核酸接触。浸润滤垫例如当其置于膜表面时，可局部递送一定量体积的足以使反应发生但不溢向相邻区域的反应液。限制交换的另一方 跑括，以 繊形式配制反应液，雌丙烯醐安凝胶。 本发明另一种限制交换的方跑括，在滤器上设置垂直分割物以在滤器上划出不同区域。有利地，该分割物的设计能在膜表面提供一定体积，以容纳反应液。i^ii也，分割物的开邻为形成多小室的网格，所述小室与滤器保持接触。 本发明优选的方面，该方法用于在滤器上特异检测液体中所含的一种或多个铜绿假单胞菌(i^^oww目aeragf"ora)种的细菌，其特征在于其包括下列步骤a) 将液体用滤器过滤，雌用滤膜过滤；b) 液体中所含细菌捕获于戶皿滤器上；c) 将这些细菌中的铜绿假单胞菌(/^ewdomo皿aemgi) ara)的核酸用LAMP型扩增在滤器表面或内部恒温特异性扩增，特另哋，戶脱LAMP型扩增 需要至少一个包含选自下列序歹啲引物seq jo No. 2， seq n) No. 3， SEQ n)No. 4， SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6，和SEQ ID No. 7;d)检测滤器上所获扩增产物。本发明特别优选的方面，用LAMP型技术扩增铜绿假单胞菌(i^^77w, am/gz'ra—核^^f用的弓l物如下 -F3 : CCTCCAAGGGCGGCGATGC (SEQIDNo.2)-B3 : TGCCTTTCAGGTCnTCGCGTGT (SEQIDNo.3)-FIP: CTGCCGTCAACGGCACCGCTTTTCCGGTGAAGGTGCCAATGGC (SEQIDNo.4)-BEP: GCGTGCGATCACCACCTrCTACTTTTCAGAGCGCGCATGGCTTCC (SEQDDNo.5)-LOOP F: CCTGCGTTCGGGTCGACGC (SEQIDNo.6)-LOOPB: CGAGTACGACAGCTCCGACC (SEQIDNo.7)这些引物允许扩增SEQ ID No.l所示铜绿假单胞菌(i^油7wwos aemg/"cwa)的区域(qpr丄基因区域)。优选在步骤b)中逆转录铜绿假单胞菌(i^Womo蘭aerwgz)7ora)所含信使 RNAs，以获得含SEQIDNo.l序列的cDNA，然后再利用LAMP型扩增技术进 行扩增。本发明的另一方面涉及核酸扩增装置，戶;M装置适合执行上述本发明方法。该装置含有用于接受要扩增的核酸的滤器(1)，其4寺征在于它包含主体(2)， 所述主体(2)用于限定内部体积并具有用于使#^这个内部体积内保持滤器(1) 与不可渗透平壁(3)以及与在滤器(1)表面形成多个小室的网格(4)相接触 的工具。iMi也，小室被设计成不同大小和几何形状，使其可以容纳一定量体积的 反应液，通常为1-10(^1， i^l-50pl，更优选3-10nl。装置的主体(2)可以具有适于与滤器(1)夕卜周酉哈的侧翼(5)，使得滤 器可以lii外周倚靠戶M侧翼(5)而固定。平壁(3)也可以保证将多 L滤器(1)的外周倚靠戶诚侧翼(5)紧固。平 壁相对于主体可分离，而且具有横向延伸的裙边(6)。在此瞎况下，有利地，主体(2)具有与裙边(6)配合的套件(7)，所述套件的形状为背离平壁(3) 向外开口。网格(4)可独立于主体(2)，也可与主体(2)制成为单件。当网格独立 于主体时，其能凹脏体，而使分隔的小室与滤器表面均匀接触。为了能够装 填等量反应液，小室iM为相等大小且规则的正方形或平行六面形。当网格与 主体一体时，为了避免小室之间的交叉污染，有利地，滤器可以被密封在网格 上。本发明的另一方面，该装置具有与主体(2)相连的]C:液器(9)。这个贮液 器用于盛放经过滤器(1)过滤的液体(其为过滤滤器)。例如在真空泵辅助下 进行，其替代平壁(3)与套件(7)配合。接着液体中所含微生物被捕获于滤 :^入口或上游部分。 一旦该操作完成，平壁(3)将以密封方式重新置于滤器下表面或下游表面o为避免过滤前液体污染，可以给贮液器加上可分离的封盖(8)。贮液器(9)可以有利地M易碎区(fongiblezone) (10)与主体(2)相 连，使得一旦过、赚作完成，通过在贮液器上部水平边缘施加从上至下的强压 力，而将IC液器分离。本发明的,方面，可分离封盖(8)可以用于在易碎区(10) 7K平轮流关 闭贮液器(9)和所述内部体积。如图13和14所示， 一旦封盖在易碎区附近关闭，则可分离封盖(8)位于 网格(4)对面以关闭戶腿内部体积。 状的装置使得滤器皮限定于由平壁(3)、 主体(2)与封盖(8)所限定的体积中，而且被网格(4)垂直地分割。该体积 用于接收扩增反应溶液，可选地用于本发明方法其它步骤，例如如上所述的纯 化、固定和洗涤步骤。该体积iM被密封使得没有溶液损失。将滤器限制在縮小的反应体积内对在良好的条件下实现扩增反应是重要 的。事实上， 一方面，必须避免来自外源环境的污染，另一方面，酶反应无需 在过大体积中进行。因为酶试剂比较昂贵而且需要均一地调节温度，因此将滤 器限制在縮小的反应体积中是需要的。最后，需要避免反应溶液大量蒸发。4Mffi过短暂移除封盖、将溶液施于网格、使用微吸管或蒸发器来^ff述溶液沉淀。溶液体积可以超出或不超出网格高度。本发明装置优选的方面，平壁(3)带有排水孔(11)，而且如果需要，还 带有用于关闭排水孔(11)的塞子(12)。在本发明方法的扩增或标记步骤后， 例如，可以小心移除溶液而不会过多的使位于滤器上的核酸悬浮。 一旦扩增和 禾示记步骤完成后，为了f艮据所选技术分析滤器，例如利用图象分析皿行生物 发光分析，可以只保留带有滤器的，主体，或者如果适当，只需保留滤器。本发明另一方面涉皿行本发明检测方法的试剂盒。该试剂超少包括 滤器，雌滤膜；-允许核酸盼恒温扩增的一种或多种特异性弓l物。该试剂盒也可包括含聚合酶的扩增溶液、裂解溶液、，含戊二醛、甲醛 或多聚甲醛的固定溶液、终止反应的阻断溶液、以及含本申请所涉及的检测试 剂之—的检测溶液。"使得核酸直温扩增的特异性引物"尉旨，在DNA聚合酶存在情况下能 杂交并引发聚合反应的分子，例如LAMP型扩增中的FIP和BIP寡核苷酸，或 者在例如NASBA型扩增时，是在RNA聚合酶存在盼膚况下。本发明特别用于检测铜绿假单胞菌(尸^dbmo歸"m^'"o—的试剂盒，包 括至少一禾中含有选自下列DNA序列的寡核苷酸SEQ ID No.2, SEQ ID No.3， SEQ ID No.4， SEQ ID No.5, SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。本发明另一方面涉及通过扩增铜绿假单胞菌(尸^db"w膨aeragz'"ora)所含核酸而特异性检测该细菌的寡核苷酸，特征在于其核苷 列含有选自下列的 序列SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ LD No.6和 SEQIDNo.7。以下实施例目的是为了更详细地说明本发明。 实施例1本申请图4所示i，描述了根据图1描述的LAMP技术扩增仅50个铜绿 假单胞菌(尸^dbmo膨aen/gzy7ora)细胞的信使RNA。该过禾Mj^用弓卿为本申请 图2所记载的引物。为能精确检测处理细胞数量，从细菌提取核酸，并在置于63"C7JC浴的管中的25pl溶液(2 pmol4U FIP & BIP寡核苷酸;1 pmol/pl loop F & loop B寡核苷酸; 40 mM Tris HCl pH 8.8中的0.2 pmol/pl F3 & B3寡核苷酸，，20 mM KCl， 0.6 M 甜菜碱，1.5 mM各dNTP + 0.2 mM UTP生物氣20 mM (NH4)2S04， 8 mM MgS04, 0.1% Triton xlOO表面活性剂，0.005 U/pl AMV RTase， 0.32 U/jol丑对DNA聚合 酶)内扩增3小时。扩增在下列^i牛下进行■管1:处理50 ，绿假单胞菌(/ aen^'"o^)细胞；-管2:无细胞对照；-管3:无细IW照+dUTP生物素■管4:处理50个细胞+dUIP生物素在琼脂 mi:观察扩增产物，确定反应混合物1和4中存在扩增产物，而 混合物2和3中不存在扩增产物。 将四种反应的产物置于尼龙膜。将膜接着用阻断液(Pierce阻断缓冲液+ 1% SDS)温育45併巾，然后与 Raifort过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白的溶液(lmg/ml)接触。所述溶液 以1:750稀释于阻断液中；温育45分钟后，用洗涤液(含Tween②表面活性剂的 PBS， 0.2%v/v)润、;^莫30併中。将Pierce Chemical公司出售的黑萝卜过氧化 物酶的基于发光氨的底物(luminol-based substrate of black radish peroxidase)喷至膜表面，使得发光反应发生。图4的C点显示了由分析仪(CCD照相机)图象处理后所获的图象。对 于反应混合物4，生物素所t斜己的扩增产物与过氧化物酶之间的反应可以很容易 地观察到。该实验显示，从与50个微生物例如铜绿假单胞菌(尸^dbwo"osam/g^ra) 细胞相当的核M所获得的扩增产物能鄉上容易地检领倒。实施例2图4所示的另一试验描述了将约130个铜绿假单胞菌(fteWowo, am^"ora)细胞施加于膜上(MXHVWP124)。在此应用中，将膜室温下置于1.5ml固定液(0.25%戊二醛于95%工业乙醇 中)浸润过的纤维素垫上5射巾，然后室温^B喿5分钟。将膜置于密封Petri盘中，然后加入0.5ml扩增液(2 pmd4d FIP & BIP寡 核苷酸；1 pmol/pl loop F & loop B寡核苷酸；40 mM Tris HC1 pH 8.8中的0.2 pmol/(ol F3 & B3寡核苷酸，20 mM KCl, 0.6 M甜麵，1.5 mM各dNTP+0.2 mM UTP生物素，20 mM (NH^SO" 8 mM MgS04, 0.1% Triton X100表面活性剂， 0.005 U/MlAMVRTase, 0.32 U4ilDNA聚合酶)，之后，63。C温育150射中。接着将膜用阻断液(Pierce阻断缓冲液+ 1% SDS)温育45 ^H中，然后与 Raifort过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白的溶液(lmg/ml)接触，所述溶液 以1:750稀释于阻断液中；温育45^H中后，用洗涤液(含Tween⑧表面活性剂的 PBS， 0.2%v/v)润^鹏30分钟。将Pierce Chemical公司出售的黑萝卜过氧化 物酶的基于发光氨的底物喷至膜表面，4吏得发光反应发生。用Milliflex Rapid 系统记录信号。结果显示于图6 B和C部分。在图6的C部分中，可容易观察到两个对应 于初始施加至膜的细胞的扩增峰。平行地，回收用于扩增的溶液并用琼脂糖凝胶电泳分析。该结果显示在图 6的B部分中。可容易观察到部分扩增产物在扩增溶液中出现。该实验显示，从与130个微生物例如铜绿假单胞菌(/^wdbwoms am^'"ora) 细胞相当的核酸量所获得的扩增产物能容易地在膜上检测到。这些部分扩增产 物从腺划兑并且也能^ffi电泳检测。实施例3图6所示另"H，描述了用图5所示装置过滤100ml溶液。过滤后，将戶脱装置室温下置于用1.5ml固定液(0.25%戊二醛于95%工业乙醇中)浸润过的纤维素垫上5力H中。将膜室温下千燥5併中，然后将该装置底部用密封盒密封，以避免温育期间渗漏。将1.5 ml扩增液(2 pmol4U FIP & BIP寡核苷酸；1 pmol/|i loop F & loop B 寡核苷酸;40 mM Tris HC1 pH 8.8中的0.2 pmol/(i F3 & B3寡核苷酸,20 mM KCl， 0.6 M甜麵，1.5 mM各dNTP+0.2 mM UTP生物素,20 mM (NH4)2S04， 8 mM MgS04,0.1%Triton X100表面活性齐U, 0.005 U/|iAMVRTase, 0.32 U小1DNA聚 合酶)分布于该體的膜上，然后用封盖封住该装置上部，以避免63°0温育150分钟期间蒸发。接着将ra阻断液温育45併中，然后与Raifort过氧化物酶复，霉抗生 物素蛋白溶液(lmg/ml)接触，戶腿溶液以1:750稀释于阻断液中；温育45分 钟后，用含0.2。/。v/vTween②表面活性剂的PBS润洗膜30分钟。将Pierce Chemical 公司出售的黑萝卜过氧化物酶的基于发光氨的底物喷至膜表面，使得发光反应 发生。用Milliflex Rapid系统记录信号。
权利要求
1. 在滤器上特异性检测存在于流体中或表面上的一种或多种微生物的方法，其特征在于包括下列步骤a)将存在于流体中或表面上的微生物与滤器接触；b)恒温特异性扩增来自存在于所述滤器上的一种或多种微生物的核酸，以获得扩增产物；c)检测所述的扩增产物。
2、 在滤器上特异检测存在于液体、气体中或表面上的一种或多种微生物的 方法，期寺征在于包括下列步骤a) 将戶，液体、气体或表面与滤^t妾触，以将所述一种或多种微生物捕获 在滤器上；b) 在滤器上恒温特异性扩增戶脱一种或多种微生物中存在的核酸，以获得 扩增产物；c) 在戶腿滤器上检测所获得的扩增产物。
3、 权利要求1或2的方法，其特征在于在步骤a)中，戶腿一种或多种微生物^1过使液体或气体经过0M滤器而捕获的。
4、 权利要求1或2的方法，其特征在于在步骤a)中，戶脱存在T^体中或 表面上的一种或多种微生物是通过将所述微生物与滤器紧密接触(impaction)而 捕获的。
5、 权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于所述待检测的一种或多种微 生物包含在含水介质中。
6、 权利要求"中任一项的方法，其特征在于所述待检测的一种或多种微 生物包含在空气中。
7、 权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于步骤b)中扩增的核酸由DNA 组成。
8、 权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于步骤b)中扩增的核酸由这样 的cDNA组成，所述cDNA通过A^f述一禾中或多种微生物所含RNA起女織行 的额外的特异f，转录步骤而获得。
9、 权利要求8的方法，其特征在于逆转录步骤的起始RNA是戶脱一种或多种微生物中所含的信使RNA。
10、 权利要求7-9中任一项的方法，其特征在于所述核酸或逆转录所获 cDNA在步骤b)中通过LAMP型扩增技术扩增。
11、 权利要求10的方法，其特征在于所述LAMP型扩增技术包括下述的 阶段，其中环F和环B弓I物在扩增产物中存在环的水平杂交，以增加戶脱扩增 产物的形成速度。
12、 权利要求l-ll中任一项的方法，其特征在于步骤c)中所检测的扩增产 物由DNA纟M。
13、 权利要求7-9中任一项的方法，其特征在于所述核酸或逆转录所获 cDNA在步骤b)中M31NASBA (基于核,列的扩增)或1MA (转录介导 扩增)技术扩增。
14、 权利要求1-13中任一项的方法，^#征在于将标记物掺入至步骤b) 所获的扩增产物中，以使得在步骤c)中检测所述扩增产物。
15、 权利要求14的方法，其特征在于掺入扩增产物的^i己物为^H己的嘌呤 或嘧啶碱基。
16、 权利要求14的方法，其特征在于掺入扩增产物的新己物由标己的引物 组成。
17、 权利要求16的方法，其特征在于掺入扩增产物的标记的弓l物由权禾腰 求12所限定的环F禾口/， B弓l物所纟M。
18、 权利要求14-17中任一项的方法，其特征在于掺入扩增产物的标记物 与配体偶联，其中戶脱配体然后与能和该配体相互作用的标记*吁反应。
19、 权利要求18的方法，其特征在于所述配体为生物素。
20、 权利要求19的方法，其特征在于在步骤c)中，将含生物素的扩增产物与偶联有允许其被检测的^ 的链霉抗生物素接触。
21、 权禾腰求is的方法，其特征在于戶;M配体由抗原或抗体乡賊，其中所述抗原或抗体然后會^与标己的抗体或抗原反应。
22、 权利要求21的方法，其特征在于在步骤b)中，掺入扩增产物的标记物与7又氧素偶联。
23、 权利要求22的方法，其特征在于在步骤c)中，将含双氧素的扩增产物 与偶联有允许其被检测的分子的抗双氧素抗体接触。
24、 权利要求20-23中任一项的方法，其特征在于所述能与配体相互作用 的标记的分子与黑萝卜过氧化物酶或^种子过氧化物,叕合。
25、 权利要求20-23中任一项的方法，^T征在于戶脱能与配体相互作用 的标记的分子与碱性磷酸酶缀合。
26、 权利要求14-25中任一项的方法，其特征在于掺入扩增产物的标记物 允许荧光检测。
27、 权利要求26的方法，其特征在于戶脱允附广增产物用荧光检观啲針 在近红外具有刻才光谱。
28、 权利要求1-12中任一项的方法，其特征在于在步骤c)中，将步骤b)所获扩增产物与标记的特异性杂交探,行杂交。
29、 权利要求28的方法，其中戶腿杂交探针用权利要求18-27任一项中所述的荧光分子、配体、抗体或抗原进行iH己。
30、 权利要求28或29的方法，其特征在于*射己的特异',交探针为PNA型探针。
31、 权利要求1-30中任一项的方法，其特征在于步骤c)戶;Mx寸一种或多种 微生物的检测直接在滤器Jlit行。
32、 权利要求1-31中任一项的方法，其特征在于所用滤器的平均 L径为 0.1-1.5〗綠，雌0.15-0.8 3絲，0.2-0.6〗綠。
33、 权利要求1-32中任一项的方法，其特征在于所述滤器由一种或多种选 自聚四氟乙烯、聚(亚乙烯)氟化物、聚碳酸酯、聚翻安、聚砜、聚醚砜、乙酰纤 维素、混合纤维素酯、和硝化纤维素的材料所舰。
34、 权利要求1-33中任一项的方法，其特征在于其进一步包f趟过将戶腿 滤器与营养培养基撤虫而培养步骤a)中所述滤器上所捕获的一种或多种微生物 的步骤。
35、 权利要求1-34中任一项的方法，其特征在于其进一步包括裂解滤器上 所捕获的一种或多种微生物的细胞壁以释放所述一种或多种微生物所含核酸的 步骤。
36、 权利要求1-35中任一项的方法，其特征在于其进一步包 辞(J用ATP生物发光检测戶，一种或多种活体微生物的存在的步骤。
37、 权利要求1-36中任一项的方法，其特征在于其进一步包括将微生物和域来自所述微生物的核酸固定在滤器上或滤器深处(in the depth of the filter)的步骤。
38、 权利要求37的方法，其特征在于固定步骤包括用固定液处理所述一禾中 或多种微生物或者微生物的核酸。
39、 权利要求38的方法，其特征在于固定液含有交联剂，戶腿交联剂选自 戊二醛、甲醛和多聚甲醛。
40、 权利要求37的方法，其特征在于固定步骤包括用UV辐射所述滤器、 其上所捕获的一种或多种微生物或微生物的核酸。
41、 权利要求40的方法，其特征在于将戶;M—种或多种微生物或其核酸固定于含基于聚酰氨的材料的滤器上。
42、 权利要求141中任一项的方法，其特征在于来自同一流体的多种类型 的微生物可在同一滤器上平行地特异性检出。
43、 权利要求142中任一项的方法，其特征在于所检测的一种或多种微生 物选自细菌、病毒、原生动物、支原体、霉菌和酵母。
44、 权利要求143中任一项的方法，其特征在于所检观啲一种或多利微生 物存在于水这种液体中。
45、 权利要求14中任一项的方法，其特征在于戶;M微生物为铜绿假单胞菌0
46、 在滤器上特异性检测液体中所含一种或多种铜謝叚单胞菌的方法，其特征在于包括下列步骤 a)将液体用滤器过滤； b滩鹏夜体中所含细菌捕获在滤器上；c) 将这些细菌中所含的铜绿假单胞菌的核酸ffl31 LAMP型扩增在滤膜表面或内部进行恒温特异性扩增，戶;M扩增禾,至少一种包含选自下列序列的引物:SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3， SEQ ID No. 4， SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6，和SEQ ID No. 7，；d) 检测滤器上所获得的扩增产物。
47、 权利要求46的方法，其特征在于对细菌所含RNA进行逆转录步骤以 获得含序列SEQ ID No.l的cDNA，戶脱LAMP型扩增AAiff述cDNA起始进行。
48、 权利要求1-47中任一项的方法，其特征在于所述滤器为滤膜。
49、 寡核苷酸，该寡核苷酸允许通过扩增铜绿假单胞菌所含核酸而特异性 检测该细菌，其特征在于其核,列包f離自SEQ ID No. 2至SEQ ID No.7的序列。
50、 用于在滤器上特异性检测一种或多种微生物的试齐睑，其包括-至少一种允许用LAMP型扩增技术进行扩增的特异FIP弓卿。
51、 权利要求49或50的试剂盒，其特征在于恒温特异性扩增存在于滤膜 上的核酸的手段包^S行LAMP型扩增所需的FIP和BIP寡核苷酸。
52、 权利要求50或51的试剂盒，戶腿试剂飾刊寺异性检测滤膜上的铜 绿假单胞菌，其包括-至少一种包括选自SEQ ID No. 2至SEQ ID No.7的核苷,列的寡核苷酸。
53、 权利要求50-52中任一项的试剂盒，其特征在于所述滤器为滤膜。
54、 用于謝于权利要求1-48的方法的核酸扩增装置，包括用于接受待扩增 的核酸的滤器(1)，其特征在于该装置包含主体(2)，所述主体(2)限定内部体积的并配有这样的工具，戶;M工具使得在该内部体积内保持滤器(O与不可透性平壁(3)以及与在滤器(1)表面形成多个小室的网格(4)相接触。
55、 权利要求54的装置，其特征在于所述小室可含有的反应液体积为 1-100^1，雌3-攀
56、 权利要求54或55的體，其特征在于主体(2)具有适于与滤器(1) 外周配合的侧翼(5)。
57、 权利要求56的装置，其特征在于滤器(1)舰其外周倚靠所述侧翼 (5)而固定。
58、 权利要求54-57中任一项的驢，欺寺征在于平壁(3)保证滤器(1)的外周倚靠戶;f^侧翼(5)。
59、 权利要求54-58中任一项的装置，其特征在于网格(4)与主体(2) 制成为单件。
60、 权利要求54-60中任一项的装置，其特征在于平壁(3)相对于主体(2) 是可分离的。
61、 权禾腰求60的装置，其特征在于平壁(3)有横向延伸的裙边(6)， 并且主体(2)有用于与裙边(6)配合的套件(7)。
62、 权利要求54-61中任一项的装置，^it征在于该装置还具有可分离封 盖(8)，该可分离封盖(8)适合置于网格(4)对面以关闭所述内部体积。
63、 权利要求54-62中任一项的装置，期寺征在于其具有与主体(2)相连 的贮液器(9)。
64、 权利要求63的装置，其特征在于C液器(9)通过易碎区(10)与主 体(2)相连。
65、 权利要求64的装置，其特征在于该 还具有可分离封盖，该可分离 封盖可用于在易碎区(10) 7jC平轮流关闭lt液器(9)和所述内部体积。
66、 权禾腰求54-65中任一项的装置，其特征在于平壁(3)拥有排水孔(11)。
67、 权利要求54-66中任一项的装置，其特征在于滤器(1)为滤膜。
全文摘要
本发明涉及在滤器上特异检测流体中存在的一种或多种微生物的方法，其特征在于包括下列步骤a)将在流体中或表面上的微生物与滤器接触；b)恒温条件下特异性扩增滤器上来自微生物的核酸以获得扩增产物；c)检测扩增产物。本发明还涉及适于用于实现本方法的装置、试剂盒和寡核苷酸。
文档编号C12Q1/24GK101223285SQ200680014393
公开日2008年7月16日 申请日期2006年4月26日 优先权日2005年4月29日
发明者F·马克, S·奥雷塞尔 申请人:米利波尔公司