改善的纤维素酶的制作方法

专利名称：：改善的纤维素酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的纤维素酶融合蛋白，含有这些纤维素酶融合蛋白、表达载体、宿主细胞的制剂和组合物及其制备方法，以及所述纤维素酶、制剂和组合物在纺织品、去污剂和纸浆以及造纸业中的应用。
背景技术：
：纤维素是由葡萄糖残基通过/5-1,4键相连而成的线性多糖。在自然界中，纤维素通常与木质素以及半纤维素相连，例如木聚糖和葡甘露聚糖。纤维素水解酶能够水解纤维素，其可由各种各样的细菌和真菌产生。纤维素酶是工业的重要用酶，目前的年市售值为约1.9亿美元。在纺织行业中，纤维素酶被用于粗斜纹棉布(denim)的修整，从而在生物石磨(biostoning)过程中在粗斜纹棉布衣物中造成时尚的石洗外观，它们还被用于，例如，清除绒毛以及防止在棉衣服表面上起球。在去污剂行业中，纤维素被用来使颜色鲜亮并防止衣服泛灰和起球。纤维素酶还可用于食品工业和动物饲料制造业，并且它们还在纸桨和造纸行业中具有强大的潜能，例如，在脱墨中使得墨渍从纤维表面上释出以及改善纸浆的排水。纤维素酶在工业中的广谱应用建立了对包含不同纤维素酶组分并在不同pH和温度范围内具有最适功能的商业化纤维素酶制品的需求。纤维素酶的实际应用常受到已知纤维素酶的性质的阻碍，已知纤维素酶通常是具有不同活性和底物特异性的纤维素酶混合物。出于这一原因，进行了多种尝试以期获得仅具有所需活性的纤维素酶。每种纤维素酶的独特性质使得一些酶会比其他的酶更适合某些意图。虽然这些酶在许多方面都有所不同，但最重要的区别之一就是最适pH。中性纤维素酶在pH6-8的范围内活性最高，碱性纤维素酶则在pH7.5-10，而最适pH为pH4.5-5.5的酸性纤维素酶，则在较高pH值下表现出了相当低的活性水平。中性和酸性纤维素酶在纺织行业中特别有用。在织物处理过程中，纤维素酶可攻击来自棉花纤维的纤维素分子链，从而影响所述织物的性质。在纺织行业中，"石洗"外观或磨损外观一直是近年来粗斜纹棉布制造商的兴趣所在。使用浮石进行的传统石洗会降低织物的强度并增大洗衣设备的负担。目前的潮流是趋向于酶法粗斜纹棉布修整处理，而且纤维素酶已经取代了浮石或与浮石一起使用，以赋予织物所希望的"磨损"外观。受控制的酶处理导致对衣服和机器的损害降低并免去了处理石头的需要。用于粗斜纹棉布处理的纤维素酶通常分为两大类酸性和中性纤维素酶。酸性纤维素酶通常在pH4.5-5.5发挥作用而中性纤维素酶则在pH6-8。用于生物石磨的酸性纤维素酶主要来源于里氏木霉(Trichodermareesei)(红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的有性幵》式)，而中性纤维素酶则来自多种真菌，包括子囊菌属(Melanocarpus)、腐质霉属(Humicola)、梭孢壳属(Thielavia)、毁丝霉属(Myceliophthora)、镰刀菌属(Fusarium)、枝顶孢属(Acremonium)和金孢菌属(Chrysosporium)(Haakana等2004)。里氏木霉的酶包括，例如，来自糖苷家族5(内切葡聚糖酶II，EGII)、家族7(纤维二糖水解酶I，CBHI)和家族12(内切葡聚糖酶III,EGIII，Ward等1993)的纤维素酶，以及中性纤维素酶，大多数通常是内切葡聚糖酶，其来自家族45和家族7(Henrissat，1991;Henrissat和Bairoch，1993)。纤维素酶包括表达纤维素酶活性的催化结构域/核心(CD)。除了所述催化结构域之外，纤维素酶分子还可含有一个或多个纤维素结合结构域(CBD)，也称作碳水化合物结合结构域/模块(CBD/CBM)，其可位于所述催化结构域的N-或C-末端。CBD具有碳水化合物结合活性，且能够介导纤维素酶与结晶纤维素的结合，但却对所述酶对于可溶性底物的纤维素酶水解活性作用甚微或没有作用。这两种结构域通常是通过柔性和高度糖基化的接头区域进行连接的。因为染料位于纤维的表面，所以主要进攻纤维表面的纤维素酶特别适用于用靛蓝染料染色的粗斜纹棉布的石洗。当被用于处理棉织物时，中性纤维素酶通常需要比酸性纤维素酶更长的洗涤时间。然而，中性纤维素酶对棉花的攻击性作用却要弱于酸性纤维素酶，而且对织物强度的影响也不象酸性纤维素酶那样强。中性纤维素酶具有较宽的pH范围，因此，在生物石磨过程中产生的pH升高对中性纤维素酶的活性几乎没有影响。然而，由于纤维素酶处理也有不希望的作用，例如纤维损坏和强度丧失，所以需要在希望和不希望的效果中寻求适当的平衡。在本说明书中被引作参考的WO97/14804公幵了三种新的来源于子囊菌属的中性纤维素酶，其特别适用于纺织和去污剂行业。特别描述了20kDa内切葡聚糖酶(Cel45A)、50kDa内切葡聚糖酶(cel7A)和50kDa纤维二糖水解酶(Cel7B)。这些在本文中被分别指定为"20K-纤维素酶"、"50K-纤维素酶"以及"50K-纤维素酶B"的纤维素酶都来自于Melanocarpusalbomyces，并表现出良好的石洗效果。由于对对深入改进纤维素酶存在着需求，尤其是在纺织和去污剂行业中，因此有建议认为可通过形成融合蛋白的方法来获得对纤维素酶的改进。还是在WO97/14804中，一般性地建议了20K-纤维素酶、50K-纤维素酶和50K-纤维素酶B与例如，里氏木霉纤维素酶、半纤维素酶或甘露聚糖酶或其功能性结构域的融合蛋白构建体。此外，为了对已公开的纤维素酶产生新的性质，还建议了纤维素酶与结构域的融合，所述结构域例如纤维素结合结构域(CBD)，优选带有接头。然而，该公开文本既未给出具体的实施例，也没有描述所感兴趣的新性质所在。同样，纤维素酶融合蛋白也是公知的，例如，在W096/29397中，其公开了通过由来自嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina)以及Crinipellisscabella的内切葡聚糖酶与来自特异腐质霉(Humicolainsolens)的CBD/接头的融合形成的内切葡聚糖酶。所述内切葡聚糖酶在其天然形式中不具有CBD/接头。EP663950公开了纤维素酶的变异体，尤其是特异腐质霉的43kD纤维素酶变异体，其中所述纤维素酶可包括来自于另一个微生物种类的连接区域，例如，为了提供改进的性质，例如对阴离子表面活性剂、对氧化剂或漂白剂的改善的抗性。然而，在常规使用纤维素酶的纺织工业中以及其他领域中，对于同样也对纤维造成较少损伤的改进纤维素酶的需求持续存在。特别是，对于更有效的纤维素酶存在着持续的需求，以改善加工经济学。本发明的目的旨在满足这一需求。发明概述本发明的目的在于提供水解性质改进的新型纤维素酶融合蛋白，用于纺织工业，尤其是石洗粗斜纹棉布，并可应用于去污剂组合物以及其他领域。本发明的新型纤维素酶融合蛋白在中性和碱性pH值下都具有活性，其在织物生物修整(biofinishing)以及生物石磨应用中以及在去污剂应用中都具有高度改善的洗涤性能，但其却不会危及到织物的强度。由于本发明的纤维素酶融合蛋白的效率改进，所述酶的制造方法明显更加经济。当需要较少量的酶产品时，所述酶产品在运销与储存方面也具有额外的优势。本发明的另一目的是提供编码本发明所述的新型纤维素酶融合蛋白的多核苷酸。本发明的又一目的是提供含有这类多核苷酸的新型表达质粒或载体，其可用于生产本发明的新型纤维素酶融合蛋白，以及提供用所述表达质粒转化的新型宿主。本发明的又一目的是提供酶制剂，其含有一种或多种具有改进水解性质的新型纤维素酶融合蛋白。本发明的又一目的是提供使用所述酶制剂和所述纤维素酶融合蛋白用于修整纺织品、尤其是用于粗斜纹棉布生物石磨的方法。本发明的再一目的是提供在去污剂组合物中使用本发明酶制剂的方式。本发明涉及新的纤维素酶融合蛋白，其包括A.得自一个物种的纤维素酶核心的任选修饰的第一氨基酸序列，以及B.得自另一物种的接头和/或纤维素结合结构域(CBD)的任选修饰的第二氨基酸序列，其中，向所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列之间引入连接区域，从而获得稳定的融合蛋白。优选，所述连接区具有以下通式!A-2B-3C-4D-5E-6F其中、选自Gly，Ala，Leu，Pro,lie和Val;优选地，^为Gly或Val，最优选为Gly;2B选自Gly，Ala，Leu，Pro,Ile，Phe，Val，Glu，Asp,Gin和Asn;优选，2B为Pro，Gin或Glu;3c选自Gly，Ala，Lys,Leu，Pro,Ile，Val，Ser和Thr;优选地，3C为lie;4D选自Gly，Ala，Leu，Pro,lie禾QVal;优选，4D为Gly或Pro;5E选自Ser，Pro和Thr;优选，5E为Ser;且6F选自Ser，Thr或不存在，优选，6F为Ser或不存在；其中'A连接于纤维素酶核心的C-末端氡基酸序列且6F连接于接头和/或结构域(CBD)的N-末端氨基酸序列。本发明还涉及表达载体，其包括第一多核苷酸序列，其编码得自一个物种的纤维素酶核心的任选修饰的第一氨基酸序列，以及第二多核苷酸序列，其编码得自另一物种的接头和/或纤维素结合结构域(CBD)的任选修饰的第二氨基酸序列，以及编码连接所述第一和第二多核苷酸序列连接区域的多核苷酸，所述多核苷酸序列编码本发明纤维素酶融合蛋白的相应氨基酸序列。本发明还涉及用本发明载体转化的新宿主，特别是能够高水平表达本发明的纤维素酶融合蛋白的宿主。本发明还涉及酶制剂，其含有一种或多种本发明的纤维素酶融合蛋白。本发明还涉及使用本发明酶制剂进行织物修整、特别是对粗斜纹棉布进行生物石磨的方法。本发明还涉及在去污剂组合物中本发明酶制剂的应用。附图图1是质粒pALK1480的示意图。图2是质粒pALK492的示意图。图3是质粒pALK424的示意图。图4是质粒pALK1237的示意图。图5是质粒pALK1241的示意图。图6是质粒p3SR2的示意图。图7是质粒pALK1649的示意图。图8是质粒pALK1694的示意图。图9A所示为用于产生20K+CBD融合蛋白的里氏木霉原生质体转化的表达盒。所述20K+CBD基因处于cbhl(cel7A)启动子(cbhl启动子)的控制下，并通过使用cbhl终止子序列(终止子)确保转录的终止。其还包括了amdS基因(amdS)以及cbhl3'侧翼区域(cbhl3'侧翼)。图9B所示为连接点的氨基酸序歹!j，在此，Melanocarpusalbomyces20K(Cel45A)蛋白融合到pALK1434和pALK1435质粒中后面接着纤维素结合结构域(CBD)的里氏木霉CBHI(cd7A)的接头威上。接头区域所包含的氨基酸用下划线标记，而CBD区域的氨基酸序列则通过斜体标记。在所述CBD区域中的第一个氨基酸通过上标数字表示。图10A所示为用于产生20K+CBD融合蛋白的里氏木霉原生质体转化的表达盒。所述20K+CBD基因处于cbhl(cel7A)启动子(cbhl启动子)的控制下，并通过使用cbhl终止子序列(终止子)确保了转录的终止。其还包括了amdS基因(amdS)以及cbhl3'侧翼区域(cbhl3'侧翼)。图10B所示为连接点的氨基酸序列，在此，Melanocarpusalbomyces20K(Cel45A)蛋白融合到pALK1768、pALK1769、pALK1770和pALK1775质粒中后面接着纤维素结合结构域(CBD)的里氏木霉CBHI(cel7A)的接头肽上。接头区域所包含的氨基酸用下划线标记，而CBD区域的氨基酸序列则通过斜体标记。在所述CBD区域中的第一个氨基酸通过上标数字表示。图11A所示为用于产生20K+CBD韭融合蛋白的里氏木霉原生质体转化的表达盒。所述20K+CBDmut基因处于cbhl(cel7A)启动子(cbhl启动子)的控制下，并通过使用cbhl终止子序列(终止子)确保了转录的终止。其还包括amdS基因作为转化标记。图IIB所示为连接点的氨基酸序列，在此，所述连接点上Melanocarpusalbomyces20K(Cel45A)蛋白融合到后面接着纤维素结合结构域(CBD)的里氏木霉CBHI(cel7A)的接头肽上。pALK1877-pALK1880表达盒的CDB区域中的氨基酸取代也得以呈现。接头区域所包含的氨基酸用下划线标记，而CBD区域的氨基酸序列则通过斜体标记。在所述CBD区域中的第一个氨基酸以及酪氨酸残基或其取代物通过上标数字表示。图12A所示为里氏木霉CBHI(cd7A)域间接头肽的氨基酸序列。接头区域所包含的氨基酸用下划线标记。AG-444和△G-460分别代表残基434-444和434-460的接头缺失。图12B所示为连接点的氨基酸序列，在此，Melanocarpusalbomyces20K(Cel45A)蛋白融合到在pALK1893、pALK1896、pALK1899和pALK1952表达盒中后面接着完整或突变的纤维素结合结构域(CBD)的里氏木霉CBHI(cel7A)截断的接头肽上，之后是。连接区域所包含的氨基酸用下划线标记，而CBD区域的氨基酸序列则通过斜体标记。在所述CBD区域中的第一个氨基酸以及酪氨酸残基或其取代物上通过上标数字表示。图13A所示为用于产生50K+CBD融合蛋白的里氏木霉原生质体转化的表达盒。所述50K+CBD基因处于里氏木霉cbhl启动子(cbhl启动子)的控制下，并通过加入cbhl终止子(终止子)确保转录的终止。其还包括了amdS基因(amdS)以及cbhl3'侧翼区域(cbhl3'侧翼)。图13B所示为连接于里氏木霉CBHI接头+CBD的Melanocarpusalbomyces50K连接点的氨基酸序列。连接区域所包含的氨基酸用下划线标记，而CBD区域的氨基酸序列则通过斜体标记。在所述CBD区域中的第一个氨基酸通过上标数字表示。图14A所示为用于产生50KB+CBD融合蛋白的里氏木霉原生质体转化的表达盒。所述50KB+CBD基因处于里氏木霉cbhl启动子(cbhl启动子)的控制下，并通过加入cbhl终止子(终止子)确保了转录的终止。其还包括了amdS基因(amdS)以及cbhl3'侧翼区域(cbhl3')。图14B所示为连接于里氏木霉CBHI接头+CBD的Melanocarpusalbomyces50KB连接点的氨基酸序列。接头区域所包含的氨基酸用下划线标记，而CBD区域的氨基酸序列则通过斜体标记。在所述CBD区域中的第一个氨基酸通过上标数字表示。图15A所示为用于产生里氏木霉原生质体制备重组橘黄嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)CBHI+CBD融合蛋白转化的表达盒。所述CBHI+CBD基因处于cbhl(cel7A)启动子(cbhl启动子)的控制下，并通过使用cbhl终止子序列(终止子)确保了转录的终止。其还包括amdS基因作为转化标记。图15B所示为连接点的氨基酸序列，在此，橘黄嗜热子囊菌CBHI蛋白融合到后面接着纤维素结合结构域(CBD)的里氏木霉CBHI的接头肽上。接头区域所包含的氨基酸用下划线标记，而CBD区域的氨基酸序列则通过斜体标记。在所述CBD区域中的第一个氨基酸通过上标数字表示。图16所示为表达本发明融合蛋白的菌株RF5977和RF6090与商业化20K制剂在粗斜纹棉布处理中的表现比较。在实施例8和9所述的洗涤条件中，亮度的升高为酶剂量的函数。图17所示为20K+CBD融合蛋白与相'应的商业化酶制剂对粗斜纹棉布织物的强度的影响。图17A撕裂强度(N)，经纱。图17B撕裂强度(N)，纬纱。图18显示了20K+CBD融合蛋白的防起球效果。图19图示了20K+CBD融合蛋白在去污剂应用中的性能。所述图显示了在使用或未使用所述酶洗涤的抗灰制品224与原始材料(未洗涤)之间的颜色匹配差异；A在40'C，B在6(TC。图20图示了20K+CBD融合蛋白在去污剂应用中的性能。所述图显示了在使用酶和未使用酶洗涤的抗灰材料224之间的颜色匹配差异；A在40°C，B在60°C。发明的详细描述本发明是基于对进一步改进中性纤维素酶、尤其是那些在WO97/14804中所述的中性纤维素酶的工作，其目的在于在酶处理过程中降低所述织物强度的损失。在一些应用中，也许是因为其大小比较小，20K纤维素酶表现出了有关纤维强度的不希望的性质。一种简单的假设认为，酶的大小增加有可能降低所述酶穿透进入纤维的能力，从而将对纤维的弱化降低至较小的程度，即，所述酶的进攻性较弱。为此，采用了在WO97/14804中所建议的融合蛋白方法，并设计了包括子囊菌种的中性纤维素酶核心和由里氏木霉的酸性纤维二糖水解酶I的接头/CBD组成的尾部的融合构建体。然而，令人惊异的是，与现有技术的建议相反，并不能获得完全稳定的融合蛋白构建体，而是融合配偶体在培养条件彼此分离。这大概是由于蛋白酶的存在。为了产生稳定的融合蛋白，一种方法是设计出没有相邻疏水性氨基酸(例如，V，I,L，F和W)的新型连接构建体，从而防止由天冬氨酰蛋白酶引起的切割。然而，即使所述构建体产生融合蛋白，还是会时尔观察到某些降解。基于对天然含有接头/CBD尾部的中性纤维素酶的比对，产生了其他的构建体，且这些构建体最终被证明是最稳定的并且最适用于进一步的检验。除此之外，还设计了在CBD中携带突变的融合构建体，导致对于纤维素的亲和性或吸附能力降低或最小化(Linder等，1995)。新型构建体产生了改善的强度性质，这就是目的。令人惊奇的是，所述稳定的纤维素酶融合蛋白还在洗涤性能中另外表现出了意料之外的改进，效力甚至高达其"母体"纤维素酶的6倍。然而，其产量却保持在大致相同的水平上。这意味着现在仅需纤维素酶活性量的六分之一就足以达到与现有技术纤维素酶相同的洗涤性能。这在生产步骤中，以及在运销和保存中产生了相当程度的节约，从而降低了环境的负担。同样，还减少纤维素酶制剂的不希望的作用，从而为酶制品的最终用户带来了进一步的节约。考虑到每年会生产大约20亿条粗斜纹棉布牛仔裤，且其大多数都是经过纤维素酶进行修整的，其优势极为显著。因此，本发明提供了一种新的纤维素酶融合蛋白，其包括A.得自一个物种的纤维素酶核心的任选修饰的第一氨基酸序列以及B.得自另一物种的接头和/或纤维素结合结构域(CBD)的任选修饰的第二氨基酸序列，其中，向所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列之间引入连接区域，从而获得稳定的融合蛋白。在本发明的一个优选实施方案中，所述连接区域具有以下通式、-2B陽3C-4D-5E-6F其中'A选自Gly，Ala，Leu，Pro,lie禾卩Val;优选，'A为Gly或VaI，最优选为Gly;2B选自Gly，Ala,Leu，Pro,lie,Phe，Val,Glu，Asp，Gin和Asn;优选，2B为Pro，Gln或Glu;3C选自Gly，Ala，Lys，Leu，Pro,Ile，Val，Ser和Thr;优选，3C为Ile;4D选自Gly，Ala，Leu，Pro,lie和Val;优选，4D为Gly或Pro;5E选自Ser，Pro和Thr;优选，5E为Ser;且^选自Ser，Thr或不存在，优选，6F为Ser或不存在；其中连接于纤维素酶核心的C-末端氨基酸序列且6F连接于接头和/或结构域(CBD)的N-末端氨基酸序列。在本发明的一个特定优选实施方案中，所述连接区域具有以下通式、-2B-3Ile-4D-5Ser陽6F其中2B为Pro,Gin或Glu;4D为Gly或Pro;5E为Ser;且^为Ser或不存在。在本发明的另一个特定优选实施方案中，所述连接区域具有以下通式al-2Gln-3Ile-4Pro-5Ser-6Sor。在本发明的又一个特定优选实施方案中，所述连接区域具有以下通式、-2Glu-3Ile-4Gly-5Ser。在本发明的又一个特定优选实施方案中，所述连接区域具有以下通式'Gly-2Pro-3Ile-4Gly-5Ser。在本发明的一个优选实施方案中，所述第一氨基酸序列来自中性纤维素酶且所述第二氨基酸序列来自酸性纤维素酶。在本发明的又一个优选实施方案中，所述第一氨基酸序列来自家族45(Cel45)的纤维素酶且所述第二氨基酸序列来自家族7(Cel7)的纤维素酶。正如在本文中所使用，"纤维素酶核心"或"核心"的表述是指表达纤维素酶活性的酶的催化结构域/核心(CD)。这样的催化结构域可以是其天然存在的形式(即完整形式)，或者，优选，进行下述的修饰。"衍生物"和功能性变异体的表述是指表达相同的纤维素酶活性但包括下述修饰的多肽。在本文中使用了常规的单字母氨基酸代码和三字母氨基酸代码。因此，A和Ala是指丙氨酸，R和Arg是指精氨酸，N和Asn是指天冬酰胺，D和Asp是指天冬氨酸，Cys和C是指半胱氨酸，E和GIu是指谷氨酸，Q和Gln是指谷氨酰胺，G和Gly是指甘氨酸，H和His是指组氨酸，I和Ile是指异亮氨酸，L和Leu是指亮氨酸，K和Lys是指赖氨酸，M和Met是指甲硫氨酸，F和Phe是指苯丙氨酸，P和Pro是指脯氨酸，S和Ser是指丝氨酸，T和Thr是指苏氨酸，W和Trp是指色氨酸，Y和Tyr是指酪氨酸，而V和Val是指缬氨酸。除了天然存在的L-氨基酸，还可以使用D-氨基酸。在本发明的纤维素酶融合蛋白中，所述中性纤维素酶优选是真菌来源的。所述中性纤维素酶可得自子囊菌属(Melanocarpus)，腐质霉属(Humicola)，梭孢壳属(Thielavia)，毁丝霉属(Myceliophthora)，镰刀菌属(Fusarium)，枝顶孢属(Acremoni腿)，金孢菌属(Chrysosporium)，嗜热菌属(Thermoascus),帚霉属(Scopulariopsis)，多齿菌属(Myriococcum),踝节菌属(Talaromyces)或毛壳菌属(Chaetomium)。特别优选的是子囊菌亚种，尤为优选Melanocarpusalbomyces。用于本发明的纤维素酶融合蛋白中的酸性纤维素酶源于于木霉亚种或肉座菌(Hypocrea)，尤其来自里氏木霉。在本发明的一个特别优选实施方案中，第一氨基酸序列是SEQID.NO:2的Melanocarpusalbomyces20K纤维素酶或其衍生物，而第二氨基酸序列是SEQID.NO:4的里氏木霉纤维二糖水解酶I的接头和/或CBD或其衍生物。在本发明的一个优选实施方案中，所述纤维素酶融合蛋白在纤维素酶核心和/或在接头和/或CBD中含有修饰。用在本文中，"修饰"的表述是指突变，例如一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代，或其他修饰，例如糖基化。这类修饰的例子包括使用脂肪族氨基酸，优选为丙氨酸，和/或芳香族氨基酸，例如色氨酸，取代里氏木霉CBHI的CBD31位(对应于成熟多肽的酪氨酸Y492)和/或32位(对应于成熟多肽的酪氨酸Y493)上的保守酪氨酸残基，如Under等1995所述。这类突变其他的例子包括Srisodsuk等1993所述的里氏木霉CBHI的接头间突变，例如在成熟木霉CBHI序列中434-444位以及434-460位氨基酸的缺失。这类突变的其他例子还包括SEQID.NO:2的Melanocarpusalbomyces20K纤维素酶序列中207位上Ala的缺失、208位上Val的缺失、Phe209Trp的取代、以及在206位之后Pro的插入。本发明的纤维素酶融合蛋白是稳定的。在本发明的内容中，"稳定的纤维素酶融合蛋白"的表述是指至少20%，优选为至少40。/。，更优选为至少70%,最优选为90-100%所产生的纤维素酶融合蛋白在发酵过程中含有在氨基酸序列之间未被切割的连接区域。这意味着20%-100%，优选为40%-100%，更优选为70%-100%所产生的纤维素酶都具有融合在一起的第一和第二氨基酸序列。"稳定的纤维素酶融合蛋白"的表述还可以指所述纤维素酶融合蛋白制剂可本身是稳定的，或可通过，例如热处理或调节pH、或通过加入稳定剂或降低蛋白活性的试剂、或通过从培养物中分离融合蛋白来得以稳定。在本文中，热处理是指在能够允许制剂中的融合蛋白保持充分稳定的温度下进行的处理。所述热处理可以是，例如，在pH6.0在65'C处理60-70分钟。在本文中，"完整的融合蛋白"的表达是指在本发明的融合蛋白中，第一和第二氨基酸序列之间的连接保持完整，尽管在所述序列中可能或不能出现末端降解。在本发明纤维素酶融合蛋白的一个优选实施方案中，所述第一氨基酸序列是具有SEQID.NO:2或其功能性变异体的Melanocarpusalbomyces20K序列。在另一优选实施方案中，所述第一氨基酸序列是具有SEQID.NO:6或其功能性变异体的Melanocarpusalbomyces5OK序列。在又一优选实施方案中，所述第一氨基酸序列是具有SEQID.NO:8或其功能性变异体的Melanocarpusalbomyces50KB序列。在又一优选实施方案中，所述第一氨基酸序列是具有SEQID.NO:10或其功能性变异体的橘黄嗜热子囊菌CBHI序列。在又一本发明的纤维素酶融合蛋白的优选实施方案中，所述第二氨基酸序列是里氏木霉纤维二糖水解酶I或其功能性变异体的具有SEQID.NO:4的接头和纤维素结合结构域序列。因此在本发明纤维素酶融合蛋白高度优选的实施方案中，所述纤维素酶核心的第一氨基酸序列选自SEQID.NO:37，38，39，40，41,42和43，特别是SEQID.NO:39，而接头和/或CBD序列的第二氨基酸序列则选自SEQID.NO:44，45，46，47，48，49和50。在本发明的特定实施方案中，所述纤维素酶核心的第一氨基酸序列是SEQID.NO:39，而接头和/或CBD序列的第二氨基酸序列则是SEQID.NO:47，49禾O50。本发明还涉及表达载体，所述载体包括第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码纤维素酶核心任选修饰的第一氨基酸序列所述纤维素酶核心得自某一物种，还包括第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码接头和/或纤维素结合结构域(CBD)的任选修饰的第二氨基酸序列，所述接头和/或纤维素结合结构域(CBD)得自另一物种，还包括编码连接所述第一和第二多核苷酸序列连接区域的多核苷酸，所述多核苷酸编码如上所具体定义的相应的氨基酸序列。本发明还涉及纤维素酶制剂，其可只含有一种或多种本发明的纤维素酶融合蛋白或加上根据拟解决的特定应用的其他酶和添加剂。本发明还涉及出于以下特别公开的目的，使用本发明的纤维素酶融合蛋白制剂的用途和方法。本发明的纤维素酶融合蛋白制剂特别适用于纺织和去污剂工业。这些纤维素酶表现出高度改善的磨损效果以及可见和可度量的亮度的提高。它们表现出可接受的回染(backstaining)并与生物石磨所产生的聚焦对比一样好。其可适用于纺织工业对织物或衣服进行生物修整，例如，去球，去毛，澄色，降低粗燥程度，产生不同的修整(例如，'桃皮绒，，<破旧'，'沙洗，或'古旧'效果)，以及用于纱的生物修整，例如降低起毛以及改善平滑性。具有这样良好的去球性质对中性纤维素酶而言是不同寻常的，因为用于工业生物修整应用中的酶通常都是酸性水解酶。具有极佳去球性质的中性纤维素酶像20K+CBD融合蛋白能够在染色过程中同时进行生物修整处理，获得相当程度的节约。同样，颜色的牢固性也通常是在中性条件下好于酸性条件下。其他的用途包括在用于去污剂组合物，通过抗起球、抗发灰、澄色以及软化来改善织物护理性质，并改善织物的清洁效果，例如去污。用在本文中，织物或衣服的"生物石磨"这一表述是指使用酶来替代浮石，或添加到浮石中，对织物或衣服进行处理，特别是对粗斜纹棉布。用在本文中，"生物修整"的表述是指在受控的纤维素纤维水解条件下使用酶，从而以防止永久性起球、改善织物手感例如柔软性和光滑性、通过降低起毛清洁表面结构的方式修饰织物或纱表面，这导致了颜色的净化，改善了织物的悬垂性，改善了吸湿性，还可以改善可染色性。用在本文中，"回染"的表述是指释放出的染料重新沉淀于织物纤维表面的趋势。用在本文中，"去污剂"的表述是指清洁剂，其可含有表面活性剂(阴离子、非离子、阳离子和两性表面活性剂)、增效助剂以及其他任选的成分，例如抗再沉淀和污渍悬浮剂、光学亮白剂、漂白剂、染料和色素以及水解酶。适合的去污剂成分清单见于美国专利第5,433,750号，适合的表面活性剂的清单见于美国专利第3,664,961号。是特异的氨基酸序列的"相等物"或"衍生物"的氨基酸序列是指所述氨基酸序列与特定的氨基酸序列不一致，而是含有至少部分氨基酸改变(缺失，取代，反向，插入等)，当用作特定应用时，所述改变与所述特定氨基酸序列的类似活性相比，基本不影响蛋白的生物学活性。.纤维素酶的生物学活性是指其催化活性，和/或其结合于纤维素材料的能力。表达载体是在转化入所希望的宿主之后，能够表达编码本发明的纤维素酶融合蛋白的DNA的克隆质粒或载体。当使用真菌宿主时，优选向真菌宿主提供目的基因，作为整合入真菌染色体的克隆或表达载体的一部分，或使目的基因整合入宿主染色体，或作为自主复制型质粒。在整合过程中，作为克隆载体或表达载体一部分的序列还可与所述DNA整合。除此之外，在真菌中，所述表达载体或其部分还可以靶定到预定的基因座中。编码本发明的融合蛋白的DNA同样优选置于由所述载体(其与目的基因整合)提供的某些控制序列例如启动子序列的控制之下(即，可操作与其联接)。或者，所述控制序列可以是那些位于插入位点的序列。根据所述载体是否被设计为在原核或真核宿主中表达某种基因(例如，穿梭载体可在细菌宿主中提供用于选择的基因)，表达载体的表达控制序列也不同。表达控制序列可以含有转录调节元件，例如启动子，增强子元件，以及转录终止序列，和/或翻译调节元件，例如翻译起始和终止位点。多核苷酸分子，例如DNA，如果其含有包括转录调控信息的表达控制序列，且这些序列是"可操作地联接于"编码多肽的核苷酸序列，则，其可被认为"能够表达"多肽。可操作的连接是这样的连接，其中一种序列以这样的方式连接于调节序列(或序列)，即将所述序列的表达置于调节序列的影响或控制之下。两种DNA序列(例如联接于蛋白编码序列5'末端的启动子区域序列)，如果启动子的功能导致了转录，则可以称为可操作地连接。本发明的载体还可以包括其他可操作连接的调节元件，例如增强子序列。在一个优选实施方案中，构建了遗传稳定的转化体，从而通过使用载体进行转化，，将编码本发明的纤维素酶融合蛋白的DNA整合入宿主染色体，所述载体含有启动所述载体整合到染色体中的序列。在其染色体中具有编码本发明纤维素酶融合蛋白的稳定整合的DNA的细胞，通过引入一种或多种同源或异源的标记进行筛选，其允许筛选在染色体中含有表达载体的宿主细胞，例如，所述标记可以提供杀生物剂抗性，例如对抗生素、或重金属例如铜的抗性，或在宿主染色体中补充营养缺陷型突变的标记等等。所述可选择的标记基因或者可以直接连接于要表达的DNA基因序列，或可通过共转化导入相同的细胞。一旦制备了含有构建体的本发明的载体或DNA序列用于表达，可通过任合各种适合的方式，包括本领域中公知的转化，将所述DNA构建体导入适当的宿主细胞。在导入所述载体之后，将受体细胞在选择培养基中进行生长，其可以筛选转化细胞的生长。适当的表达和生产宿主系统是，例如，针对真菌宿主木霉(EP244234)开发的生产系统，或曲霉(Aspergillus)生产系统，例如米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)(W09708325和W09533386，US5,843,745，US5,770,418)，或针对镰刀霉属，例如尖孢镰刀霉(Fusariumoxysporum)开发的生产系统(Malardier等，1989)。针对细菌开发的适合的生产系统是针对芽孢杆菌属(Bacillus)开发的生产系统，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或针对大肠杆菌(E.coH)，或针对放线菌类链霉菌(Streptomyces)开发的生产系统。针对酵母开发的适合的生产系统是针对酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母菌属(Shizosaccharomyces)或毕赤酵母(Pichiapastoris)开发的系统。在某些其他微生物或哺乳动物细胞或植物中的生产系统也是有可能的。所述克隆基因序列的表达导致了所希望蛋白的产生，或这一蛋白片段的产生。这种表达可以连续的形式，或以受控制的形式，在转化细胞中发生。片段可以理解为长度足以编码所描述的蛋白或其生物学活性片段的核酸分子的部分。术语"衍生物"在本说明书中是指这些分子的核苷酸序列与上述核酸分子的序列在一个或多个位置上不同，并与所述序列高度同源。同源性可理解为是指至少40%的序列一致性，特别为至少60%的一致性，优选为超过80%且更优选为超过90%。上述核酸分子的偏差可以是缺失、取代、插入、加入或其组合的结果。同源性还可指分别的核苷酸序列或编码的蛋白是功能和/或结构等同的。用在本文，"酶制剂"和"纤维素酶制剂"的表述是指任意的酶制品，其含有至少一种纤维素酶融合蛋白。因此，这样的酶制剂可以是含有一种或多种纤维素酶融合蛋白或含有一种或多种纤维素酶融合蛋白以及其他酶的耗尽的培养基或滤液，分离的纤维素酶融合蛋白或者一种或多种纤维素酶融合蛋白的混合物或者一种或多种纤维素酶融合蛋白与一种或多种其他酶的混合物。除了纤维素酶融合蛋白活性外，这样的制剂还可含有添加剂，例如稳定剂，缓冲剂，防腐剂，表面活性剂和/或培养基成分。优选的添加剂是那些通常用于供应用的酶制剂中的添加剂，在所述应用中使用酶制剂。所述酶制剂可以是液体、粉末或颗粒形式。这里"耗尽的培养基"是指含有产生的酶的宿主培养基。优选，所述宿主细胞是生产完成之后与所述培养基分离。所述酶制剂可包括本发明的一种或多种纤维素酶融合蛋白或者其他纤维素酶加上本发明的一种或多种纤维素酶融合蛋白。例如，可将具有不同性质的纤维素酶融合蛋白组合，从而制备出更加适用于不同条件下的酶制剂。为了获得本发明的酶制剂，可在适当的条件下培养具有所希望性质的宿主(即，能够经济表达可行量的本发明纤维素酶融合蛋白的宿主)，所希望的酶可从宿主分泌到培养基中，并通过本领域公知的方法从所述培养基中回收所述酶制剂。所述酶制剂还可包括除了纤维素酶融合蛋白之外的一种或多种其它酶，其可以是例如淀粉酶、虫漆酶和/或过氧化酶。或者，可以在使用本发明的纤维素酶融合蛋白进行处理之前、之中或之后，进行另一种酶处理。所述酶处理可包括，例如，一种或多种淀粉酶处理，一种或多种纤维素酶处理和/或一种或多种过氧化酶处理和/或虫漆酶处理。哪些其他酶可包括于酶制剂中或可用于酶处理中，要根据应用来决定。所述酶制剂可以是含有或没有天然或转化宿主细胞的培养基，或者是通过使用本领域公知方法从其中回收得来的。然而，因为本发明的纤维素酶融合蛋白是分泌到培养基中的，并且可在纤维素水解液的环境条件下表现出活性，本发明的优势是本发明的酶制剂可以从培养基中直接利用，无需进一步提纯。如果需要的话，这类制剂可以被冷冻干燥或者为了保存而浓縮和/或稳定酶的活性。本发明酶制剂的提供和使用非常经济，因为(l)所述酶可以粗制品形式使用；并不必须从培养基中分离特定的酶，禾卩(2)因为所述酶分泌到培养基中，只需要回收培养基就可获得所需要的酶制剂；不需要从宿主中提取酶。优选，适于这类生产的宿主是木霉，尤其是里氏木霉。本发明的酶制剂可作为液体或固体提供，例如以干粉或颗粒或液体形式，特别是非粉化颗粒，或稳定的液体，或者所述酶制剂也可以另行浓縮或稳定以便保存或使用。可以预见，含有一种或多种本发明中性纤维素酶的酶制剂还可以进一步富集或在部分或完全缺乏特定酶活性中进行制备，从而在多种应用中，例如在纺织工业中，满足特定使用的要求。由宿主特别是真菌分泌的酶活性的混合物，可在特定的工业应用中，例如生物石磨中被有益地选用。可对本发明所述酶制剂进行调节，从而满足在纺织、去污剂或纸衆或造纸行业中，各种应用下特殊需要的要求。可使用不完全是从相同宿主产生的其他大分子(例如，其他酶例如内切葡聚糖酶，蛋白酶，脂酶，过氧化物酶，氧化酶或淀粉酶)或能够增强所希望的酶制剂的性能、稳定性或缓冲能力的化学物质来制备掺合物。还可以对非粉化颗粒进行包衣。根据已有的方法，可通过加入二元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸、或氯化钠来稳定液体酶制剂。可根据EP238,216所述，制备本发明的酶的保护形式。本发明的酶制剂可含有表面活性剂，其可以是阴离子的、非离子的、阳离子的、两性离子的或这些类型的混合物，特别是当被用作去污剂组合物时。可用的去污剂组合物记载于，例如，WO94/07998，美国专利第5,443，750和美国专利第3，664，961。如果需要的话，还可以根据现有条件，例如提取，沉淀，层析，亲和层析，电泳等，对所希望的酶进行进一步地纯化。本发明的酶制剂特别适用于纺织工业，优选可用于生物石磨和生物修整或去污剂行业。其他可适用的领域是纸浆和造纸行业。石洗具有三个步骤脱浆，磨损和后处理。第一步，脱浆过程通常是对牛仔裤进行首次湿处理，这意味着去除了通常应用于经纱的淀粉或其他上浆剂，以防止在纺织过程中的损伤。可使用a-淀粉酶来去除基于淀粉的浆料，用于改善的和均匀的湿处理。脱桨之后，一般用水漂洗牛仔裤或直接继续磨损步骤。第二步，磨损，可使用酶或浮石或这二者来进行。在所有情况中都需要机械作用来去除染料，而所述处理通常是在洗衣机，像鼓式洗衣机中进行的。本文中，术语"磨损的"是指当使用纤维素酶或石头或者二者进行处理之后，粗斜纹棉布织物的外观。染料去除不均匀的结果是，在染色区域和染料被去除的区域之间出现了对比。"石洗外观"或"磨损外观"是同意表达。在酶法石洗、或生物修整过程中，使用浮石进行磨损可以完全或部分省略，而加入纤维素酶来促进靛蓝染料从纤维表面上的磨损。可使用中性或酸性纤维素酶或这二者来完成纤维素酶处理。如果织物不是经过纤维素酶处理或石洗的，则织物的外观被称为是"暗淡的"，因为时尚的对比度消失了。当需要更明显的退色效果时，可使用化学试剂和/或酶学方法例如虫漆酶处理来进行漂白。磨损之后通常是第三步，后处理，其包括洗涤和漂洗步骤，在该步骤中可以使用去污剂、光亮剂或软化剂。酶处理之后，必须停止反应，以防止被处理材料的损伤，例如，通过温度和/或pH灭活的方法，后者包括彻底的漂洗和/或洗掉去污剂。这确保了纤维的机械强度不会受到持续存在的酶的危害。就本发明而言，"粗斜纹棉布"是指粗斜纹棉布织物，通常是粗斜纹棉布衣服，尤其是牛仔裤。有利的是所述粗斜纹棉布是靛蓝染色的粗斜纹棉布。可以使用靛蓝、靛蓝的衍生物处理粗斜纹棉布，或使用靛蓝加上一些其他染料来染色粗斜纹棉布，例如有硫磺底的靛蓝染色的粗斜纹棉布。用纤维素酶处理可以完全取代用浮石处理(例如，lkg商业化酶相当于100kg石头)。然而，当需要产生严重磨损的修整时，可将纤维素酶处理与浮石处理组合使用。产生纤细突出的毛发样覆盖物的桃皮绒效果也可以通过组合浮石和中性纤维素酶的洗涤来实现。本发明的纤维素酶可特别适用于提供磨损的外观并在生物石磨过程中最小化回染。生物石磨优选在约pH4.5-9.5，且最优选在pH6.0-8.0之间进行。反应的温度可介于约40-80°C，优选为50-70°C，且更优选为55-65°C,最优选为6(TC。浴比(单位重量织物的液体体积的比值)可为约2:1-30:1，优选为4:1-15:1且最优选为5:1-10:1。酶剂量可为约5-8000NCU/g织物，优选为20-3000NCU/g织物且最优选为30-1500NCU/g织物。处理时间可为15分钟-4小时，更优选为20分钟-90分钟且最优选为30分钟-60分钟。应该强调的是，酶剂量在很大程度上依赖于织物的类型，机器，处理条件(pH，温度，浴比，处理时间，粗斜纹棉布装载量，处理规模)以及酶制剂的类型等等。如果需要的话，可将浮石与融合纤维素酶蛋白组合使用。所需要的酶剂量随后将显著降低。本领域技术人员能够确定适当的剂量和条件。本发明的纤维素酶融合蛋白可适用于纺织工业对织物或衣服的生物修整，例如，去球，去毛，澄色，降低粗燥度，产生不同的修整(例如，'桃皮绒，，'破旧'，'沙洗'或'古旧'效果)以及纱的生物修整(例如降低起毛，改善平滑度)。本发明的纤维素酶融合蛋白可在酸性和中性条件下，使用与生物石洗基本相同的条件，用于生物修整。本发明的纤维素酶融合蛋白可用于去污剂组合物，从而通过抗起球、抗发灰、澄色以及软化，来改善织物的护理性质，并改善纺织品的清洁效果，例如去污。用本发明酶制剂处理的纺织材料可用含有纤维的天然纤维素或含有纤维的人造纤维素或其混合物制造。天然纤维素的例子是棉花，亚麻，大麻，黄麻和苎麻。人造纤维素的例子是粘胶，醋酸纤维素，三乙酸纤维素，人造丝，铜铵纤维(cupro)和溶解性纤维(lyocell)。上述的纤维素还可作为合成纤维例如聚酯、聚酰胺或丙烯酸纤维的混合物使用。所述纺织材料可以是纱或通过何其他方法针织或机织或形成的。本发明的纤维素酶，除了可特别适用于织物的处理之外，还通常适用于需要纤维素酶活性的任何领域。在纸浆和造纸工业中，中性纤维素酶可用于，例如，对具有中性或碱性pH值的不同类型再生纸和纸板进行脱墨，改善纤维质量或在造纸过程中增加排水。其他的例子包括纺织品印染之后去除印膏增稠剂和过多的染料，以及对动物词料进行处理。例如，如果预期的应用是改善机械纸浆的强度，则本发明的酶制剂可以提供一种或多种这些蛋白从而增强或促进纤维素纤维结合到一起的能力。以类似的方式，在纸浆精制的应用中，本发明的纤维素酶融合蛋白制剂可在增强或促进此类溶胀的水平上提供一种或多种这些蛋白。在本发明的融合蛋白中，特别适合于纸浆应用的是那些具有Melanocarpusalbomyces50KB或橘黄嗜热子囊菌CBHI核心的融合蛋白。当被用于纺织工业且特别是生物石磨时，本发明的纤维素酶融合蛋白提供了意料之外的益处。本发明的纤维素酶融合蛋白比现有技术中的纤维素酶明显更有效力。在生物石磨中，根据施用于织物重量的中性纤维素酶活性单位的剂量，使用的是至少低两倍，通常低至少三倍甚至是六倍的剂量，而不会损害织物的强度。换言之，通过使用本发明的纤维素酶融合蛋白，可实现多达高出6倍的性能。因为本发明的纤维素酶融合蛋白的产量对应于公知20K纤维素酶的产量，所以总的生产效率得以显著改进。这可以与所需酶量的大幅节约直接成比例使用降低的酶量的可能性为制造和使用、包括运输都提供了相当程度的经济价值。本发明将在下述实施例中更加详细地描述，所述实施例不应被理解为对本发明的范围进行限制，而是仅用于阐明本发明的用途。实施例1构建20K+CBD融合蛋白的表达载体在分离、纯化和酶处理DNA(质粒，DNA片段)中，在聚合酶链反应(PCR)中，在大肠杆菌转化中等等，用标准分子生物学方法。所用的基本方法记载于标准分子生物学手册，例如，Sambrook等(1989)以及Sambrool和Russel1(2001)。质粒构建体被设计为将Melanocarpusalbomyces20K(Cel45A，AC#AJ515703;SEQID.NO:l)的编码序列与里氏木霉CBHI的接头和CBD(AC#AR088330;Srisodsuk等1993;SEQID.NO:3)的编码序列相连。总共设计了6种不同的连接，如表1所示。对表1中所述的构建体#1和#2而言，向20K编码序列的末端引入了唯一的Nrul位点。这一位点使得可在成熟20K的丝氨酸#213密码子之后与具有钝末端的任何DNA片段直接融合。使用引物20K—Nco(SEQIDNO:11)和20K—NruXho(SEQIDNO:14)，以质粒pALK1480(图1)为模板，使用程序A(表3)进行PCR反应。pALK1480含有Melanocarpusalbomycescel45A(编码Cel45A或20K)基因组拷贝，所述基因组拷贝插入于里氏木霉cbhl启动子之后作为精确融合并含有位于pUC19载体(NewEnglangBiolabs,Inc.,USA)基因下游的cbhl终止子。所述PCR反应混合物中含有lxDyNAzymeEXT反应缓冲液(Finnzymes，芬兰)，8mMMg2+(通过加入MgCl2调节终浓度)，0.2mMdNTPs，0.5每种引物，1.0单位DyNAzymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)，以及约50ng/100/zl的模板。使用Ncol和Xhol限制酶消化所述PCR产物，并在电泳之后从琼脂糖凝胶中分离所述片段。将类似的剪切和分离的6.1kbpALK1480片段与PCR片段连接，并转化到大肠杆菌XLl-Blue(Stratagene，USA)中。从转化体中提取质粒DNA，并通过测序验证了一个适合的候选物。所得质粒被命名为pALK1429。PCR反应按上述分别进行，采用的引物对为1—BamMly(SEQIDNO:16)+XhoAge(SEQIDNO:15)和2一BamMly(SEQIDNO:17)十XhoAge(SEQIDNO:15)，以pALK492作为模板(图2)，所得的PCR产物含有所述接头和CBD，使用Mlyl(正好在接头和CBD编码序列所希望的第一个密码子前面产生钝末端)和Agel的进行消化。pALK492携带有约6.9kb的里氏木霉QM6a染色体DNA的Pstl片段，所述里氏木霉QM6a染色体含有被亚克隆至pUC19的Pstl位点中的cbhl/cel7A基因。使用NruI和Agel对以上获得的pALK492进行消化，并将载体部分分别用以上所得的两种消化的PCR产物分离和连接，并转化到大肠杆菌XL1-Blue中。提取质粒DNA，通过测序进行验证并将所得的质粒命名为pALK1430(携带有作为插入物的l一BamMly+XhoAge的PCR产物)和pALK1430(携带有作为插入物的2_BamMy+XhoAge的PCR产物)。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表2所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>:a;<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>pBluescriptlIKS+(Stratagene，USA)类似切割的载体部分进行连接，并转化到大肠杆菌XLlBlue中。提取质粒DNA，通过适当的限制酶消化进行检查并通过测序进行验证。选择一种具有所希望序列的质粒候选物并将其命名为pALK1767。对表1中的构建体#3而言，使用引物对20K—Nco一2(SEQIDNO:12)和20K-NruXho_GPI(SEQIDNO:19)，以pALK1480DNA作为模板，进行PCR反应。使用了两种反应混合物一种具有上述构建pALK1767的组合物，另一种具有加入达3。/。(v/v)的DMSO。这两种反应混合物是分开的，并使用表3中的程序C和D运行。所有的反应都产生了具有所希望大小的DNA片段，将所述制剂用Ncol和Xhol组合和消化。将所述DNA片段分离并与6.1kbpALK1480类似切割和分离的片段进行连接，并转化到大肠杆菌XLlBlue中。提取质粒DNA，通过适当的限制酶消化进行检查并通过测序进行验证。选择一种具有所希望序列的质粒候选物并将其命名为pALK1758。对表1中的构建体糾而言，使用引物对20K_Nco_3(SEQIDNO:13)禾卩20K陽NruXho—WGEI(SEQIDNO:20)，以pALK1480DNA作为模板，进行PCR反应。所述PCR反应混合物含有lxPhusionTMGC反应缓冲液(Finnzymes，芬兰)，0.2mMdNTPs，0.5每种引物，3%(v/v)DMSO和1.0单位PhusionDNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)，以及约70ng/100/xl模板。反应混合物是分开的，并使用表3中的程序C和D运行。两种反应都产生了所希望大小的DNA片段，将所述制剂用NcoI和Xhol组合和消化。将所述DNA片段用pALK1480类似切割和分离的6.1kb片段分离和连接，并转化到大肠杆菌XL1Blue中。提取质粒DNA，通过适当的限制酶消化进行检査并通过测序进行验证。选择一种具有所希望序列的质粒候选物并将其命名为pALK1759。对表l中的构建体#5而言，使用引物对20K一Nco一2(SEQID.NO:12)和20K-NmXho—PavQIPS(SEQID.NO:21)，以pALK1480DNA作为模板，进行PCR反应。使用了两种反应混合物一种具有用于构建pALK1759的上述组合物，另一种没有DMSO。这两种反应混合物是分开的，并使用表3中的程序C和D运行。所有的反应都产生了希望大小的DNA片段，将所述制剂用Ncol和Xhol组合和消化。将所述DNA片段用pALK1480的类似切割和分离的6.1kb片段进行分离和连接，并转化到大肠杆菌XLlBlue中。提取质粒DNA，通过适当的限制酶消化进行检查并通过测序进行验证。选择一种质粒候选物并将其命名为pALK1760;其在唯一的Xhol位点上获得了突变，但对进一步的亚克隆并不会造成问题。对表1中的构建体#6而言，使用引物对20K—Nco—3(SEQID.NO:13)禾Q20K-NruXho—WGEI-2(SEQID.NO:22)，以pALK1480DNA(70ng/100/xl)作为模板，进行PCR反应。使用了与构建质粒pALK1767相同的反应混合物组合物，并使用表3中的程序C运行。制备产物用Ncol和Xhol消化。所述DNA片段用pALK1480的类似切割和分离的6.1kb片段分离和连接，并转化到大肠杆菌XLlBlue中。提取质粒DNA，通过适当的限制酶消化进行检査并通过测序进行验证。选择一种具有所希望序列的质粒候选物并将其命名为pALK1773。使用Nml和Agel对质粒pALK1758、pALK1759、pALK1760和pALK1773分别进行切割，并分离载体部分。将每种制备产物与从经过Mlyl和Agel消化后的pALK1767中分离到的235bp片段相连，并将每种连接混合物分别转化到大肠杆菌XL10-Gold中。提取质粒DNA，通过适当的限制酶消化进行检查并通过测序进行验证。将经过验证的质粒分别命名为pALK1764，pALK1765，pALK1766和pALK1774(表1)。将amdS标记和里氏木霉cbhl3'侧翼区域如下插入载体pALK1764，pALK1765,pALK1766和pALK1774中用EcoRI和Spel切割pALK424，通过Klenow补平反应将所得的4.8kb片段做成钝末端，并分别与用Stul切割的质粒pALK1764、pALK1765、pALK1766和pALK1774分开连接，并转化到大肠杆菌XL10-Gold中。提取质粒DNA，通过适当的限制酶消化检查所希望的插入方向。将验证的质粒分别命名为pALK1768，pALK1769，pALK1770和pALK1775(表l)(图10)。实施例2在里氏木霉中生产融合的20K+CBD蛋白从经过EcoRI消化之后的载体骨架中分离到了来自于质粒pALK1434和pALK1435的8.7kb线性表达盒，并转化到里氏木霉A47原生质体中。根据Penttila等(1987)的描述以及Karhunen等(1993)所述的修改，选择乙酰胺作为唯一氮源进行转化。通过其在PD(土豆右旋糖琼脂(PotatoDextroseAgar))上形成孢子之前的单个分生孢子，在筛选平板上对转化体进行纯化。对来自摇瓶培养(50ml)的培养物上清液中的转化体的20K+CBD产物进行分析。所述转化体在用pH5.5的5%KH2P04缓冲的复合纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等1993)中生长7天。融合蛋白的酶活性测定为，在50。C于pH7.0的50mMHepes缓冲液中，IO分钟内还原糖从羧甲基纤维素(3%CMC)中的释放(NCU活性，nkat;Bailey和Nevalainen，1981;Haakana等，2004)。最佳的生产转化体的NCU活性示于表4。通过用Southern杂交验证了所选择转化体的基因型，所述Southern杂交中包括了若干基因组的消化产物并将各自的表达盒用作探针。可使用从纯化Melanocarpusalbomyces20K中性纤维素酶(Haakana等2004)产生的多克隆抗体和ProtoBlotWesternblotAP系统(Promega)，从培养物上清液中测定20K+CBD蛋白。Western杂交分析表明融合的20K+CBD酶在里氏木霉中是主要作为稳定的融合蛋白产生的。表4从摇瓶培养中选择的20K+CBD转化体的NCU活性<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>在表4中，构建编号可参见表l;RF编号是指所述转化体作为RF菌株的命名。可通过Western杂交，将所述表达盒对于cbhl(cel7A)基因座可能的靶定作为CBHI-阴性基因型进行筛选。可使用单克隆抗体CI-258或CI-261(Aho等，1991)以及ProtoBlotWesternblotAP系统(Promega，USA)对CBHI蛋白进行检测。通过使用Southern杂交验证了所选择转化体的基因型，所述Southern杂交中包括了若干基因组的消化产物，并将各自的表达盒用作探针。从经过EcoRI消化之后的载体骨架中，分离到了从实施例1中制备的质粒pALK1768、pALK176、pALK1770和pALK1775的8.7kb线性表达盒，并转化到以乙酰胺作为唯一氮源筛选的里氏木霉RF5796和RF5798原生质体中(两种菌株都来自菌株QM6a(Bailey和Nevalainen，1981)，并具有对内源型里氏木霉纤维素酶的表型CBHI-CBHII-EGI-EGII-)。通过其在PD上形成孢子之前的分生孢子，在筛选平板上对转化体进行纯化。从摇瓶培养(50ml)的培养物上清液中，分析转化体的20K+CBD产物。所述转化子在用pH5.5的5%KH2P04缓冲的复合纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等1993)中生长7天。然后，产生的20K+CBD融合蛋白的NCU活性按上述分析。选择的转化体的NCU活性示于表5。通过使用Southern杂交验证了所选择转化子的基因型，所述Southern杂交中包括了若干基因组的消化产物，并将各自的表达盒用作探针。可使用从纯化的Melanocarpusalbomyces20K中性纤维素酶(Haakana等2004)产生的多克隆抗体和ProtoBlotWesternblotAP系统(Promega)，从培养物上清液中检测20K+CBD蛋白。Western杂交分析表明融合的20K+CBD酶是由转化体产生的。一些培养物还表现出与抗20K抗血清反应的条带，并具有野生型20K蛋白的迁移率，说明有可能在培养过程中发生了所述接头+CBD的一些剪切。pALK1770转化体产生的20K+CBD融合蛋白由于其稳定性，被选择进行深入研究。表5从摇瓶培养选择的20K+CBD转化体的NCU活性<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>在表5中，构建编号可参见表l;RF编号是指所述转化子作为RF菌株的命名。将里氏木霉菌株RF5582、RF5583、RF6036、RF5977和RF5978生长于生物反应器中供检测使用。对一些制备产物进行热处理(pH6.0，65°C，60-70分钟)，从而灭活任何残余的里氏木霉内源性酶活性。所述20K+CBD是相对热稳定的(Miettinen-Oinonen等2004)，并且在处理过程中不会变性。实施例3在里氏木霉中生产融合的20K+CBD亲合突变蛋白将Melanocarpusalbomyces20K(cel45A，AC#AJ515703)酶融合于里氏木霉CBHI的纤维素结合结构域(CBD)，其中在31(相应于成熟多肽的Y492)和/或32位(相应于成熟多肽的Y493)上保守的酪氨酸残基被突变为丙氨酸，如Linder等，1995所述。除此之外，31位上的酪氨酸残基还可被色氨酸所替代，所述色氨酸是在例如灰色腐质霉(Humicolagrisea)CBHI(Azevedo等，1990)和里氏木霉EGV(Cel45A，Saloheimo等，1994)的CBD区域中天然发现的氨基酸。突变的CBD是通过PCR构建的，并且在里氏木霉CBHI的纤维素结合结构域中也包括了Y31A、Y32A、Y31W以及Y31A_Y32A的氨基酸取代(根据CBD的氨基酸序列进行的编号)。在全部构建体中，都使用了正向引物3—BamMly:5'-TAGGATCCGAGTCCCATTA-CCGGCAACCCTAGCG-3'(SEQID.NO:18)。用于扩增不同CBDmutf物的反向引物如表6所示。所述PCR反应混合物含有1xPfuUltraHF反应缓冲液(Stratagene，USA)，其提供了2mMMg"浓度，0.2mMdNTP，2AtM每种引物和1.5单位PfuUltraHFDNA聚合酶(Stratagene，USA)，以及约45ngpALK492质粒作为模板。pALK492(图2)质粒含有里氏木霉cbhl基因。PCR反应条件如下95'C起始变性2分钟，然后是30个循环的95°C1分钟、65°C(±5°C梯度)退火1分钟、72°C延伸2分钟、以及72。C的最终延伸IO分钟。表6为扩增突变CBD产物设计的反向PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>在退火温度为60°C的PCR反应中，所有引物组合都产生了特定的DNA片段。PCR产物从这些反应中分离，用Xhol和BamHI限制酶消化，并随后克隆至pBluescriptlIKS+(Stratagene，USA)中。所得的质粒被命名为pALK1884(Y31A突变)，pALK1885(Y32A突变)，pALK1886(Y31W突变)以及pALK1887(Y31A一Y32A突变)。通过测序验证了质粒中的PCR片段。质粒pALK1884至pALK1887的Mlyl和Agel消化插入物被进一步连接于Nru和Agel消化的pALK1760载体片段，该片段含有融合于里氏木霉cbhl(cd7A)启动子和终止子的全长Melanocarpusalbomyces20K基因。对pALK1760中20K基因的C-末端部分进行修饰，使得CBD片段的连接产生了PAVQIPSS的连接点(构建体#5)，其在里氏木霉中表现出产生了稳定的融合产物，如实施例1和2所述。在最后步骤中，将amdS标记作为p3SR2质粒(图6)的钝末端SpeI-EcoRI片段(4.5kb)加入，以获得了在里氏木霉中产生融合的20K+CBD咖t酶的表达质粒pALK1877(Y31A突变)，pALK1878(Y32A突变)，pALK1879(Y31W突变)，和pALK1880(Y31A—Y32A突变)。融合于后面跟着突变CBD区域的接头肽的20K蛋白的氨基酸序列如图IIB所示。通过测序验证表达载体，在Notl消化后的载体骨架中分离8.4kb的线性表达盒(图IIA)，并转化到里氏木霉RF5796原生质体中。根据Penttila等(1987)以及Karhunen等(1993)所述的修改，选择乙酰胺作为唯一氮源，进行转化。通过其在PD上形成孢子之前的单个分生孢子，在筛选平板上对转化体进行纯化。从摇瓶培养(50ml)的培养物上清液中分析转化体的20K+CBDmut产生。所述转化体在用pH5.5的5%KH2P04缓冲的复合纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等1993)中生长7天。融合蛋白的酶活性测定为，在5(TC、pH7.0的50mMHepes缓冲液中，10分钟内从羧甲基纤维素(3%CMC)释放的还原糖(NCU活性，nkat;Bailey禾BNevalainen，1981;Haakana等，2004)。最佳的生产转化体的NCU活性示于表7。通过使用Southern杂交验证所选择转化体的基因型，所述Southern杂交其中包括了若干基因组的消化产物，并将各自的表达盒用作探针。可使用从纯化的Melanocarpusalbomyces20K中性纤维素酶(Haakana等2004)产生的多克隆抗体和ProtoBlotWesternblotAP系统(Promega)，从培养物上清液中测定20K+CBDmut蛋白。Western杂交分析表明融合的20K+CBD^t酶在里氏木霉中是作为稳定的融合蛋白产生的。表7从摇瓶培养选择的20K+CBD自转化体的NCU活性<table>complextableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>RF编号是指所述转化子作为RF菌株的命名为。对菌株RF6084-RF6086,RF6088,RF6090-RF6092和RF6094进行发酵，以获得供检测使用的材料(参见实施例9-11)。实施例4在里氏木霉中制备融合的20K+CBD接头缺失蛋白将Melanocarpusalbomyces20K酶融合于里氏木霉CBHI的纤维素结合结构域^CBD)，通过向结构域间接头多肽中引入缺失对其进一步修饰。根据Srisodsuk等，1993的描述设计接头缺失。在成熟多肽中434-444位氨基酸的缺失(突变体AG-444)去除了包括有富含甘氨酸和脯氨酸重复序列的约三分之一接头，但却保留了全部完整的推定的O-糖基化位点。434-460位氨基酸残基的缺失(突变体AG-460)事实上去除了所有的接头(图12A)。还构建了在CBD区域中具有Y31A—Y32A亲合双突变的其他20K+CBD接头缺失。进行PCR反应以向接头肽中引入缺失并向CBD区域中引入氨基酸取代。按实施例3的描述进行PCR扩增，除了使用6(TC(i5'C)的退火温度。分别使用正向引物ACCACCCGCCGCCCAGCC-3'(SEQID.NO:31)和5-TAGGATCCGAGTCCCATTACCGGCAACCCTAGCCC-TACCCAGTCTCACTACGGCCAGTGC-3'(SEQID.NO:32)来合成AG-444和AG-460的接头缺失。相对应地，使用反向引物5'-TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGCT-TTACAGG-3(SEQID.NO:33)来扩增里氏木霉CBHI的完整CBD区域。采用反向引物TACAGGCACTGAGAGGCGGCAGGGTTCAGG-3'(SEQID.NO:30)来产生CBD区域中的Y31AY32A突变。在55.2'C-65.(TC退火温度范围的PCR反应中，全部引物组合都产生了特定的DNA片段。根据实施例3的描述构建体表达质粒pALK1893(△G-444缺失)，pALK1896(AG-460缺失)'pALK1899(AG-444缺失，Y31A—Y32A突变)以及pALK1952(AG-460缺失，Y31A—Y32A突变)。融合于后面跟着完整或突变CBD的截断的接头肽的20K蛋白的氨基酸序列如图12B所示。从EcoRI消化后的载体骨架中分离8.3kb的线性表达盒，并转化到里氏木霉RF5796原生质体中。转化，转化体纯化，摇瓶培养，活性测定，Southern杂交以及Western杂交分析都根据实施例3所述进行。表8从摇瓶培养选择的20K+CBD接头缺失转化体的NCU活性<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>RF数字是指所述转化体作为RF菌株的命名。对菌株RF6107、RF6108、RF6110-RF6112和RF6114-RF6116进行发酵，以获得供检测应用的材料(实施例9-11)。Western杂交分析表明融合的20K+CBD接头缺失酶是作为稳定的融合蛋白在里氏木霉中产生的。实施例5在里氏木霉中产生重组的Melanoca卬usalbomyces50K+CBD融合蛋白质粒构建体被设计为将Mela鹏arpusalbomyces50K(Cel7A，AC#AJ515704)编码序列与里氏木霉CBHI(cel7A，AC#AR088330;Srisodsuk等1993)的接头区和纤维素结合结构域(CBD)相连。质粒pALK1237(图4)，是新构建体的基础，其含有在里氏木霉cbhl启动子控制之下的cel7A基因作为精确融合物。首先，向50K编码序列的C末端附近引入唯一的Nrul限制性位点。其使得成熟50K多肽的氨基酸S393之后任意钝末端的DNA直接融合(图13B)。使用引物2—50K_NrulSpel(5'CGGCAC-TAGTTCGCGACCCGATCTCGCCCCAGCGCAGG3';SEQID.NO:25)和50K—Xhol(5'CGCCGAGGGCCGGCTCGAGAGCATCC3';SEQID.NO:26)，用pALK1237为模板，进行PCR反应。所述PCR反应含有1xDyNAzymeTMEXT反应缓冲液(Finnzymes，芬兰)，0.25mMdNTPs，0.5pM各种引物，2.0单位DyNAzymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes,芬兰)，以及约50ng/100jtd的pALK1237模板DNA。PCR扩增条件如下96。C起始变性5分钟，然后是25个循环的96°C15秒，56°C或6rC退火60秒，72。C延伸60秒，以及72'C的最终延伸10分钟。使用Xhol和Spel限制酶消化PCR产物，并从琼脂糖凝胶中纯化。将纯化的PCR片段连入质粒pALK1237的6.9kbXhol-Spel限制性片段中，并转化到大肠杆菌XLl-Blue(Stratagene，USA)。从转化体中提取质粒DNA，并通过测序验证了三个候选物。所选择的克隆被命名为pALK1703。里氏木霉CBHI接头+CBD是以PCR扩增的，引物为3一BamMly—50(5'TTGG-ATCCGAGTCGCAGCACCGGCAACCCTAGCG3';SEQID.NO:36)禾卩XhoAge(5'TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGC3';SEQID.NO:15)，用pALK492作为模板。PCR反应条件如上所述，除了在扩增反应中的延伸时间为90秒。使用Mlyl和AgeI酶消化PCR产物，并从琼脂糖凝胶中纯化。将含有PCR片段的接头+CBD连入质粒pALK1703的6.8kbAgel-Nrul限制性片段，并转化到大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene，USA)。如上所述对转化体进行分析，并将适当的克隆命名为pALK1704。为了对里氏木霉转化体进行筛选，可将amdS标记基因和里氏木霉cbhl3'侧翼区域插入载体质粒pALK1704。分离pALK424的4.8kbEcoRI-SpeI限制片段(US5,837,515)，并使用Klenow酶补平所述片段的末端。将钝末端amdS标记片段连入经Stul消化的pALK17(H并转化到大肠杆菌XLl-Blue(Stratagene，USA)。从转化体提取质粒DNA，并通过限制酶消化验证所希望的插入方向。将选定的转化体命名为pALK1708。通过EcoRI消化，从pALK1708骨架中分离9.2kb的线性表达盒(图13A)，转化到里氏木霉RF5636原生质体(得自菌株QM6a;Bailey和Nevalainen，1981)，并以乙酰胺作为唯一氮源筛选转化体。所述宿主菌株缺乏三种主要的内源纤维素酶CBHII(Cel6A)，EGI(Cel7B)和EGII(Cel5A)。根据Penttila等(1987)的描述以及Karhunen等(1993)所述的修改进行转化。转化体在PD上形成孢子之前，通过其单个分生孢子在筛选平板上进行纯化。从摇瓶培养(50ml)的培养物上清液中分析转化体产生的50K+CBD融合蛋白。所述转化体在用pH5.5的5%KH2P04缓冲的复合纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等1993)中生长7天。融合蛋白的酶活性测定为，在50°C、pH7.0的50mMHepes缓冲液中，羧甲基纤维素(3%CMC)释放的还原糖(NCU活性；Bailey和Nevalainen,1981;Haakana等，2004)。所述转化体的活性不同，从2035-3633NCU/ml。使用从纯化的Melanocarpusalbomyces50K中性纤维素酶(Haakana等2004)产生的多克隆抗体，通过使用ProtoBlotWesternblotAP系统(Promega)，从培养物上清液中测定50K+CBD蛋白。Western杂交分析表明从里氏木霉中产生的50K+CBD融合蛋白是稳定的。用表达盒作探针，通过Southern杂交，分析选择的转化体的基因型。还可通过使用单克隆CBHI抗体(CI-261,Aho等，1991)检测CBHI蛋白的Western杂交，来验证表达盒对于cbhl基因座可能的靶定。实施例6在里氏木霉中生产重组Melanocarpusalbomyces50KB+CBD融合蛋白质粒构建体被设计为将Melanocarpusalbomyces50KB(Cel7B，AC#AJ515705)的编码序列与里氏木霉CBHI(cel7A，AC#AR088330;Srisodsuk等1993)的接头区和纤维素结合结构域(CBD)相连。质粒pALK1241(图5)，是新构建体的基础，其含有在里氏木霉cbhl启动子控制之下作为精确融合物的cel7B基因。首先，向50KB编码序列的C末端附近引入唯一的NruI限制性位点。其可使在成熟50KB多肽的氨基酸S426之后的任意钝末端DNA直接融合(图14B)。用引物50KB_NrulXhol(5'TCGTCTCGA-GTCGCGATGGGGCCGAAGCGGATGTTGG3';SEQID.NO:23)和50KB—Sphl(5'GGAGGGCATGCCCAACAGCAGCGAGATCACC3';SEQID.NO:24)，用pALK1241为模板，进行PCR反应。所述PCR反应含有1xDyNAzymeEXT反应缓冲液(Finnzymes，芬兰)，0.25mMdNTPs，0.5/xM各种引物，2.0单位DyNAzymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)，以及约50ng/100pl的pALK1241模板DNA。PCR扩增条件如下96°C起始变性5分钟，然后是25个循环的96°C15秒，56。C或60。C退火60秒，72'C延伸60秒，以及72°C的最终延伸5分钟。使用Xhol和Sphl限制酶消化PCR产物，并从琼脂糖凝胶中纯化。将纯化的PCR片段连入质粒pALK1241的6.9kbXhol-Sphl限制性片段，并转化到大肠杆菌XLl-Blue(Stratagene，USA)。从转化体中提取质粒DNA，并通过测序验证了一个候选物。所选择的克隆被命名为pALK1705。里氏木霉CBHI接头+CBD用PCR扩增，引物为3—BamMly—50(5'TTG-GATCCGAGTCGCAGCACCGGCAACCCTAGCG3';SEQID.NO:18)禾卩XhoAge(5，TGACTCGAGACCGGTGCGTCAGGCTTTCGC3';15)，pALK492作为模板。。PCR反应条件如上所述，除了在扩增反应中的延伸时间为90秒。使用Mlyl和AgeI酶消化所述PCR产物，并从琼脂糖凝胶中纯化。将含有PCR片段的接头+CBD连入pALK1705的7.2kbAgel-Nml限制性片段，并转化到大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene，USA)。如上所述对转化体进行分析，并将适当的克隆命名为pALK1706。为了对里氏木霉转化体进行筛选，可将amdS标记基因和所述里氏木霉cbhl3'侧翼区域插入载体质粒pALK1706。分离pALK424的4.8kbEcoRI-SpeI限制片段(US5,837,515)，并使用Klenow酶补平所述片段的末端。将所述钝末端amdS标记片段连入Stul消化的pALK1706并转化到大肠杆菌XLl-Blue(Stratagene，USA)。从所述转化体提取质粒DNA，并通过限制酶消化验证所希望的插入方向。将选定的转化体命名为pALK1709。通过EcoRI消化从pALK1709骨架中分离9.2kb的线性表达盒(图14A)，转化到里氏木霉RF5636原生质体，并以乙酰胺作为唯一氮源筛选转化体。所述宿主菌株缺乏三种主要的内源纤维素酶CBHII(Cel6A)，EGI(Cel7B)和EGII(Cel5A)。根据Penttila等(1987)的描述以及Karhunen等(1993)所述的修改进行转化。转化体在PD上形成孢子之前，通过单个分生孢子在筛选平板上对其进行纯化。从摇瓶培养(50ml)的培养物上清液中分析转化体产生的的50KB+CBD融合蛋白。所述转化体在用pH5.5的5%&11204缓冲的复合纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等1993)中生长7天。使用4-甲基伞形基-/3-0-乳糖苷底物测定融合蛋白的纤维二糖水解酶活性^1^活性；vanTilbeurgh等1988)。可使用从纯化的Melanocarpusalbomyces50KB纤维素酶(Haakana等2004)产生的多克隆抗体，通过ProtoBlotWesternblotAP系统(Promega)，从培养物上清液中测定50KB+CBD蛋白。Western杂交分析中没有检测到野生型50KB蛋白，表明从里氏木霉中产生的50KB+CBD融合蛋白是稳定的。可用表达盒作为探针，以Southern杂交分析所选择转化体的基因型。还可通过使用单克隆CBHI抗体(CI-261，Aho等，1991)检测CBHI蛋白的Western杂交，来验证表达盒对于cbhl基因座可能的靶定。实施例7在里氏木霉中生产重组嗜热子囊菌CBHI+CBD融合蛋白将嗜热子囊菌CBHI(AC#AF478686,Hong等，2003;SEQID.NO:9)与里氏木霉CBHI(AC#AR088330;Srisodsuk等1993;SEQID.NO:3)的接头和CBD融合。首先，使用引物5'-TTAAAC--CGGCAACCCTAGCGGC-3'(正向序列，SEQID.NO:34)和5-TATATGCGGCCGCACCGGTGCGTCAGGCTTTCGCACGGAGC-TTTACAGGC-3'(反向序列，SEQID.NO:35)，通过PCR合成里氏木霉CBHI接头和CBD的编码序列。所述PCR反应混合物含有1xDyNAzymeEXT反应缓冲液(Finnzymes，芬兰)，15mMMg2+，0.2mMdNTPs，2juM各种引物，0.6单位DyNAzymeEXTDNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)，以及约75ng/30/d的pALK492模板。pALK492质粒含有里氏木霉cbhl(cel7A)基因。PCR反应条件如下98'C起始变性2分钟，然后是30个循环的98。C30秒，68°C(±4°C梯度)退火30秒，72。C延伸30秒，以及72°C的最终延伸IO分钟。在64°C-68.5°C的退火温度范围内，在所述PCR反应中获得了特定DNA片段。使用Ndel和Notl限制酶，对还含有嗜热子囊菌cbhl基因3'-末端核苷酸序列的合成CBD片段进行消化，并在电泳之后从琼脂糖凝胶中分离所述片段。此后，分离的PCR片段与Ndel和Notl消化的含有全长嗜热子囊菌cbhl基因的pALK1649(图7)载体片段连接。所得质粒被命名为pALK1888，并通过测序对所述质粒中的PCR扩增片段进行验证。作为融合的结果，在pALK1888质粒中的嗜热子囊菌CBHI的C-末端部分含有GPIGST的连接点(图15B)。将SacII和Agel消化的质粒pALK1888的插入物与SacII和Agel消化的pALK1694(图8)载体片段相连，其产生了融合于里氏木霉cbhl(cel7A)启动子(精确融合物)和终止子的嗜热子囊菌CBHI+CBD。在最后步骤中，加入amdS标记片段，如实施例3所述，以获得表达质粒pALK1890，用于在里氏木霉中产生重组嗜热子囊菌CBHI+CBD融合酶。融合于接头肽后面跟着里氏木霉CBHI的CBD区域的嗜热子囊菌CBHI蛋白的氨基酸序列示于图15B。通过限制酶消化确证表达质粒，并在经过N0tl消化之后从载体骨架中分离8.9kb的线性表达盒(图15A)，并将其转化到里氏木霉RF5796原生质体。根据Penttila等(1987)的描述以及Karhunen等(1993)所述的修改进行转化。转化体在PD上形成孢子之前，通过单个分生孢子在筛选平板上对其进行纯化。从摇瓶培养(50ml)的培养物上清液分析转化体的嗜热子囊菌CBHI+CBD生产。所述转化体在用pH5.5的5%KH2P04缓冲的复合纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等1993)中生长7天。根据vanTilbeurgh等1988的描述，使用4-甲基伞形基^-D-乳糖苷(MUL)底物分析纤维二糖水解酶活性。通过使用其中包括了若干基因组的消化产物的Southern杂交，并将表达盒用作探针，验证所选择的转化体的基因型。SDS-PAGE分析表明重组嗜热子囊菌CBHI+CBD酶在里氏木霉中是作为稳定融合蛋白产生的。实施例8融合的20K+CBD蛋白制剂在粗斜纹棉布修整/生物石磨中的性能对按照实施例2所述用木霉作为宿主产生的20K+CBD融合蛋白，检测其在粗斜纹棉布的生物石磨中产生与浮石所提供的磨损外观相似的能力。在粗斜纹棉布修整中有效的商业化20K制剂用作比较。用ECOSTONEA200a-淀粉酶脱浆之后，具有硫磺底的靛蓝染色的粗斜纹棉布斜纹布制作的英国牛仔裤用作检测材料。所述织物的经纱和讳纱是环锭纺制的。在表9所述的条件下，用Electrolux'sWascatorFOM71CLS洗衣机脱水机进行纤维素酶处理。表9用于纤维素酶处理的检验条件<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>酶的剂量为单位重量织物的中性纤维素酶活性单位(NCU)进行酶的给量。在排水之后，通过加入5gNaOH(10分钟，40'C)将pH提高至11以上，并漂洗三次来灭活纤维素酶。将牛仔裤在转筒中干燥。每次检验使用两条牛仔裤。使用L*a*b色空间坐标，使用MinoltaCM2500或CM1000分光光度计，通过测定颜色的反射值评定生物石磨的效果/磨损水平(光源D65/2°)。在脱浆之后(即，在纤维素酶处理之前)和纤维素酶处理之后，测定粗斜纹棉布的正面和反面的颜色(数据未显示)。每个测定值都是约40次测定的平均值。每次检验都使用两条牛仔裤，且最终的结果是其平均数。在酶处理之后的亮度或亮度的升高可用来评定磨损效果(性能或生物石磨效果)。结果示于表10和11，其中粗体被用来强调类似的磨损水平和相等的剂量。使用20K或不使用任何酶的处理被用作比较。一些制剂(表11)经过热处理(pH6.0，65°C，60-70分钟)，为了灭活任何残留的里氏木霉内源酶活性和/或为了检验所述热处理对于酶稳定性的效果。表IO用20K+CBD融合蛋白处理粗斜纹棉布正面的颜色测定<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>!^是指亮度，-M是蓝方向，+1>*是黄方向商业制剂<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表10和图16中的结果表明，与20K菌株相比，本发明的20K+CBD融合蛋白在粗斜纹棉布处理中的洗涤性能得到了大为改善。使用菌株RF5977，可以使用低至250NCU/g织物的酶剂量，就能够获得与使用1500NCU/g剂量的20K所得的磨损水平(光度L"类似。因此，得到6倍更佳的洗涤性能，而对比度也好。同样，使用菌株RF5978获得的洗涤性能与使用RF5977所得的类似。对融合蛋白制剂的热处理似乎有所降低石洗效果，例如使用RF5977，需要500NCU/g织物的剂量才能获得与使用未经热处理制剂的250NCU/g的剂量相同的磨损水平(表10)。然而，与现有技术的制剂相比，仍在洗涤性能中获得了3倍的改善。实施例9融合的20K+CBD亲合突变体蛋白和融合的20K+CBD接头缺失蛋白制剂在粗斜纹棉布修整/生物石磨中的性能如实施例3所述用木霉作为宿主产生的融合20K+CBD亲合突变体酶，和如实施例4所述用木霉作为宿主产生的融合20K+CBD接头缺失蛋白，对其在粗斜纹棉布的生物石磨中的能力进行检验。在粗斜纹棉布修整中有效的商业化20K制剂用作比较。用于生物石磨的粗斜纹棉布和检验系统如实施例8所述。同样，关于纤维素酶处理效果的评定也如实施例8所述。对示例性融合20K+CBD亲合突变体蛋白和融合20K+CBD接头缺失蛋白制剂进行生物石磨检验的结果如表12所示。具有Y31W氨基酸取代的菌株RF6090表现出了极好的洗涤性能(比20K大约好6倍)和良好的对比度。菌株RF6090与20K的效力比较也能在图16中明确看出。具有Y31A氨基酸取代的菌株RF6084大约比20K好1.5倍。具有Y32A或Y31A—Y32A氨基酸取代的融合20K+CBDmut蛋白的生物石磨效果比20K低。与20K菌株相比，20K+CBD接头缺失蛋白在粗斜纹棉布处理中的洗涤性能大为改善并得到了良好的对比度。用菌株RF6108(AG-444)的洗涤性能比20K至少好6倍，用菌株RF6110(AG-460)大约好3倍。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>实施例1020K+CBD融合蛋白对粗斜纹棉布强度的影响从从用20K+CBD融合蛋白(实施例8和9)进行洗涤检验所获得的牛仔裤中选择磨损水平相似(在纤维素酶处理后L、值为约23或24)的一些，进行强度测定。根据标准SFS-ENISO13937-1，通过Elmendof法，对用20K+CBD融合蛋白处理之后的撕裂强度和对照样本进行了测定。样本在经纱和讳纱方向切取。所得结果如表13所示。纤维素酶融合蛋白引起了与20K基本上相同或更低的强度损失，即，使用某些制剂，织物的强度能够保持的更高。在经纱和纬纱方向上强度丧失最低是用接头缺失AG-444的菌株RF6108获得的。同样，具有Y31W氨基酸取代的亲合突变体RF6090引起的强度丧失比20K低。而菌株RF5977具有与20K相类似的对于织物强度的影响。用热处理融合蛋白制剂(实施例8，表ll)洗涤的一些牛仔裤也被选择进行抗撕强度测定。应该注意到用某些热处理制剂，织物的强度改善，但是由于降低了洗涤效果，需要使用更高的剂量来获得相同的磨损水平。表13用本发明20K+CBD融合蛋白处理的牛仔裤的撕裂强度测定<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>商业制剂实施例11选择的20K+CBD融合蛋白制剂与现有技术酶制剂的比较使用其它类型的粗斜纹棉布对实施例8和9中的最佳20K+CBD融合蛋白进行检验。在粗斜纹棉布修整中有效的20K制剂(Ecostone⑧NP8500)和两种可商业获得的现有技术制剂，Novozymes的DeniMax399S和Meiji的Mex500，其是在可商业获得的最浓縮的固体酶制剂，用作比较。对生物石磨的检验系统如实施例8所述。除了粗斜纹棉布装载量为lkg，因此浴比略高。将5块由DownUnder粗斜纹棉布斜纹布(BradmillTextilesPty，澳大利亚)制造的粗斜纹棉布("裤腿")在脱浆之后用于每次检验。所述织物的经纱和讳纱是环锭纺制的。酶按NCU-活性单位给量，因此获得相似的磨损水平(测定为纤维素酶处理之后粗斜纹棉布正面的亮度)。纤维素酶处理的效果按照实施例8评定，除了对每个裤腿进行20次颜色检测。从每次洗涤检测中选择两个具有类似磨损水平(纤维素酶处理之后L、值为约26)的裤腿进行强度检测。用20K+CBD融合蛋白处理之后的撕裂强度和对照样本的测定如实施例10所述。所得结果如表14和图17A和17B所示。纬纱的撕裂强度，通常弱于经纱，但在使用菌株RF5977、RF6090、RF6108和RF6110的融合蛋白处理之后要高于经过20K处理的强度。与DeniMax399S和Mex500相比，用所有融合蛋白菌株都得到了经纱和纬纱方向强度显著提高。同样，与其他现有技术的制剂相比，20K菌株对织物强度的损伤更小。表14用本发明20K+CBD融合蛋白、20K和现有技术制剂处理粗斜纹棉布的撕裂强度检测<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>L^是指经过纤维素酶处理之后粗斜纹棉布正面的亮度实施例1220K+CBD制剂在生物修整(防止起球)中的性能检验了浓縮20K+CBD融合蛋白制剂在生物修整中的性能。将商业化的富含EGII的酸性纤维素酶制剂(US5，874,293)用于生物修整制品，并将没有经过酶处理的情况用作比较。使用Electrolux'sWascatorFOM71CLS洗衣机脱水机在表15所述的条件下进行防止起球的处理。两种100%棉制造的未用过的套衫块料基于平针织物的织物和具有绒毛表面的螺纹织物用作有填料的检验材料。样本先在6(TC用lml/1表面活性剂/湿润剂(Sandos的SandocleanPCJ和Clariant的ImacolCN)预洗涤10分钟并漂洗3次。之后，在存在预洗涤所用的相同纺织品助剂的条件下，用纤维素酶在60°C处理60分钟所述棉织品(cottonknits)。在脱水之后，通过使用氢氧化钠将pH调至11以上灭活酶(6(TC10分钟)。然后将针织品的块料漂洗三次并在滚筒上干燥。表15用于生物修整处理的检验条件/加工参数<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>用裸眼和放大镜对纤维素酶处理的效果进行视觉评定。所得结果如表16所示，拍摄的目标放大的数码相机照片如图18所示。20K+CBD融合蛋白制剂具有优秀的生物修整性质，导致了起毛的广泛降低并防止起球，其可以在图18的照片(摄自螺纹针织样品)中清楚地看到。未经酶处理的对照样本，特别是螺纹织物套衫，含有密集的表面绒毛和严重的起球。用20L+CBD制剂，相用最少剂量(0.25%织物重量，o.w.f)已经获得了非常清洁的针织物表面，相当于125NCU/g织物的中性纤维素酶活性的。这一剂量产生了与几乎两倍剂量一样好的效果。与使用0.63。/。0.W.f.的富含EGII的制剂的剂量比较，这是在生物修整应用中该酶浓度的常用剂量，用织物重量的0.5%20K+CBD制剂的剂量，也可以获得类似的去球效果。同样，由重组宿主产生的20K+CBD培养基在生物修整中的有效性，体积上至少两倍有效于通过重组宿主产生的EGII。表16与富含RGII和没有酶的对照相比，用20K+CBD融合蛋白进行生物修整处理的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>a)织物的重量b)+++++极好的去球效果，视觉上非常清洁的表面++++非常好的去球效果，视觉上清洁的表面-密集的表面绒毛和/或严重的起球实施例1320K+CBD制剂在去污剂应用中的性能可通过使用0-0.5%去污剂制品(标准去污剂ECE98)重量的酶，所述制品中不含任何酶，在家用洗衣机中通过重复洗涤循环来检验颗粒化20K+CBD融合蛋白制剂的效力。检验条件如表17所示。装载量、去污剂剂量以及主要的检验条件根据标准EN60456:2003，但另具污渍。在经过5，10和15次洗涤之后采集织物样本。表17检验20K+CBD制剂性能的检验设计<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>加入的人造污物每种类型总共38片(37x37cm)Art.No.101*炭黑/橄榄油弄脏的棉布Art.No.163*麦片粥弄脏的棉布Art.No.112*可可弄脏的棉布检验纺织品Art.No.224*的抗发灰Art.No.224*的抗张强度*来自EMPATestmaterialenAG，瑞士在材料224(ISO2267)进行和测定为颜色匹配差异的抗发灰检验结果，示于表18和19以及图19和20。使用Spectraflsh500色度计(亮度D65/10°)，采用三刺激法测定色差。20K+CBD融合蛋白制剂在三刺激颜色值Y上具有正性作用，因此是抗发灰的。不同酶浓度的作用几乎相同。极低的酶浓度(0.10%)就足以抗发灰。而与含有高出1.8倍中性纤维素酶活性(NCU)的商业去污剂纤维素酶BIOTOUCHDCC相比，使用20K+CBD融合蛋白就能获得类似的效果(数据未显示)。材料224洗涤15次之后，也同样用于根据ISO13934-1:1999的抗张强度检测(数据未显示)。没有任何一个酶浓度对抗张强度有损伤作用。所有的结果都处于彼此的离差范围之内(变化±2.5%)。相同的结果可适用于拉伸直至断裂负载。表1820K+CBD融合蛋白在去污剂应用中的性能酶洗涤抗发灰的物品224和原始(未洗涤)物品之间的颜色匹配差异<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>表1920K+CBD融合蛋白在去污剂应用中的性能酶洗涤抗发灰的物品224和未使用酶洗涤之间的颜色匹配差异<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>参考文献AlioS,VOlkkonen,TJalava,MPaloheimo,RB13hler,M-LNiku-Paavola,EHBamfordandMKorhola.1991.Monoclonalantibodiesagainstcoreandcellulose-bindingdomainsofTrichodermareeseicellobiohydrolasesIandIIandendoglucanaseLEur.J.Biochem.200:643-649.AzevedoMdeO，FelipeMS，Astolfi-FilhoS,RadfordA.1990.Cloning,sequencingandhomologiesofthecbh-1(exoglucanase)geneofHum:icolagriseavar.the'rmoidea.JGenMicrobiol.136:2569-2576.BaileyMJandNevalainenKMH.1981.Induction,isolationandtestingofstableTrichoderniareeseimutantswithimprovedproductionofsolubilizingcellulase.EnzMicrobiolTechnol.3:153-157.HaakanaH,Miettinen-OinonenA，JoutsjokiV，MantylaA,SuominenP,andVehmaa叩eraJ.2004.CloningofcellulasegenesfromMelanocarpusalbomycesandtheirefficientexpressioninTrichodermareesei.EnzMicrobiolTechnol.34:159-167.HenrissatB.(1991)Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Bioche'm.J.280:309-316.HenrissatB.andBairochA.(1993)Newfamiliesintheclassificationofglycosylhydrolasesbasedonaminoacidsequencesimilarities.Biochem.J.293:781-788.HongJ，TamakiH,YamamotoKandKumagaiH.2003.CloningofageneencodingthermostablecellobiohydrolasefromThermoascusaurantiacusanditsexpressioninyeast.ApplMicrobiolBiotechnol63:42-50.JoutsjokiVV,TorkkeliTK,andNevalainenKMH.1993.Transforma-tionofTrichodermareeseiwiththeHormoconisresinaeglucoamylaseP(gamP)gene:productionofaheterologousglucoamylasebyTrichodermareesei.Curr.Genet.24:223-228.KarhunenT,AMantyla,KMHNevalainen,andPLSuominen.1993.Highfrequencyone-stepgenereplacementinTrichodermareesei.I.Endoglu-canaseIoverproduction.Mol.Gen.Genet.241:515-522.LaemmliUK.1970.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature227:680-685,LinderM,MattiiienML，KontteliM,LindebergG,StahlbergJ,Dra-kenbergT,ReinikainenT,PetterssonG,AnnilaA.1995.Identificationoffunc-tionallyimportantaminoacidsinthecellulose-bindingdomainofTrichodermareeseicellobiohydrolaseI.ProteinScience4:1056-1064.LowryOH,NJ'Roseborough，ALFairandRJRandall.1951.ProteinmeasurementwiththeFoNnphenolreagent.J，BiolChem193:265-275.MalardierL，DaboussiMJ，JulienJ，RousselF,ScazzocchioCandBrygooY.1989.Cloningofthenitratereductasegene(niaD)ofAspergillusnidulansanditsusefortransformationofFusariumoxyspomm.Gene15:147-156.Miettinen-OinonenA,LondesboroughJ,JoutsjokiV，LanttoRandVehmaanpei'a,J.2004.Threecellulasesfrom'Melanoarpusalbomyceswithapplicationsinthetextileindustry.EnzMicrobiolTechnol.34:332-341.Pen比ila'M,HNevalainen,MRatt6,ESal.minen,andJKnowles.■1987.AversatiletransformationsystemforthecellulolyticfilatnentousfungusTrichodermareesei.Gene61:155-164.SaloheimoA,HenrissatB,HoffrenAM,TelemanO,PenttilaM.1994.Anovel,smallendoglucanasegene，eg/5,fromTrichodermareeseiiso-latedbyexpress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49.生物修整的方法，其包括向纺织材料类织物或衣服或纱中加入如权利要求1-27任一项所限定的纤维素酶融合蛋白或权利要求46所述的制剂的步骤。50.权利要求49的方法，其中所述纺织材料是由含有天然纤维素的纤维或含有人造纤维素的纤维制造而成的或是其混合物。51.权利要求49的方法，其中所述纺织材料是合成纤维和含有纤维素的纤维的掺合物。52.去污剂组合物，其含有如权利要求l-27任一项所限定的纤维素酶融合蛋白或权利要求46所述的酶制剂以及助剂，例如表面活化剂，表面活性剂，漂白剂或增效助剂。53.处理含有纤维素纤维的纺织材料的方法，其中所述方法包括将所述纺织材料与权利要求52所述的去污剂组合物接触。54.处理木源浆或纤维的方法，其包括向木源性的机械或化学衆或次级纤维中加入如权利要求1-27任一项所限定的纤维素酶融合蛋白或权利要求46所述制剂的步骤。55.改善动物饲料质量的方法，其包括用如权利要求l-27任一项所限定的纤维素酶融合蛋白或权利要求46所述的制剂处理植物性材全文摘要本发明提供了新的纤维素酶融合蛋白、纤维素酶融合蛋白制剂以及纤维素酶融合蛋白组合物。本发明还提供了纤维素酶表达载体，表达纤维素酶的宿主细胞以及制备这些载体和细胞的方法。本发明还提供了纤维素酶、纤维素酶制剂以及纤维素酶组合物在纺织品、去污剂、纸浆以及造纸业中的应用。文档编号C12N9/42GK101171333SQ200680014750公开日2008年4月30日申请日期2006年4月25日优先权日2005年4月29日发明者亚尔诺·卡利奥,亚里·韦赫曼佩雷,彭蒂·奥亚帕洛,泰尔希·普拉宁,玛丽亚·帕洛黑莫,玛丽卡·阿拉普拉内恩,莱纳·瓦尔塔卡里申请人:生化酶股份有限公司