一种基于微电极生物传感器的植株活体抗坏血酸检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测领域，具体涉及一种利用生物传感器检测抗坏血酸的方法。
【背景技术】
[0002] 抗坏血酸是一种普遍存在于植物组织的高丰度小分子抗氧化物质。它可以直接与 单线态氧、超氧自由基、过氧化氢和羟自由基等活性氧反应，因此在植物抵抗氧化胁迫中具 有重要作用。同时抗坏血酸也是一些关键性酶的反应底物，因而抗坏血酸在植物的生长发 育及植物对环境胁迫响应的过程中起着重要作用，有必要检测和监控植物组织中抗坏血酸 含量。
[0003] 目前抗坏血酸检测时常用经典的碘量法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、 火焰原子吸收光谱法、分光光度法等。例如荧光分光光度法将植株鲜样加偏磷酸-乙酸溶 液，打碎成匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释。取样品滤液加活性炭，再加入硼酸-乙酸钠溶液， 进行荧光光谱检测。
[0004] 虽然光谱、色谱、质谱检测方法准确度高，但对样品提取的纯度要求也较高，并且 以上方法需要对植物材料进行离体取样，对样品前处理要求较高，通过检测浸提液中物质 的浓度，所获取的结果是某一状态下的静态浓度，无法体现植物对环境变化的动态响应。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种基于微电极生物传 感器技术的植株活体抗坏血酸快速检测方法，以克服现有技术中样本前处理复杂、不可逆 破坏样本、只能静态检测的缺陷。
[0006] 实现本发明目的的技术方案为：
[0007] -种基于微电极生物传感器的植株活体抗坏血酸检测方法，包括步骤：
[0008] S1用微电极阵列构成微电极生物传感器，所述微电极阵列连接有信号采集模块和 电化学工作站；
[0009] S2用微电极生物传感器测试抗坏血酸标准溶液，获取抗坏血酸浓度与电流信号关 联的数学模型；
[0010] S3将微电极生物传感器插入待测的植株活体，获取植株活体对输入的电信号的响 应，根据步骤S2的数学模型求得待测植株活体样品中抗坏血酸浓度。
[0011] 其中，所述微电极阵列通过MEMS工艺设置在硅片基底上，硅片基底具有尖端部分， 所述尖端部分上设置有对电极、工作电极和参比电极，所述工作电极为L-半胱氨酸、纳米 金、壳聚糖修饰的金电极。
[0012] 其中，对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
[0013]优选地，硅片基底的长度为4~6cm，尖端部分长度为3~20mm;硅片基底的厚度为 0.5~2mm，娃片基底另一端上设置有连接元件。
[0014]硅片基底上设置微电极阵列的方法采用MEMS标准工艺，在硅基底上涂布光刻胶， 再根据制备的形状进行光蚀刻，将蚀刻掉部分电沉积金属，最后剥落蚀刻胶；
[0015] 针对不同部位沉积不同金属，通过电化学沉积将微电极阵列中分别修饰成镀铂对 电极、银/氯化银参比电极、镀金工作电极，获得包括对电极、工作电极和参比电极的微电极 阵列，对电极、工作电极和参比电极设置在尖端部分，并导电连接位于硅片基底另一端的连 接元件。
[0016] 进一步地，所述工作电极的制备方法为：
[0017] 1)配制10mm〇l/L L-半胱氨酸溶液，将它滴在金电极表面，在室温、湿度100%下修 饰15~20h (静置15~20h)，后用去离子水清洗干净，得到L-半胱氨酸修饰的金电极；
[0018] 2)将直径8~20nm纳米金溶胶滴涂在L-半胱氨酸修饰好的金电极上，在室温、湿度 100 %下修饰15~20h，后用去离子水清洗干净，得到纳米金修饰的金电极；
[0019] 3)将抗坏血酸氧化酶超声溶解在含50~80% (质量百分比）壳聚糖溶液中，得浓度 为0.1~2mol/L抗坏血酸氧化酶混合溶液，将该混合溶液滴涂在纳米金修饰好的金电极上， 在2~5°C、湿度100%下修饰20~30h，后用去离子水清洗干净，得到工作电极，储存在0°C~ 10 〇C 下。
[0020] 本发明生物传感器制备过程中，金电极进行修饰之前，先用金相砂纸打磨至光滑， 然后用去离子水超声清洗干净;将金电极置于0.5mol/L稀硫酸溶液中进行循环伏安扫描， 扫描范围为-0.2~1.6V，得到典型的循环伏安谱图，证明电极表面干净;否则再次打磨和清 洗。
[0021] 纳米金的制备可以为：向40mL的蒸馏水中加入质量分数为2%的HAuCl4溶液 0.5mL，混匀，边加热变搅拌至沸，再加入10mL，lOmmol · I/1的柠檬酸钠溶液，可见溶液颜色 由黄色变深蓝色直至酒红色，搅拌下继续加热l〇min，停止加热。
[0022] 其中，所述S2为:配制pH = 7~8、浓度为0mmol/L和1~10mmol/L的一系列葡萄糖-磷酸缓冲溶液，使用微电极生物传感器进行循环伏安检测，电压范围为-0.2~1.0V，扫描速 度为50~150mV/s，得到一组浓度与还原峰电流的关系曲线，制作微电极工作曲线。
[0023]进一步地，所述S2获取微电极工作曲线后，用已知浓度的抗坏血酸标准溶液进行 校正，用抗坏血酸标准溶液测得的工作曲线与微电极工作曲线偏差15%以内则说明微电极 可正常工作。
[0024] 其中，所述S3中，将微电极生物传感器插入待测的植株活体，进行循环伏安检测， 电压范围为-0.2~1.0V，扫描速度为50~150mV/s。
[0025] 本发明的有益效果在于：
[0026] 1、本发明提出基于微电极阵列的植株活体抗坏血酸检测技术，微电极阵列设置在 硅片基底上，整个生物传感器具有尖端，可以穿透植物组织(包括叶片、茎杆、果实等），基于 微电极阵列设置电流或电压扰动，直接获取植株活体的响应信号;植株被检测部位无需离 体、无破坏性损伤，只需清洁微电极裸露部分的表面、固定植株组织即可进行活体检测；
[0027] 本发明的检测设备便携，检测条件简单，可田间操作，并实现连续检测。
【附图说明】
[0028] 图1是微电极阵列结构图。
[0029] 图中，1为硅片基底，2为工作电极，3为参比电极，4为铂电极，5为连接元件。
[0030] 图2为工作电极修饰过程示意图。
[0031] 图3为实施例2进行的循环伏安扫描的结果。
【具体实施方式】
[0032]现以以下最佳实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0033]实施例中，如无特别说明，所采用的手段均为本领域公知的技术手段。
[0034] 实施例1:
[0035]如图1，微电极阵列通过蚀刻技术和电沉积技术在硅片基底1上制备而成，长5cm， 厚1.5mm，其中尖端部分长4mm，裸露部分上顺次设置工作电极2、参比电极3、对电极4,硅片 基底1向外方向为尖端，另一端较宽，其上设置连接元件5(-个电极连接一个相应的连接元 件）。其中Ag/AgCl为参比电极，铂为对电极，修饰金电极为工作电极。检测时用电化学工作 站连接本微电极阵列中的连接元件5,通过电化学工作站循环伏安法检测电流，再将电流数 据换算为浓度数据，由信号采集模块