2在Y2805菌株中的表达水平显著高于在BY4741菌株中的表 达水平，并且在GAL10启动子中的表达水平高于在ADH1启动子中的表达水平（图10)。
[0066] 实施例4 :表达0RF2的重组酉良酒酉孝母Saccharomyces cerevisiae菌株的发酉孝罐 培养
[0067] 对于在猪中使用环病毒疫苗进行的动物测试，将表达0RF2的重组酵母菌株培养 在发酵罐中。在上述实施例中观察到示出最高表达水平的PGAL10-0RF2/Y2805 Aga180菌 株（即，基因表达质粒和酵母宿主细胞的组合）在5L发酵罐中分批进料进行培养。下面的 表5示出了在分批进料培养中使用的培养基组成。
[0068]表 5
[0069]
[0070] 使用24%的氨水将分批进料的培养物调节至pH6. 0,将培养温度维持在30°C。细 胞逐渐生长，直至〇D_达到71 (图11)。在培养之后，收获细胞并且使用在1，000巴下的均 质器进行四次裂解，按照实施例1中描述的方法制备细胞裂解液。
[0071] 实施例5 :免痔原件的研究
[0072] 实施例5-1 :制备多f中形式的测试疫苗（句,括在酉良酒酉孝母Saccharomyces cerevisiae菌株中表汰的0RF2)和伸用豚鼠讲行免痔原件的研究
[0073] 为了评价在酿酒酵母Saccharomycescerevisiae菌株中表达的0RF2是否可用作 抗原，将0RF2注射到豚鼠体内以检验是否产生抗体。在此，根据存在或不存在细胞裂解液， 存在或不存在用于纯化的His标签，或存在或不存在NLS，进行对比评价。具体地，为了克服 酵母细胞壁难以破坏的不足，并且为了检验表达重组蛋白的酵母菌株的全细胞是否可在没 有进行细胞裂解的情况下立即使用，使用观察到表达0RF2的酵母菌株的全细胞来制备测 试疫苗，并且将制备的疫苗分成热灭活组和福尔马林灭活组。
[0074] 如实施例1中所述培养表达0RF2的Y2805Δga180菌株并且进行离心，并且基于 0D_值（10D= 2X107/ml)估计所获得的全酵母细胞的数量。使用全酵母细胞，根据细胞的 浓度制备测试疫苗，以2X109/ml的浓度进行接种。两种方法用于对全酵母细胞进行灭活。 对于热灭活，细胞在60°C下处理2小时，然后在-20°C储存直至使用。对于福尔马林灭活， 细胞使用〇. 2%的福尔马林在室温处理72小时，然后涂布在培养基上以证实酵母细胞不生 长。
[0075] 此外，为了从上述细胞获得细胞内表达的0RF2,以与在实施例1中所述相同的方 式裂解细胞，从而制备细胞裂解液。此外，还制备了以下四种测试疫苗：〇RF2细胞裂解液； 通过0.2微米的膜滤器过滤细胞裂解液以去除细胞碎片而获得的疫苗（0RF2(MF));通过从 0RF2的氨基末端去除47-氨基酸NLS序列而获得的疫苗（0RF2 (-NLS));和，通过在0RF2的 羧基末端添加His标签而获得的疫苗（0RF2(+His))。表6中示出关于测试疫苗的信息，包 括制备的包含佐剂的测试疫苗和疫苗组合物的类型和注射量。
[0076]表 6
[0077]
[0078] 使用市场上出售的PCV2疫苗CircoFLEX(BoehringerIngelheim)作为阳性对照， 检验抗原候选物的免疫原性。制备具有与阳性对照相同的组成的测试疫苗。将测试疫苗接 种到豚鼠体内，然后进行血液收集和血清分离。获得的血清进行ELISA，以对比免疫原性。
[0079] 使用豚鼠作为测试动物，每只豚鼠注射1ml六种测试疫苗中的一种。使用 CircoFLEX(BoehringerIngelheim)作为阳性对照，使用PBS作为阴性对照。对于注射，将 每一种疫苗皮下注射到由8只动物组成一组的动物体内。三周之后，收集来自这些动物的 血液，并且从血液中分离出血清并且在56°C灭活30分钟，然后进行ELISA。对于ELISA，使 用1μg/ml单克隆抗体（购自JBT)进行Ab检测三明治间接ELISA，并且作为PCV2 0RF2抗 原，购自BoehringerIngelheim的未稀释的抗原在进行20倍稀释之后使用。血清样品在 进行50倍稀释之后使用。使用PCV2特异性抗体的包被在37°C进行2小时，封闭在37°C进 行2小时。另外，使用PCV2抗原的包被在37°C进行1小时，检测反应在37°C进行1小时。 缀合反应在37°C进行1小时，底物在黑暗条件下在室温反应10分钟。在添加终止溶液之后 测量0·D450的值（表7)。
[0080]表7
[0081]
[0082] 表7中的T/C值（测试组的平均值/对照组的平均值）示于图12中。2.0或更高 的T/C值被判断为阳性。当对平均值进行对比时，测试疫苗1、2和3示出与阳性对照基本类 似的结果，这暗示它们作为重组疫苗抗原是阳性的；其中测试疫苗1和2包括酵母全细胞， 测试疫苗3是细胞裂解之后获得的包括细胞壁的细胞裂解液。这样的结果与之前的研究结 果一致，表明酵母全细胞组分起到佐剂的功能。当使用全细胞时，包括热灭活和福尔马林灭 活的预处理方法在免疫原性上没有差异。在其中通过膜滤器去除细胞碎片的MF的情况中， 略低的免疫原性似乎是因为注射量略低，而在包括带His标签的融合蛋白作为抗原的测试 疫苗的情况中，显现出由His标签带来的位阻会影响抗体的结合。同时，缺乏氨基末端NLS 的0RF2(-NLS)示出阴性值，这表明它不适于作为疫苗候选物，这与NLS对免疫原性不具有 显著影响的报道不同。
[0083] 实施例5_2 :使用在酉良酒酉孝母Saccharomyces cerevisiae菌株中表达的0RF2革P1 宙猪崽对免痔原件的研究
[0084] 制备三种包括PCV2 0RF2的测试疫苗，并且使用环病毒疫苗靶定的猪作为测试动 物来检验测试疫苗的免疫原性。如表8中所示，制备根据实施例5-1的方法制备的重组酵 母全细胞，细胞裂解液和经过膜过滤的（MF)作为测试疫苗，并且进行接种。
[0085]表8
[0086]
[0087] 在动物测试中，将每一种疫苗肌内注射2ml到每组的猪体内一次，每组都由三只 10~12周龄的猪组成，并且动物测试进行6周。作为阳性对照，肌内注射lmlCircoFLEX。 通过单封闭ELISA(合生元（Synbiotics))测量指示免疫原性的S/P值的变化，测量结果示 于下面的表9中。S/P值的平均值示于图13中。在酵母中表达的PCV0RF2被认为起到疫 苗的作用，因为它示出与CircoFLEX类似的变化。具体地，示出抗体滴度以进行MF处理的 测试疫苗、细胞裂解液和全细胞的顺序越来越高，并且在全细胞疫苗中最高。
[0088]表9
[0089]
[0090] 实施例6:酵母全细朐的剂量检验和无佐剂痔苗的可能件的检验
[0091] 在酵母的情况中，β-葡聚糖（细胞壁组分）可用作佐剂来激活免疫应答是已知 的。因此，在本发明中，检验了酵母全细胞是否可用作无佐剂疫苗。此外，检验了含Tyl的 0RF2(0RF2-Tyl)是否也可用作无佐剂疫苗，其中已知Tyl有助于病毒样颗粒的形成。
[0092] 具体地，将表达0RF2的酵母全细胞分成含佐剂的组和无佐剂的组，并且表达 0RF2-Tyl融合蛋白的酵母全细胞用作无佐剂疫苗，由此制备如下面的表10中示出的测试 疫苗。将每一种测试疫苗都注射到豚鼠体内，豚鼠的血清进行ELISA来评价每一种疫苗的 免疫原性。
[0093]表10
[0094]
[0095] 在无佐剂疫苗的情况中，检验了与传统剂量相比，在降低剂量时是否会维持疫苗 的免疫原性。在上述动物测试中测量的酵母全细胞的量是2X109/ml，酵母全细胞被分别稀 释10倍和100倍至2X 10%1和2Xl〇7ml，然后进行测试。在无佐剂的组的情况中，酵母 全细胞以2X 109/ml的浓度进行测试。酵母全细胞通过使用0. 2%福尔马林处理1周来进 行灭活。作为佐剂，使用20%浓度的氢氧化铝凝胶。
[0096] 在动物测试中，每只豚鼠注射1ml五种测试疫苗中的一种。使用 CircoFLEX(Boehringer Ingelheim)作为阳性对照，并且使用未注射的组作为阴性对照。总 共测试了 7组，每一组都由10只动物组成。通过肌内注射，将每一种疫苗注射到每一组动物 的体内，并且在第3周收集来自5只动物的血液，在第5周收集来自剩余5只动物的血液。 从收集的血液中分离出血清，在56°C灭活30分钟，然后进行ELISA。ELISA通过Ab检测三 明治间接ELISA来进行，测试结果示于下面的表11、表12以及图14中。
[0097]表11
[0098]
[0099] *当T/C值为2. 0或更高时，判断为阳性