蛋白。
[0049] 实施例1_2 :纤维素结合结构域和0RF2的融合表达以及分析
[0050] 当纤维素结合结构域（CBD)表达为与不同蛋白的融合蛋白时，可在细胞中形成不 溶的颗粒是已知的。因此，在具有与病毒样颗粒类似的功能的预期下，尝试了CBD和0RF2的 融合表达。在下面两种情况中，尝试了与CBD的融合表达：其中α-淀粉酶信号序列用于细 胞外分泌（SS-CBD)的情况；和，其中没有使用α-淀粉酶信号序列的情况。在此，0RF2基 因不含有核定位信号（NLS)。扩增CBD和0RF2中的每一个，然后通过重叠PCR连接扩增产 物，并且将其插入到YEGa-HIR525的EcoRI和Sail位点中。所使用的引物示于下面的表3 中，并且按照上述方法将构建的质粒（图4)转化到Y2805中。
[0051]表 3
[0052]
[0053] 将包含GAL10启动子的质粒接种在YP(1%Glu和1%Gal)培养基中，并且将包括 ADH1启动子的质粒接种在YP(2%Glu)培养基中，然后在30°C培养48小时。在包括信号序 列的Y2805的情况中，通过蛋白印迹分析来分析无细胞提取物和上清液。所使用的抗体是 抗His标签的抗体。在存在信号序列的情况中，可以看到在细胞内和细胞外都没有观察到 表达，这暗示基因仅在细胞内表达（图5)。在不存在信号序列的情况中，同时观察到GAL10 启动子的表达和ADH1启动子的表达，但示出GAL10启动子更适于在酵母中表达。
[0054] 实施例1-3 :观察通过在酉良酒酉孝母Saccharomycescerevisiae菌株中表达的0RF2 形成病毒样颗粒
[0055] 在以各种方式制备的0RF2表达盒中，基于蛋白印迹选择出三株示出有效表 达0RF2的酵母菌株。此外，根据实施例1-1的方法制备仅表达0RF2的无His标签 的PGAL10-0RF2质粒，从而制备了 下面四种质粒：pGAL10-0RF2、pGAL10-0RF2-His、 pGAL10-Tyl-0RF2(-NLS)和pGAL-CBD-0RF2(-NLS)-His。将具有每一种质粒的Y2805 都以 30°C和180rpm的条件在YPDG中培养48小时。每一种培养物都在13,OOOrpm离心10分钟 来收集细胞。向细胞中添加TEN缓冲液（10mMTris-HClpH7. 4、2mMEDTA、140mMNaCl) 和珠子，然后涡旋约10分钟以裂解细胞。细胞裂解液在13, 000和4°C下离心20分钟以收 集上清液，然后收集的上清液进行超速离心。通过超速离心，制得在TEN缓冲液中的15%、 25 %、35 %、45 %和60 %的蔗糖溶液，并且顺序地倒在离心管中以形成蔗糖梯度。将如上所 述制备的无细胞提取物添加到离心管的顶部并且在36,OOOrpm离心4小时。梯度从管的底 部开始分成1. 5-ml的等分，然后进行蛋白印迹分析。通过蛋白印迹，收集仅示出0RF2条带 的组分，使用超滤离心管（Amiconultracentrifugalfilter，Millipore，10K膜）从该组 分中去除蔗糖，之后浓缩该组分并且使用电子显微镜进行观察。在仅表达0RF2的情况中， 观察到形成了具有约25nm大小的病毒样颗粒（图6)。但是，在存在His标签的情况中，没 有形成病毒样颗粒，表明与C-末端结合的His标签会干扰病毒样颗粒的形成。此外，示出 预期辅助病毒样颗粒形成的Tyl略微干扰病毒样颗粒的形成。在0RF2表达为与CBD的融 合蛋白的情况中，观察到尽管存在His标签，但很好地形成了病毒样颗粒。
[0056] 实施例2 :0RF2的分泌表汰和分析
[0057] 重组亚单位疫苗的优点在于，如果其细胞外的分泌表达可能的话，则省略了对细 胞裂解的需求并且容易纯化。通常来讲，除了几种其它优点（诸如安全性）之外，与大肠杆 菌不同，酵母因为形成了其蛋白分泌机制而适于进行分泌表达。因此，尝试在酵母中进行 0RF2的分泌表达。
[0058] 当在大肠杆菌中表达全长基因时，其表达水平非常低。但是，报道了：基于位于 氨基末端的NLS区域的47-氨基酸序列对于构象表位的形成并不是必需的这一事实，表 达无NLS的克隆来增加其表达水平。对于0RF2的分泌，使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisia^的交配因子a(matingfactoralpha，MFa)的信号序列。构建了表达0RF2的 全长序列和0RF2的无NLS的序列的载体。所使用的引物示于下面的表4中。使用针对酵 母密码子进行最优化的合成序列作为模板，通过PCR扩增基因。使用Xbal和Sail消化扩 增产物，并且插入到YEGa-HIR525的Xbal和Sail位点中。构建的载体的示意图示于图7 中。使用锂/醋酸盐方法，将每一种载体转化到酿酒酵母SaccharomycescerevisiafY2805 中。将酵母细胞培养在UD(6. 7g/L酵母氮源、0. 77g/L缺尿嘧啶补充物和20g/L葡萄糖） 上，然后通过PCR对转化株进行筛选。
[0059]表 4
[0060]
[0061] 将细胞在UD液体培养基中进行预培养，然后在YP(1%Glu和1% Gal)培养基中 培养48小时并且使用抗His抗体进行蛋白印迹分析。在存在MFa分泌信号的情况中，不 管是否存在NLS(图8)，0RF2都既不被分泌到培养基中也不在细胞中表达。此外，在不存在 NLS的情况中，显著增加了 0RF2的表达水平。
[0062] 实施例3 :选择用于在酉良酒酉孝母Saccharomyces cerevisiae菌株中表达0RF2的 菌株
[0063] 使用在实施例1-1中观察到示出高表达水平的GAL10启动子，将0RF2引入到经常 用于重组表达的多种酿酒酵母Saccharomycescerevisia^iSf株中，并且对比菌株之间的 0RF2的表达水平。作为表达载体，使用实施例1-3中构建的pGAL10-0RF2。用于与酿酒酵母 Saccharomycescerevisia互Y2805进行对比的菌株是INVScl、ATCC200589、BY4741、L3262、 ATCC201228和ATCC201741。以与上面所述相同的方式进行转化和培养过程，并且通过蛋 白印迹分析对同量的样品进行分析。分析结果示于图9中。使用光密度1D程序（UVIBand Max)比较分析0RF2的表达水平。0RF2没有在ATCC200589菌株中表达，而且在ATCC201228 中的表达也不显著。此外，当0RF2在Y2805菌株中的表达水平被看作100时，0RF2在剩余 菌株中的表达水平在INVScl中为19. 7%，在BY4741中为15. 0%，在L3262中为40. 0%， 且在ATCC201741中为20. 4%。如上所述，可以看到0RF2的表达水平在菌株之间是显著不 同的，并且在Y2805菌株中最高。
[0064] 在上述实施例中观察到高表达水平的GAL10启动子的情况中，为了半乳糖 诱导的启动子的优化表达，应当满足培养基中不存在葡萄糖但存在半乳糖。但是， 与葡萄糖相比，半乳糖是非常昂贵的碳源。本发明人之前开发了甚至当仅使用葡 萄糖而不添加昂贵的半乳糖时，也能使用缺乏gal 80的酿酒酵母Saccharomyces cerevisia互菌株经济地生产重组蛋白的方法（韩国专利号10-0947376 (2010年3 月5日），题目为"一种使用缺乏GAL80的酵母菌株生产重组蛋白的方法（ GAL80 平暑叫普fi刈王钍珪吗省纠吻灶喷嗜）"）。
[0065] 为了检验0RF2在缺乏gal80的菌株中的表达模式，使用锂/醋酸盐方法将在 实施例1-3中构建的PGAL10-0RF2转化到以下菌株中：如上所述示出最高表达水平的酿 酒酵母Saccharomycescerevisia^YSSOSAgal80,不出低表达水平的BY4741，和BY4741 Δgal80。将菌株培养在UD(6. 7g/L酵母氮源、0. 77g/L缺尿嘧啶补充物和20g/L葡萄糖） 平板上，然后通过PCR对转化株进行筛选。在酵母的情况中，将单个酵母菌落接种在2ml的 UD液体培养基中，在30°C和180rpm下进行预培养，然后进行主培养。对于主培养，在Y2805 和BY4741的情况中，将25mlYP(l%Glul和l%Gal)培养基（2%蛋白胨、1%酵母提取物、 1%葡萄糖和1%半乳糖）添加到250ml折流瓶中，在Y2805Aga180和BY4741Aga180的 情况中，将25mlYP(2%Glu)添加到250ml折流瓶中，然后将每一种初始培养的菌株接种到 培养基中直至〇D6。。达到0. 1。接种的菌株在30°C和180rpm下震荡培养48小时。培养的 菌株以与上述相同的方式进行蛋白印迹分析，分析结果示于图10中。可以观察到，0RF2在 四种菌株中都表达，但是0RF