本发明中使用的"酵母"是已知在人体中安全使用的GRAS(被普遍认为是安全的） 菌株。当使用酵母表达系统生产疫苗时，消除了使用血清培养基的需要，可使用微生物发酵 罐代替昂贵的动物细胞培养系统，并且酵母细胞中的蛋白表达水平高于动物细胞中的蛋白 表达水平。当使用酵母而不是动物细胞来生产疫苗时，具有如下优点：由于细胞生长率和蛋 白表达水平的增加，可提高生产率；因为不使用昂贵的培养基和动物细胞培养系统，而降低 生产成本；另外，因为不使用血清培养基，因此增加了疫苗的安全性和稳定性。酵母全细胞 尤其可诱导额外的免疫应答，并且酵母细胞壁还可用作佐剂来促进免疫应答的诱导。
[0022] 有益效果
[0023] 根据本发明的酵母全细胞可有效用作疫苗组合物，可享有酵母的各种优点，使得 可显著简化疫苗生产过程（包括细胞裂解，或抗原提取、纯化和稳定等），这在使用重组微 生物来生产猪圆环病毒疫苗的过程中是必需的。
【附图说明】
[0024] 图1示出根据本发明的包括ADH1启动子或GAL10启动子的表达0RF2的重组载体。
[0025] 图2示出表达Tyl和0RF2的融合蛋白的重组载体。
[0026] 图3示出蛋白印迹（Westernblot)分析的结果，进行该蛋白印迹分析以检验图1 和图2中的0RF2表达载体在酵母宿主Y2805中的表达。
[0027] 图4示出通过将结合纤维素的结构域（CBD)融合至上述载体上所获得的表达载 体。
[0028] 图5示出通过表达图4的载体，然后进行蛋白印迹分析所获得的结果。
[0029] 图6示出通过表达图1和图2的载体以及无His标签的0RF2,然后进行超速离心 所获得的部分进行电泳和蛋白印迹分析的结果，以及电子显微镜观察的结果，其中进行电 子显微镜观察以检验是否形成病毒样颗粒（VLP)。
[0030] 图7不出通过将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae MF α与0RF2或无NLS的 0RF2融合所获得的载体。
[0031] 图8示出了通过表达图7的载体，然后进行蛋白印迹分析所获得的结果。
[0032] 图9示出蛋白印迹分析的结果，进行该蛋白印迹分析以分析0RF2的表达水平在各 种宿主细胞之间的差异。
[0033] 图10示出通过使用Υ2805、ΒΥ4741、缺乏gal80的Υ2805和缺乏gal80的ΒΥ4741 作为宿主细胞，以及GAL10启动子和ADH1启动子来表达0RF2,然后进行蛋白印迹分析所获 得的结果。
[0034] 图11示出使用表5中示出的培养基生长细胞的结果。
[0035] 图12示出使用表6中示出的测试疫苗所获得的T/C值（测试组平均值/对照组 平均值）。
[0036] 图13是示出使用表8中示出的测试疫苗所获得的结果的曲线图。
[0037] 图14是示出使用图10中示出的测试疫苗所获得的结果的柱状图。
【具体实施方式】
[0038] 下面，将参照非限制性实施例进一步详细地描述本发明。本领域技术人员清楚地 是，这些实施例仅用于例示的目的，而并不意于限制本发明的范围。
[0039] 实施例1 :通过在酉良酒酉孝母Saccharomyces cerevisiae菌株中表达PCV2 0RF2来 制备病毒样颗粒
[0040] 1-1 :构建用于在酉良酒酉孝母Saccharomyces cerevisiae菌株中表达PCV2 0RF2的 载体，及对表汰的分析
[0041]通过Bioneer合成对于酵母密码子最优化的0RF2序列（SEQIDNO: 1)，以在酵 母Saccharomycescerevisiae菌株中进行有效表达。将合成的基因克隆到酵母表达载 体YEGa-HIR525中。使用两种启动子（GAL10和ADH1)，并且将6-组氨酸标签添加到C 末端来确定0RF2的表达。对于GAL10启动子，构建在5'和3'末端区域中具有EcoRI和 Sail限制酶识别位点的引物（表1)，并且将该引物插入到使用相同限制酶消化的表达载体 YEGa-HIR525中。得到的载体经Smal和EcoRI消化，以去除GAL10启动子，并且将ADH1启 动子插入到该位置。所使用的引物示于下面的表1中。使用锂/醋酸盐方法，将得到的重 组表达载体（图1)转化到酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeY2805中，并且将酵母细 胞培养在UD(6. 7g/L酵母氮源、0. 77g/L缺尿嘧啶补充物和20g/L葡萄糖）平板上。然后， 通过PCR对转化株进行筛选。
[0042]表1
[0043]
[0044] 不仅在用于证实表达的His标签的情况中，而且在重组的病毒亚单位疫苗的情 况中，病毒样颗粒的形成增加抗原性是已知的。在酵母的情况中，已经开发了在酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae菌株中利用Tyl(很久以前就已知的逆转录转座子元件）的技 术。Tyl的特征在于，它在遗传、结构和功能上与逆转录病毒的核苷/核相似。1987年报道 了Tyl在疫苗开发中的应用。此外，已知当疫苗候选基因与Tyl基因的3'区域融合并且进 行表达时，具有病毒样颗粒的形成不受阻碍，以及病毒样颗粒可在细胞中形成且不需要存 在其它因子的优点。因此，预期Tyl会通过0RF2辅助病毒样颗粒的形成。在这样的预期下， 融合并且表达Tyl(SEQIDN0:3和SEQIDN0:4)和0RF2。本文中，融合在从0RF2中去除 核定位信号（NLS)序列之后进行。来自Y2805和无NLS的0RF2的每一个Tyl通过PCR进 行扩增，然后两个PCR片段通过重叠PCR连接起来。在PCR中使用的引物示于下面的表2 中，并且被插入到YEGa-HIR525的EcoRI和SalI位点中。
[0045]表2
[0046]
[0047] 此外，使用锂/醋酸盐的方法将重组表达载体（图2)转化到酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae Y2805中，酵母细胞培养在UD(6. 7g/L酵母氣源、0. 77g/L缺尿 嘧啶补充物和20g/L葡萄糖）平板上。然后，通过PCR对转化株进行筛选。
[0048] 为了检验0RF2是否在Y2805中有效地表达，在培养之后进行蛋白印迹分析。将大 肠杆菌（E.coli)接种在LB培养基（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物和1%氯化钠）中并且 在37°C培养16小时。同时，将单个酵母菌落接种在2ml的UD液体培养基中，并且在30°C、 180rpm进行预培养，然后进行主要培养。对于主要培养，将25ml的YP(1%Glu和1%Gall) 培养基（2%蛋白胨、1%酵母提取物、1%葡萄糖和1%半乳糖）等分至250ml折流瓶，然后 将预培养的菌株接种在培养基中至〇D_达到0. 1，之后菌株在30°C和180rpm下摇动培养 48小时。培养物在13,OOOrpm离心3分钟以去除上清液，并且以对应于培养物的1/4的量 向培养物中添加50mMTris-HCl缓冲液（pH7.0)以溶解细胞，之后向其中添加相同体积的 珠子（425~600μm)，通过涡旋5分钟来裂解细胞。细胞裂解之后，在13,OOOrpm离心3分 钟以去除未裂解的细胞和细胞碎片，将SDS-PAGE上样染料添加到上清液中，然后在100°C 加热5分钟。得到的材料在冰上放置一段时间，然后加载到4~20 %梯度凝胶上，在80V下 进行电泳。使用Trans-Blot?Turbo(Bio-Rad)将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，该膜使用在 TBS-T缓冲液（(20mMTris-HClpH8.0、137mMNaCl、0.l%Tween20)中的 5%脱脂乳封闭 1小时。膜与初级抗体孵育约1~2小时，使用TBS-T缓冲液冲洗三次，每次5~10分钟， 然后膜与二级抗体孵育1小时。添加缀合至二级抗体的AP(碱性磷酸酶）的BCIP/NBT紫色 液体底物（Sigma)，并且与膜孵育约5~10分钟。结果，观察到抗体结合区域显示为紫色条 带。因为His标签用于证实表达，抗His标签的兔多克隆IgG(SantaCruzBiotechnology) 用作初级抗体，山羊抗兔的IgG碱性磷酸酶（Sigma)用作二级抗体。此外，经PCV2免疫的豚 鼠血清用作初级抗体以检验是否检测到0RF2。在这种情况中，山羊抗豚鼠的IgG-AP(Santa CruzBiotechnology)用作二级抗体。蛋白印迹分析的结果示于图3中。在大肠杆菌菌株 中，示出0RF2在使用GAL10启动子的情况中弱表达，但是在使用ADH1启动子的情况中不表 达。但是，在Y2805中，可观察到0RF2在两种情况中都表达，并且0RF2在GAL10启动子的 情况中的表达水平高于在ADH1启动子的情况中的表达水平。此外，示出当0RF2表达为与 Tyl的融合蛋白时，表达显著大量的