和皮下注射， 由此进行初次免疫。第二次以后的免疫通过将同样制备的相当于25 y g蛋白质的量的可溶 型⑶H3蛋白质与Titer-MAX Gold混合，在腹腔内和皮下注射而实施。在距最终免疫3日 后，以无菌的方式由小鼠制备脾脏细胞，按照常规方法，利用聚乙二醇法进行小鼠骨髓瘤细 胞 SP2/0-Agl4 或 P3-X63-Ag8. 653 的细胞融合。
[0200] (2)抗⑶H3小鼠抗体产生杂交瘤的筛选
[0201 ] 抗⑶H3小鼠抗体的筛选利用使用了表达全长⑶H3的CH0细胞株（EXZ1501)的流 式细胞术进行。即，用2mM EDTA-PBS对表达全长CDH3的CH0细胞株（EXZ1501)进行处理， 从培养板剥离后，以1 X 106个/mL的量悬浮于FACS溶液（加入1 % BSA、2mM EDTA、0. 1 % 似队的PBS)中。将该细胞悬浮液以50 y L/孔的量接种到96孔板中，加入杂交瘤培养上清， 以4°C反应60分钟，用FACS溶液（200 y L/孔）清洗2次，之后，加入AlexaFluor488标记 抗小鼠IgG ?山羊F(ab'）2(InVitr〇gen公司），以4°C使其反应30分钟。之后，用FACS溶 液清洗2次后，实施流式细胞术，筛选确认与CDH3表达CH0细胞反应的杂交瘤。
[0202] 将由该杂交瘤得到的抗体、与⑶H3表达CH0细胞（EXZ1501)、作为亲株的CH0细 胞和确认了 CDH3高表达的人细支气管肺泡癌细胞株NCI-H358的典型的反应结果示于图 2A-C。确认了筛选得到的杂交瘤全部与⑶H3表达CH0细胞（EXZ1501)和NCI-H358反应， 而不与CH0细胞反应。图2D表示由来自保藏号NITE BP-1536的杂交瘤精制得到的小鼠抗 体（抗体编号：PPAT-076-44M)的流式细胞术结果。
[0203] 实施例4 :正常组织和癌组织中的⑶H3mRNA的表达
[0204] 利用激光捕获显微切割法（Laser Capture Microdissection)由正常人组织 和各种癌组织回收样品，由该样品使用ISOGEN(Nipp〇ngen e公司）按照常规方法制备总 RNA。将 RNA 各 10ng 使用 GeneChipU_133B (Affymetrix 公司）、基于 Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix公司）分析基因表达。将总基因的表达得分的平均值设为 100,研究在癌细胞中表达的基因，结果，⑶H3在正常人组织中表达有限，而在肺癌、大肠癌、 胰腺癌中高表达（图3A、B)。另外，研究了分化度不同的胰腺癌组织中的CDH3mRNA的表达， 结果确认到表达高的组织而与分化度无关（图3C)。
[0205] 实施例5 :利用免疫组织化学染色检测癌组织中的⑶H3蛋白质的表达
[0206] 为了确认癌临床样本中的⑶H3蛋白质的表达，利用癌样本组织芯片进行免疫染 色。癌细胞组织芯片使用上海芯超生物科技有限公司（Shanghai Outdo Biotech Co.， Ltd.)制的胰腺癌（腺癌）、肺癌（腺癌）、肺癌（鳞状细胞癌）和大肠癌（腺癌）。
[0207] 对各组织芯片玻片进行脱石蜡处理，利用10mMTris、lmM EDTA(pH9. 0)进行95°C、 40分钟活化。利用ENVISI0N+Kit(Dako公司）附带的封闭试剂进行内源性过氧化物酶的灭 活，之后，使其与抗CDH3抗体610227 (BD BI0SCIENCE公司）和作为阴性对照的抗HBs抗体 Hyb-3423以5 y g/mL的浓度在4°C反应过夜。对抗体溶液进行冲洗后，使其与ENVISION+Kit 附带的聚合物二次抗体试剂在室温反应30分钟。利用ENVISION+Kit附带的显色试剂进行 显色，苏木精伊红溶液进行核染色。
[0208] 在图4中表示结果。癌细胞被抗⑶H3抗体染色，正常细胞未被染色。
[0209] 实施例6 :由杂交瘤精制RNA
[0210] 按照 Gough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, 173, p93 - 95(1988)(非专利文献 10)记载的方法（其中，代替该论文中记载的溶解缓冲液，使用另外的TNE缓冲液25mM Tris-HCl，pH7. 5 ;1%NP_40 ;150mM NaCl ;lmM EDTA，pH8. 0,从产生CDH3抗体的小鼠杂交瘤 细胞分离存在于细胞质的RNA。作为具体的操作方法，将5 X 106个杂交瘤细胞悬浮于0. 2mL 的TNE缓冲液中将细胞膜溶解后，通过离心除去细胞核。在得到的约0. 2mL细胞质上清中 加入 0? 2mL 的提取缓冲液（10mM Tris-HCl，pH7. 5 ;0? 35M NaCl ;1% (w/v)SDS ;10mM EDTA， pH8. 0 ;7M尿素）。将该混合物用苯酚和氯仿提取，在得到的RNA溶液中加入作为载体的糖 元（罗氏，Cat No. 901393)后，利用乙醇使其沉淀。接着加入10~50 y L的灭菌蒸馏水将 RNA沉淀物溶解，使细胞质RNA浓度为0. 5~2 y g/ y L。
[0211] 实施例7:从由杂交瘤制备的RNA制作cDNA文库
[0212] 为了合成单链cDNA，将如上所述制备的细胞质RNA的0. 5~3yg制备成含有50mM 作18-11(：14118.3(室温）；7511111((：1;311111%(：1 2;1〇111101'1'、10〇1^的随机引物、0.51111(1犯1\ 200单位的Superscript〗]；(逆转录酶，Invitrogen公司）的20 y L反应混合液，以42°C孵 育50分钟。将这样合成的cDNA文库直接作为聚合酶链式反应（PCR)法的模板使用。
[0213] 实施例8:利用PCR法扩增编码抗⑶H3小鼠抗体可变区的基因
[0214] 为了确定抗CDH3小鼠抗体可变区的序列，将实施例7中得到的cDNA文库作为 模板，利用PCR法实施抗CDH3小鼠抗体可变区的基因扩增。引物全部委托北海道System Science株式会社合成，按照以下所述的组合实施。
[0215] A.小鼠轻链可变区编码基因的PCR引物
[0216] 使用在5'末端与FR1部分具有同源性的PCR引物和在3'末端与小鼠轻链内的J 链基因具有同源性的4组引物（1)、或者在5'末端与轻链信号部分（7组引物）和在3'末 端与KC部分（KVL反义引物）具有同源性的引物组（2)这两种引物组，通过聚合酶链式反 应，从该cDNA分离小鼠免疫球蛋白轻链可变区DNA。引物序列如下。
[0217] 其中，在碱基序列中，M表示A或C，R表示A或G，W表示A或T，S表示C或G，Y 表示C或T，K表示G或T，V表示A、C或G，H表示A、C或T，D表示A、G或T，B表示C、G或 1'，~表示八、(：、6或1'。
[0218] (1)小鼠轻链可变区克隆4组正义引物
[0219]参考 "Phage Display-A Laboratory Manual-，Barbas Burton Scott Silverman"PR0T0C0L 9. 5(非专利文献 11)，合成 Sense Primer 17 种、Reverse Primer 3 种。
[0220] VK正义引物（FR1部分，下述17个引物的混合物）
[0221] 5' -GAYATCCAGCTGACTCAGCC-3'（简并度 2):序列号 5
[0222] 5' -GAYATTGITCTCWCCCAGTC-3'（简并度 4):序列号 6
[0223] 5' -GAYAITGTGMTMACTCAGTC-3'（简并度 8):序列号 7
[0224] 5' -GAYAITGTGYTRACACAGTC-3'（简并度 8):序列号 8
[0225] 5' -GAYAITGTRATGACMCAGTC-3'（简并度 8):序列号 9
[0226] 5' -GAYATTMAGATRAMCCAGTC-3'（简并度 16):序列号 10
[0227] 5' -GAYAITCAGATGAYDCAGTC-3'（简并度 12):序列号 11
[0228] 5' -GAYATYCAGATGACACAGAC-3'（简并度 4):序列号 12
[0229] 5' -GAYATTGITCTCAWCCAGTC-3'（简并度 4):序列号 13
[0230] 5' -GAYAITGWGCTSACCCAATC-3'（简并度 8):序列号 14
[0231] 5' -GAYAITSTRATGACCCARTC-3'（简并度 16):序列号 15
[0232] 5' -GAYRITKTGATGACCCARAC-3'（简并度 16):序列号 16
[0233] 5' -GAYAITGTGATGACBCAGKC-3'（简并度 12):序列号 17
[0234] 5' -GAYAITGTGATAACYCAGGA-3'（简并度 4):序列号 18
[0235] 5' -GAYAITGTGATGACCCAGWT-3'（简并度 4):序列号 19
[0236] 5' -GAYAITGTGATGACACAACC-3'（简并度 2):序列号 20
[0237] 5' -GAYATITTGCTGACTCAGTC-3'（简并度 2):序列号 21
[0238] J反义（4组引物）
[0239] J1/J2 反义引物（1)
[0240] 5' -GGSACCAARCTGGAAATMAAA-3'（简并度：8):序列号 22
[0241] J4反义引物（2)
[0242] 5'-GGGACAAAGITGGAAATAAAA-3'：序列号 23
[0243] J5反义引物（3)
[0244] 5'-GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA-3'：序列号 24
[0245] J1/J2, J4, J5反义引物混合物（4)
[0246] ⑵小鼠轻链可变区克隆7组引物
[0247] VK正义引物（信号肽部分，以Novagen公司的小鼠Ig-引物组（Novagen ;Merck， Cat. No. 69831-3)为基础，以除去限制酶部位的方式改变碱基序列）
[0248] A组正义引物
[0249] 5,-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3，：序列号 25
[0250] B组正义引物
[0251] 5'-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3'：序列号 26
[0252] C组正义引物
[0253] 5'-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3' ：序列号 27
[0254] D组正义引物（下述2个引物的混合物）
[0255] 5'-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYITGGIWTCTT-3' ：序列号 28
[0256] 5'-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3' ：序列号 29
[0257] E组正义引物（下述3个引物的混合物）
[0258] 5'-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGIT-3' ：序列号 30
[0259] 5'-ATGTGGGGAYCGKITTYAMMCnTTCAAITG-3' ：序列号 31
[0260] 5,-ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC-3，：序列号 32
[0261] F组正义引物（下述4个引物的混合物）
[0262] 5'-ATGAGIMMKTCIMITCAITTCYTGGG-3' ：序列号 33
[0263] 5,-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3，：序列号 34
[0264] 5'-ATGGTRTCCWCASCTCAGITCCTTG-3' ：序列号 35
[0265] 5'-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3' ：序列号 36
[0266] G组正义引物（下述4个引物的混合物）
[0267] 5'-ATGAAGITGCCTGTTAGGCTGITGGTGCT-3' ：序列号 37
[0268] 5,-ATGGAITTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3，：序列号 38
[0269] 5,-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3，：序列号 39
[0270] 5,-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3，：序列号 40
[0271] KVL反义引物
[0272] 5'-ACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3' ：序列号 41
[0273] B.小鼠重链可变区编码基因的PCR引物
[0274] 使用在5'末端与小鼠重链信号部分（4组引物）具有同源性的引物和在3'末端 与KC部分具有同源性的引物、或者在5'末端与FR1部分具有同源性的1组引物和在3'末 端与小鼠重链的恒定区（IGHC)具有同源性的2种引物组，通过聚合酶链式反应，从该cDNA 分离小鼠免疫球蛋白重链可变区DNA。引物序列如下。
[0275] ⑶小鼠重链可变区克隆引物
[0276]VH正义引物（信号部分：4组引物，参考CurrentProtocolsinImmunology(John WileyandSons,Inc.),Unit2. 12 Cloning,ExpressionandModificationofAntibody V Regions的表 2. 12. 2)。
[0277] 5' -ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3'（简并度：32):序列号 42
[0278] 5' -ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGITIT-3'（简并度：8):序列号 43
[0279] 5'-ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3' ：序列号44
[0280] 5' -ATGGRCAGRCTTACWTYY-3'（简并度：32):序列号 45
[0281] (4)小鼠重链可变区克隆引物
[0282] VH 正义引物（FR1 部分，改变 Tan 等，Journa of Immunology ;169，plll9 (2002) (非专利文献14)的正义引物的碱基序列而设计）。
[0283] 5' -SAGGTSMARCTKSAGSAGTCWGG-3'（简并度：256):序列号 46
[0284] VH反义引物（⑶、⑷通用的反义引物，以能够与小鼠IgG所有的亚型退火的方 式简并碱基序列而设计）。
[0285] 5' -CASCCCCATCDGTCTATCC-3'（简并度：6):序列号 47
[0286] 实施例9 :确定抗CDH3小鼠抗体的可变区的序列
[0287] 利用使用DNA Engine (Bio-Rad公司）的PCR法，使用实施例8所示的引物， 扩增抗CDH3小鼠抗体轻链、重链各自的可变区。扩增后的DNA片段重组入亚克隆载体 pGEM(Pr 〇mega公司）中，利用该载体的T7、SP6通用引物确定碱基序列。
[0288] 由此确定序列的来自保藏号NITE BP-1536的小鼠杂交瘤的抗⑶H3小鼠抗体（抗 体编号：PPAT-076-44M)的可变区中，相当于⑶R的氨基酸序列如下所示。
[0289] SLTSYGVH :序列号 56 (CDR-H1)
[0290] GVIWSGGSTD :序列号 57 (CDR-H2)
[0291] ARNSNNGFAY :序列号 58 (CDR-H3)
[0292] NIYSNLA:序列号 59(CDR-L1)
[0293] LLVYAAKN :序列号 60 (CDR-L2)
[0294] QHFYDTPWT :序列号 61 (CDR-L3)
[0295] 其中，⑶R-H1、H2和H3分别表示构成各抗体重链的⑶R序列，⑶R-L1、L2和L3分 别表示构成各抗体轻链的CDR序列。
[0296] 两抗体的轻链和重链可变区的碱基序列利用IMGT/V_QUEST(http://www.imgt. org/IMGT_vquest/vquest? livret=0&0ption= mouselg)进行检索，明确地确认了抗体 基因能够克隆。
[0297] 实施例10 :抗CDH3抗体的瞬时表达载体的制作
[0298] 关于编码被克隆的抗CDH3小鼠抗体的轻链和重链的V区的基因，设计在嵌合轻链 表达载体上连接有编码人Ck区的基因、在嵌合重链表达载体上连接有编码人Cgl区的基因 的基因，由GenScript公司对这些轻链、重链嵌合抗体基因进行全长人工合成。在两端添加 限制酶部位（5'侧为Nhel，3'侧为EcoRI)。
[0299] 由此，为了供于嵌合化抗体表达载体，合成来自具有保藏号NITE BP-1536的细 胞的抗⑶H3嵌合化抗体（以下，记为抗体编号PPAT-076-44C。重链和轻链可变区序列与 PPAT-076-44M 相同）。
[0300] 具有保藏号NITE BP-1536的细胞，