具有磷脂酶a活性的多肽与对其进行编码的多核苷酸的制作方法

具有磷脂酶a活性的多肽与对其进行编码的多核苷酸的制作方法【专利说明】具有磷脂酶A活性的多肽与对其进行编码的多核苷酸[0001]对序列表的引用[0002]本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。[0003]发明背景发明领域[0004]本发明涉及具有磷脂酶A活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。[0005]相关技术说明[0006]已从大量的有机体中分离出了磷脂酶，例如动物、植物、细菌、真菌。[0007]来自黑曲霉的脂肪酶（UNIPROT:B8HE6)具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列与本发明的磷脂酶具有70%的一致性。[0008]具有A1活性的磷脂酶已经由诺维信A/S公司以LECITASEULTRA向公众开放（扬_(Yang)等人,食品技术和牛物技术（FoodTechnol.Biotechnol.),44(1)101-104(2006))〇[0009]本领域已知磷脂酶的数个用途，例如将磷脂酶用于，例如植物油的酶法脱胶（杨(Yang)等人，见上文；US5,264,367，Metallgesellschaft，R6hm);淀粉水解产物的处理(特别是来自小麦淀粉）以改善滤过率伍？219,269,0?(：国际）；作为一种面包面团的添加剂以改善面团和面包的特性（1^4,567,046，协和发酵（办〇?&他1^〇));并且用于制备具有特殊的乳化性能的溶血卵磷脂。[0010]可以将磷脂酶应用于植物油的脱胶以提供具有适于消费的中性味道和浅色的精炼贮存稳定的植物油。脱胶过程包括去除磷脂化合物，该磷脂化合物又称磷脂类或来自富含三酸甘油脂的油级分的"胶"。[0011]传统上，脱胶过程基于水萃取，用酸处理或腐蚀性处理，随后经过分离过程。由于磷脂类的乳化性，脱胶流程导致了油的损失，即，甘油三酯的损失。然而，酶法脱胶已经变得越来越普遍。酶法脱胶是在已经进行过了水脱胶的油上以及在粗油上进行。在食用油的水脱胶过程中，磷脂类的一部分被留在该油中。那部分用通用术语"非水化磷脂类"（NHP)来描述。在生产油的过程中，去除NHP含分是必不可少的（US5264367)。在酶法脱胶过程中，通过使用磷脂酶将NHP转化为溶于水的并且水可提取的组分。[0012]针对植物油的工业脱胶应用最广泛的商业酶是来自诺维信A/S公司的磷脂酶LECITASEULTRA(杨（Yang)等人，见上文）。LECITASEULTRA具有相对高的热稳定性；然而，其最适合用于温度最高不超过55°C的脱胶过程。[0013]一般通过使用酸性的和腐蚀性的化学品协助酶法脱胶。在初始脱胶步骤中，通过将金属与柠檬酸盐螯合，柠檬酸或磷酸的添加改善了磷脂的盐形式的水合性。在以下酶促反应中，pH经常需要被部分中和（典型地通过添加氢氧化钠）以适应所应用的酶的pH需要。当使用磷脂酶LECITASEULTRA时，针对此反应的最适pH为在5.0和5.5之间（参见申请表"植物油的精炼-改善脱胶产率（Refiningofvegetableoils-Improvingdegummingyield)"）。然而，在此pH范围内，在酶促反应期间所释放的钙和/或镁与用来控制反应条件的缓冲液或螯合酸结合，典型地导致盐形成并且导致因柠檬酸钙和柠檬酸镁的盐的沉淀的设备污染（US7,713,727)。如果酶促反应可以在较低pH下进行由此减少用于中和所使用的酸将是有利的。[0014]对于提供具有改善性质的新颖磷脂酶是一直存在的需要的，例如在高温和/或低pH下提高活性。本发明涉及具有磷脂酶A活性的此类新颖的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。[0015]发明概述[0016]本发明人已经鉴定出了一种来自嗜热篮状菌（Talaromycesleycettanus)菌株CBS398.68的具有磷脂酶A活性的新型多肽。本发明的多肽示出了在高温下的高热稳定性和/或提高的活性。因为它允许在较高温度下进行工业过程，这是一种优点。在酶法脱胶中，较高的温度可以提高存在于油中的磷脂类的酶法脱胶的速度，有助于在磷脂类的酶法降解后的油相和水相的分离，和/或降低油的粘度-所有以上这些导致较短的加工时间以及油脂精炼设备的较高物料通过量。[0017]此外，本发明的多肽在低pH下具有出乎意料高的活性，这是一种优点，即，在植物油的酶法脱胶中，其中pH调节的需要被降低，导致工艺设备的沉淀的较少的沉积并且因此节省了所减少使用的化学品连同降低了用于清洁的时间。[0018]多肽对大多数磷脂具有活性，包括磷脂酸（PA)、磷脂酰乙醇胺（PE)、磷脂酰肌醇(PI)、和磷脂酰胆碱（PC)。[0019]因此，本发明提供了具有磷脂酶A活性的新颖多肽和编码这些多肽的多核苷酸。[0020]在第一方面，本发明涉及具有磷脂酶A活性的分离多肽，所述分离多肽选自下组，该组由以下各项组成：（a)-种多肽，该与多肽SEQIDN0:2的成熟多肽或SEQIDN0:3的多肽具有至少80%的序列一致性；(b)-种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下与（i)SEQIDN0:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列、或（ii)(i)的全长互补体杂交；（c)一种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或与其cDNA序列具有至少65%序列一致性；（d)SEQIDNO:2的成熟多肽的的变体或SEQIDNO:3的多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；和（e)(a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶A活性。[0021]在第二方面，本发明涉及分离的核酸，所述分离的核酸选自下组，该组由以下各项组成：(a)-种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中所述多肽包括SEQIDN0:2的成熟多肽或SEQIDN0:3的多肽；(b)-种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中所述多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQIDN0:2的成熟多肽或与SEQIDN0:3的多肽具有至少80%的一致性；（c)一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中该核苷酸序列包括SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列；(d)-种核苷酸序列，该核苷酸序列与根据（a)、(b)、或（c)的核苷酸序列具有至少80%的序列一致性；（e)-种核苷酸序列，该核苷酸序列在高严格条件下与根据（a)、（b)、（c)、或（d)的核苷酸序列的互补链杂交；（f)根据（a)、(b)、（c)、（d)、或（e)的核苷酸序列的子序列，具有至少100个核苷酸；（g)-种序列，该序列由于遗传密码的简并性而简并为一种序列，该序列如在（a)、（b)、（c)、（d)、（e)、或（f)中任一项所定义的；和（h)根据（a)、（b)、（c)、（d)、（e)、（f)或（g)的核苷酸序列的互补链。[0022]在第三方面，本发明涉及一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括第二方面的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。[0023]在第四方面，本发明涉及一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括第二方面的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。[0024]在第四方面，本发明涉及一种产生第一方面的多肽的方法，该方法包括：(a)培养细胞，该细胞处于其野生型形式，在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；以及（b)回收该多肽。[0025]在第六方面，本发明涉及一种产生具有磷脂酶A活性的多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养第四方面的宿主细胞；以及（b)回收该多肽。[0026]在第七方面，本发明涉及一种组合物，该组合物包括（a)第一方面的多肽或通过第五或第六方面中任一项所述的方法可获得的一种多肽；以及（b)可任选地一种另外的酶。[0027]在第八方面，本发明涉及第一方面的多肽或任何第七方面的组合物在水解磷脂中的用途。[0028]在第九方面，本发明涉及一种方法，该方法用于降低食用油中的含磷组分的含量，该方法包括将所述的油与任何第一方面所述的多肽的水溶液接触，该水溶液乳化于该油中直至该油的磷含量降低，并且然后将水相与该处理过的油分开。[0029]附图简要说明[0030]图1说明了当不同的磷脂酶裂解一种磷脂的情况。[0031]图2说明了磷脂与磷脂酶A2的反应以形成一种溶血磷脂和一种游离R2脂肪酸，该溶血磷脂在甘油骨架中的位置C2处具有羟基基团。一种与磷脂酶A1的类似的反应将裂解用R1标记的脂肪酸，以形成一种游离R1脂肪酸和一种溶血磷脂，该溶血磷脂在甘油骨架中的位置C1处具有羟基基团。[0032]图3显示了在卵磷脂（PC)板上从pH3至pH7的LicitaseUltra和SEQIDN0:2的磷脂酶的活性。孵育时间为90分钟、150分钟、4小时、7小时、23小时、29小时和48小时。黑圈表示活性，圈越大活性越高。[0033]定义[0034]磷脂酶A活性：在本发明的上下文中，术语"磷脂酶A活性"包括具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶（A1或A2、EC3.1.1.32或EC3.1.1.4)，即，针对磷脂例如卵磷脂中的一个或二个羧酸酯键的水解活性。具有A1和A2二者活性的磷脂酶还称作磷脂酶B。[0035]出于本发明的目的，根据材料与方法(Materialandmethods)章节中所描述的程序确定磷脂酶A活性。在一方面，本发明的这些多肽具有SEQIDN0:2的成熟多肽的和/或SEQIDN0:3的多肽的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或至少100%的磷脂酶A活性。[0036]除了具有磷脂酶A活性之外，本发明的多肽还可以具有脂肪酶活性。[0037]磷脂酶C活性：磷脂酶C(E.C.3.1.4.11)去除了磷脂例如卵磷脂中的磷酸酯部分，以生产1，2甘油二酯和磷酸酯。[0038]磷脂酶D活性：磷脂酶D(E.C.3.L4.4)作用于磷脂例如卵磷脂，并且产生1，2-甘油磷酸二酯和碱基团。[0039]脂酶活性：术语"脂酶活性"在此定义为解脂活性，该解脂活性水解三丁酸甘油酯、油酸甘油酯、PNP-丁酸酯和pNP-棕榈酸酯（甘油三酯脂肪酶EC3.1.1.3)中的羧酸酯键。[0040]热稳定性：在本发明的上下文中，使用实例1中所描述的方法，通过差示扫描量热法（DSC)确定"热稳定性"。在一方面，本发明的多肽具有一个变性温度，该变性温度比LECITASEULTRA，即，在SEQIDN0:5中所示的多肽的变性温度至少高5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C、14°C、15°C、16°C或甚至17°C。[0041]等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。[0042]催化结构域：术语"催化结构域"意指一种酶的含有该酶的催化机构的区域。[0043]cDNA:术语"cDNA"意指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。[0044]编码序列：术语"编码序列"意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。[0045]控制序列：术语"控制序列"意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的（即，来自相同基因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。[0046]粗油：术语"粗油"是指（还称非脱胶的油）来自以下各项的一种压榨的或提取的油或其混合物，例如，蔬菜来源的包括但不限于：阿莎伊油（acaioil)、杏仁油、棕榈仁油、黑醋栗籽油（blackcurrentseedoil)、琉璃苣籽油、卡罗拉（CanolaOil)油、腰果油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉籽油、海甘蓝油、亚麻籽油、葡萄籽油、榛子油、线麻油、麻疯果油、霍霍巴油、亚麻籽油、澳洲坚果油、芒果仁油、白芒花籽油、芥子油、牛脚油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、胡桃油、松子油、阿月浑子油、罂粟籽油、菜籽油、米糠油、红花油、山茶花油、麻油、牛油果油、大豆油、葵花籽油、妥尔油、山茶油、核桃油，各种"天然"油经过基因修饰生物（GM0)或传统"裹面包肩"来改变脂肪酸组成，例如高油酸的、低油酸的、或低饱和的油（高油酸的菜籽油、低亚麻油酸的大豆油或高硬脂葵花油）。[0047]经过脱胶的油：术语"经过脱胶的油"是指一种油，该油在从油中去除非能水合的磷脂、能水合的磷脂、和卵磷脂（统称为"胶"）之后获得，以产生一种脱胶油或脂肪产品，该脱胶油或脂肪产品可以用于食品生产和/或非食品的应用，例如生物柴油。在某些实施例中，脱胶油具有少于约200ppm磷、少于约150ppm磷、少于约lOOppm磷、少于约50ppm磷、少于约40ppm磷、少于约30ppm磷、少于约20ppm磷、少于约15ppm磷、少于约lOppm磷、少于约7ppm磷、少于约5ppm磷、少于约3ppm磷或少于约lppm磷的磷脂含量。[0048]表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。[0049]表达载体：术语"表达载体"意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种多肽的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。[0050]片段：术语"片段"意指使一个或多个（例如，若干个）氨基酸从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺少的多肽，其中该片段具有磷脂酶A活性。根据本发明的片段具有的大小为大于大约160(例如SEQIDN0:3的氨基酸117-277)，优选的是大于200个氨基酸残基，优选大于210个氨基酸残基，更优选大于220个氨基酸残基，更优选大于230个氨基酸残基，更优选大于240个氨基酸残基，更优选大于250个氨基酸残基，更优选大于260个氨基酸残基（例如，SEQIDN0:3的氨基酸18至277或氨基酸1至259)，更优选大于270个氨基酸残基（例如，SEQIDN0:3的氨基酸8至277或氨基酸1至270)，并且最优选大于275个氨基酸残基。[0051]宿主细胞：术语"宿主细胞"意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。[0052]分离的：术语"分离的"意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括（1)任何非天然存在的物质；（2)至少部分地从与其当前第1页1 2 3 4 5 6