在自然界中相关 联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、 核酸、蛋白质、肽或辅因子；（3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何 物质；或者（4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质 (例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强 的启动子的使用）。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
[0053] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，基于SignalP 版本 3 的程序（尼尔森（Nielsen)等，1997,蛋白质工程（Protein Engineering) 10:1-6)， 该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸20至296。SEQ ID NO:2的氨基酸1至19被预测为 信号肽。该成熟多肽还被示为SEQ ID N0:3中氨基酸1至277。使用应用生物系统公司 Procise蛋白质序列系统分析在米曲霉（Aspergillus oryzae)中所表达的多肽的N-末端 序列。其显示了如下N-末端序列：
[0054] 35kDa带，具有对应于SEQ ID N0:2的残基28-34的N-末端DVSSSVL
[0055] 25kDa 带，具有对应于 SEQ ID N0:2 的残基 117-123 的 N-末端 EADLDFP
[0056] 25kDa 带，具有对应于 SEQ ID N0:2 的残基 120-126 的 N-末端 LDFPLTD
[0057] 本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种 不同成熟多肽（即，具有不同C末端和/或N末端氨基酸）的混合物。本领域还已知，不 同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表 达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽（例如，具有一个不同的 C末端和/或N末端氨基酸）。在一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO: 2的氨基酸28到296。 在另一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO: 2的氨基酸117至296或SEQ ID NO: 2的氨基酸120 至 296。
[0058] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有磷脂酶A活性的成熟 多肽的一种多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 1的核苷酸1至1284， 或其cDNA序列。在一方面，cDNA序列包括SEQ ID NO: 1的核苷酸101至182、核苷酸258 至423、核苷酸485至821、和核苷酸879至1184,或由其组成。在一方面，cDNA序列包括 SEQ ID N0:4的核苷酸1至891，或由其组成。在一方面，该cDNA是SEQ ID N0:4的核苷酸 58至891。SEQ ID N0:4核苷酸1至57编码信号肽。
[0059] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链-或双链核酸分子，其分离自天然存在 的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其 包括一个或多个控制序列。
[0060] 可操作地连接：术语"可操作地连接"意指一种配置，其中一个控制序列相对于一 种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指导编码序列的表达。
[0061] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列 一致性"描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软 件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人， 2000,遗传学趋势（Trends Genet.) 16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本）的尼德尔 (Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德尔 曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物学杂志（J. Mol. Biol.) 48:443-453)来确定两个氨 基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出 (使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且计算如下：
[0062](一致的残基x 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0063] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件， 赖斯（Rice)等人，2000,见上文）（优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程序中所实施的尼 德尔曼-翁施算法（尼德尔曼（Needleman)和翁施（Wunsch)，1970,见上文）来确定两个 脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚 分0. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一 致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且计算如下：
[0064]( -致的脱氧核糖核酸核苷酸x100)八比对长度-比对中的空位总数）。
[0065] 严格条件:非常低严格条件:术语"非常低严格条件"意指对于长度为至少100个 核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml 剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终 使用2X SSC、0. 2% SDS，在45°C下洗涤三次，每次15分钟。低严格条件:术语"低严格条 件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂 交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在50°C下洗涤三次，每次15分钟。 中严格条件:术语"中严格条件"意指对于长度为至少1〇〇个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和 35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在55°C 下洗涤三次，每次15分钟。中-高严格条件:术语"中_高严格条件"意指对于长度为至少 100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微 克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。 载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在60°C下洗涤三次，每次15分钟。高严格条件:术 语"高严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序， 在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中 预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在65°C下洗涤三次，每 次15分钟。非常高严格条件:术语"非常高严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸 的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并 变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在70°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0066] 子序列：术语"子序列"意指使一个或多个（例如，若干个）核苷酸从成熟多肽编 码序列或其cDNA序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸，其中该子序列编码具有磷脂酶 A活性的一个片段。
[0067] 变体：术语"变体"意指具有磷脂酶A活性的、在一个或多个（例如，若干个）位置 处包含改变（即，取代、插入和/或缺失）的一个多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替 换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占 据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
[0068] 发明详细说明
[0069] 具有磷脂酶A活性的多肽
[0070] 在一个实施例中，本发明涉及分离的多肽，这些分离的多肽与SEQ ID N0:2的成 熟多肽或与SEQ ID NO: 3的多肽具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或 100%的序列一致性，这些多肽具有磷脂酶A活性。在一方面，这些多肽与SEQ ID N0:2的 成熟多肽或与SEQ ID N0:3的多肽相差不超过10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或 10个。在一个优选的实施例中，磷脂酶A活性是SEQ ID N0:3的多肽的磷脂酶A活性的至 少 70%〇
[0071] 本发明的多肽优选地包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列、SEQ ID N0:3的氨基酸序 列、或其等位变体，或由其组成；或者是其具有磷脂酶A活性的片段。在另一方面，该多肽包 括SEQ ID N0:2的成熟多肽或SEQ ID N0:3的多肽，或由其组成。
[0072] 在一个优选的实施例中，当在70°C下使用2小时的情况下，本发明的多肽能够比 Lecitase Ultra更有效地降低粗油中的磷酸酯含量。优选地，本发明的多肽能够将磷酸酯 含量降低到少于50ppm磷、优选地少于约40ppm磷、更优选地少于约30ppm磷、更优选地少 于约20ppm磷、更优选地少于约15ppm磷、更优选地少于约10ppm磷、更优选地少于约7ppm 磷、甚至更优选地少于约5ppm磷、甚至更优选地少于约3ppm磷或最优选地少于约lppm磷。
[0073] 在另一个实施例中，本发明多肽的最优pH范围是在1. 5至约7. 0之间，优选的是 2. 5至6,优选的是3. 0至5. 5,优选的是从3. 5至5. 0并且最优选的是从3. 0至4. 5。
[0074] 在另一个实施例中，本发明多肽的是耐热的。优选地，当如在实例1中所描述的通 过差示扫描量热法确定时，热变性温度是65°C以上，更优选的是70°C以上，甚至更优选的 是75°C以上，并且更优选的是80°C以上。在另一个实施例中，本发明的多肽在pH 4和pH 5 下是同样热稳定的，例如，DSC值变化小于5°C，更优选的是小于4°C，甚至更优选的是小于 3°C并且最优选的是小于2°C。
[0075] 在另一个实施例中，本发明涉及一种具有磷脂酶A活性的分离的多肽，该分离的 多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下与（i)SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序 列或其cDNA序列、或（ii) (i)的全长互补体杂交（萨姆布鲁克（Sambrook)等人，1989,分 子克隆，实验室手册（Molecular Cloning, A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港（Cold Spring Harbor)，纽约）。
[0076] SEQ ID NO: 1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:2的多肽，或SEQ ID NO:3 的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定并克隆来自不同属或 种的株系的、编码具有磷脂酶A活性的多肽的DNA。具体而言，可以遵循标准DNA印迹程 序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应 基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15,例如至少25、至少35、或至 少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核 苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少 700个核苷酸、或至少800个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标 记（例如，用呷、 311、355、生物素、或抗生物素蛋白），以检测相应的基因。本发明涵盖此类探 针。
[0077] 可以针对与以上描述的探针杂交并且编码具有磷脂酶A活性的多肽的DNA，对从 此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA 或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的 DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO: 1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。
[0078] 出于本发明的目的，杂交指示多核苷酸在非常低至非常高严格条件下与一种标记 的核酸探针杂交，该探针对应于（i)SEQ ID N0:l;(ii)SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序列或 其cDNA序列；（iii) ;(iv)其全长互补体；或（v)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或 本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针杂交的分子。
[0079] 在一方面，该核酸探针是SEQ ID NO: 1的核苷酸1至100、核苷酸1至200、核苷酸 1至250、或核苷酸1至300。在另一个方面中，该核酸探针是编码SEQ ID N0:2的多肽；其 成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一个方面中，该核酸探针是SEQ ID N0:1。
[0080] 在另一个实施例中，本发明涉及一种具有磷脂酶A活性的分离的多肽，该分离的 多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列或与其cDNA序 列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少 95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性。
[0081] 在另一个实施例中，本发明涉及SEQ ID N0:2的成熟多肽的变体或SEQ ID N0:3 的多肽的变体，这些变体在一个或多个（例如，若干个）位置处包括取代、缺失和/或插入。 在一个实施例中，引入SEQ ID N0:2的成熟多肽或SEQ ID N0:3的多肽中的氨基酸取代、缺 失和/或插入的数目不超过10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。这些氨基酸变化可 以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入； 典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残 基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸， 如聚组氨酸段（tract)、抗原表位或结合结构域。
[0082] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸及组氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、异亮氨酸及缬氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘氨 酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸）。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领 域已知的并且例如由H.诺伊拉特（H.Neurath)和R. L.希尔（R. L.Hill)，1979,在蛋白质 (The Proteins)，学术出版社，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/ Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、 Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 以及 Asp/Gly。
[0083] 可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基 酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
[0084] 可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变（坎宁汉 (Cunningham)和威尔斯（Wells)，1989,科学（Science) 244:1081-1085)来鉴定多肽中的必 需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突 变体分子的磷脂酶A活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参 见，希尔顿（Hilton)等人，1996,生物化学杂质（J. Biol. Chem.)271:4699-4708。也可结合 假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和