标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。 参见，例如，德沃斯（de Vos)等人，1992,科学（Science) 255:306-312;史密斯（Smith)等 人，1992,分子生物学杂质（J. Mol. Biol.) 224:899-904;罗达维尔（Wlodaver)等人，1992， 欧洲生化学会联合会快报（FEBS Lett. )309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴 定必需氨基酸。
[0085] 在SEQID N0:2的氨基酸1至296的序列中的必需氨基酸位于位置H172、D228、 和H285。在一个优选的实施例中，这些位置保留在本发明的多肽中。
[0086] 可以进行单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入并且使用已知的诱变、重组、 和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如由里德哈-奥尔森（Reidhaar-Olson) 和索尔（Sauer)，1988,科学（Science)，241:53-57;鲍威（Bowie)和索尔（Sauer)，1989,美 国科学院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci.USA)，86:2152-2156;W0 95/17413或TO 95/22625所 披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示（例如，罗曼（Lowman)等人， 1991，生物化学（Biochemistry) 30:10832-10837 ;美国专利号 5, 223, 409 ;W0 92/06204)和 区域定向诱变（德比舍尔（Derbyshire)等人，1986,基因（Gene)46:145 ;内尔（Ner)等人， 1988, DNA7:127)。
[0087] 可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表 达的克隆的、诱变的多肽的活性（内斯（Ness)等人，1999，自然生物技术（Nature Biotechnology) 17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且 使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基 的重要性。
[0088] 具有磷脂酶A活性多肽的来源
[0089] 本发明的具有磷脂酶A活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的 目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语"从...中获得"应意指由多核苷酸编码的多 肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面 中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
[0090] 该多肽可以是一种真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，例如假丝酵 母属（Candida)、克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、毕赤酵母属（Pichia)、酵母菌属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属（Yarrowia) 多肽；或丝状真菌多肽，例如枝顶孢霉属（Acremonium)、伞菌属（Agaricus)、链格孢 属（Alternaria)、曲霉属（Aspergillus)、短梗霉属（Aureobasidium)、葡萄座腔菌 属（Botryospaeria)、拟錯菌属（Ceriporiopsis)、毛卩彖壳属（Chaetomidium)、金孢子 菌属（Chrysosporium)、麦角菌属（Claviceps)、旋抱腔菌属（Cochliobolus)、鬼伞 属（Coprinopsis)、乳白蚁属（Coptotermes)、棒囊壳属（Corynascus)、隐丛赤壳菌属 (Cryphonectria)、隐球菌属（Cryptococcus)、色二抱属（Diplodia)、黑耳属（Exidia)、 线黑粉酵母属（Filibasidium)、镰孢属（Fusarium)、赤霉属（Gibberella)、全鞭毛虫属 (Holomastigotoides)、腐质霉属（Humicola)、耙齿菌属（Irpex)、蘑燕属（Lentinula)、 小腔球菌属（Leptospaeria)、梨孢菌属（Magnaporthe)、黑果菌属（Melanocarpus)、多孔 菌属（Meripilus)、毛霉属（Mucor)、毁丝霉属（Myceliophthora)、丛赤壳属（Nectria)、 新美鞭菌属（Neocallimastix)、脉孢菌属（Neurospora)、拟青霉属（Paecilomyces)、青 霉菌属（Penicillium)、平革菌属（Phanerochaete)、瘤胃壶菌属（Piromyces)、某真菌 属（Poitrasia)、假黑盘菌属（Pseudoplectania)、假披发虫属（Pseudotrichonympha)、 根毛霉菌属（Rhizomucor)、裂糟菌属（Schizophyllum)、柱顶孢属（Scytalidium)、踝 节菌属（Talaromyces)、嗜热子囊菌属（Thermoascus)、梭孢壳霉属（Thielavia)、弯颈 霉属（Tolypocladium)、木霉属（Trichoderma)、长毛盘菌属（Trichophaea)、轮枝孢属 (Verticillium)、小包脚燕属（Volvariella)或炭角菌属（Xylaria)多肽
[0091]在另一方面，该多肽是卡氏酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵 母（Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母（Saccharomyces diastaticus)、道格拉斯 酵母（Saccharomyces douglasii)、克鲁费酵母（Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母 (Saccharomyces norbensis)、或卵形酉孝母（Saccharomyces oviformis)多月太。
[0092]在另一方面，该多肽是解纤维枝顶孢霉（Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲 霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、烟曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、构 巢曲霉（Aspergillus nidulans)、黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum)、拉克淖金抱子菌（Chrysosporium lucknowense)、类状金抱子菌 (Chrysosporium merdarium)、毯金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、昆士兰金抱子 菌（Chrysosporium queenslandicum)、热带金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、带纹 金抱子菌（Chrysosporium zonatum)、杆抱状镜抱（Fusarium bactridioides)、禾谷镜 抱（Fusarium cerealis)、库威镜抱（Fusarium crookwellense)、黄色镜刀菌（Fusarium culmorum)、禾谷镜刀菌（Fusarium graminearum)、禾赤镜抱（Fusarium graminum)、异抱 镜抱（Fusarium heterosporum)、合欢木镜抱（Fusarium negundi)、尖抱镜刀菌（Fusarium oxysporum)、多枝镜抱（Fusarium reticulatum)、粉红镜抱菌（Fusarium roseum)、接 骨木镜抱（Fusarium sambucinum)、肤色镜抱（Fusarium sarcochroum)、拟枝抱镜刀菌 (Fusarium sporotrichioides)、硫色镜刀菌（Fusarium sulphureum)、圆镜抱（Fusarium torulosum)、拟丝抱镜刀菌（Fusarium trichothecioides)、镶片镜抱菌（Fusarium venenatum)、灰腐质霉（Humicola grisea)、特异腐质霉（Humicola insolens)、疏棉状腐 质霉（Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌（Irpex lacteus)、米黑毛霉（Mucor miehei)、 嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila)、粗糖脉抱菌（Neurospora crassa)、绳状 青霉菌（PeniciIlium funiculosum)、产紫青霉（Penicillium purpurogenum)、黄抱原 毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭抱壳（Thielavia achromatica)、 成层梭抱壳菌（Thielavia albomyces)、白毛梭抱壳（Thielavia albopilosa)、澳洲 梭抱壳（Thielavia australeinsis)、类梭抱壳（Thielavia fimeti)、小抱梭抱壳 (Thielavia microspora)、卵抱梭抱壳（Thielavia ovispora)、秘鲁梭抱壳（Thielavia peruviana)、毛梭抱壳（Thielavia setosa)、瘤抱梭抱壳（Thielavia spededonium)、耐热 梭抱壳（Thielavia subthermophila)、土生梭抱壳（Thielavia terrestris)、哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)、康宁木霉（Trichoderma koningii)、长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride) 多肽。
[0093] 在另一方面，该多肽是一种从丛赤壳属（Nectria sp.)中获得的多肽，例 如，米红丛赤壳菌（Nectria cinnabarina)、渥红丛赤壳菌（Nectria coccinea)、鲜 红丛赤壳菌（Nectria ditissima)、多抱囊霉丛赤壳菌（Nectria diversispora)、 Nectria eustromatica、叶生丛赤壳菌(Nectria foliicola)、类杆菌丛赤壳菌 (Nectria fragilis)、富克尔丛赤壳菌（Nectria fuckeliana)、仁果干癌丛赤壳菌 (Nectria galligena)、红球丛赤壳菌（Nectria haematococca)、球壳丛赤壳菌（Nectria episphaeria)、辛夷丛赤壳菌(Nectria magnoliae)、Nectria mammoidea var. rubi、 Nectria mauritiicola、7jC球丛赤壳菌（Nectria peziza)、假毛丛赤壳菌(Nectria pseudotrichia)、红花丛赤壳菌（Nectria punicea)、根赤壳属丛赤壳菌(Nectria radicicola)和Nectria ramulariae中的任一种。
[0094] 将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态 (perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们 已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
[0095] 这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国 典型培养物保藏中心（ATCC)、德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心（NRRL)〇 [0096]可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界（例如，土壤、堆肥、水等等） 分离的微生物或直接从自然材料（例如，土壤、堆肥、水等等）获得的DNA样品鉴定和获得 该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以 通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多 肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领 域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸（参见例如，Sambrook (萨姆布鲁克）等 人，1989,同上）。
[0097] 多核苷酸
[0098] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。
[0099]用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或 cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应（PCR)或表达文库的抗 体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见 例如，伊尼斯（Innis)等人，1990，PCR:方法和应用指南（PCR:A Guide to Methods and Application)，学术出版社（Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接 酶链式反应（LCR)、连接激活转录（LAT)和基于多核苷酸的扩增（NASBA)。这些多核苷酸可 以由指端丛赤壳属菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码 区的等位基因或种变体。
[0100] 编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是 必需的。术语"实质上类似"于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以 某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等 方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列、或其cDNA序列 (例如其子序列）形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但 对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可以产生 不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德（Ford) 等人，1991，蛋白表达与纯化（Protein Expression and Purification) 2:95-107。
[0101] 核酸构建体
[0102] 本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制 序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合 适的宿主细胞中的表达。
[0103] 可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载 体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术 是本领域熟知的。
[0104] 该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核 苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表 达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及 杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因 获得。
[0105]用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实 例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲 霉酸稳定性a -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲 霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶（WO 96/00787)、镶片 镰孢淀粉葡糖苷酶（W0 00/56900)、镶片镰孢Daria(W0 00/56900)、镶片镰孢Quinn (TO 00/56900)、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏 木霉0 _葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内 切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚 糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉 0 -木糖苷酶，以及NA2_tpi启动子（一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性a -淀粉酶基 因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻