固定化转氨酶和制备及使用固定化转氨酶的方法
【专利说明】固定化转氨酶和制备及使用固定化转氨酶的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及固定化转氨酶和生产及使用它们的方法。
[0002] 序列表、表格或计算机程序的参考 序列表的正式文本通过EFS-Web与说明书同时提交作为ASCII格式文本文件，文件名 为"23277-US-PSP.txt "，建立日期为2013年2月26日，尺寸为8, 192字节。通过EFS-Web 提交的序列表为说明书的一部分并整体引入本文中作为参考。
[0003] 发明背景 酶是用于加速活细胞的化学反应（通常为几个数量级）的蛋白分子。在没有酶的情况 下，大部分生化反应将非常缓慢以致于甚至无法进行生命过程。酶展示出巨大的特异性，并 且不会由它们在反应中的参与而被持久地修饰。由于它们在反应中并不改变，因此可以成 本有效地将酶作为催化剂用于期望的化学转化。
[0004] 转氨酶是催化酮类至手性胺的直接氨基化的特异类型的酶。对映体纯手性胺在合 成具有广泛生物活性的许多药物化合物中是关键中间体。目前在进行许多努力以利用生物 催化剂开发用于它们制备的有效催化方法。近期，转氨酶已经显现出作为用于手性胺生产
[0005]例如，铑催化的不对称烯胺氢化最初用于大规模制造抗糖尿病的化合物 西他列汀。用转氨酶代替铑，这最终已经产生了减少废料、改善收率和安全性并 消除对金属催化剂的需要的酶促方法。此外，由此产生的生物催化剂显示出对手 性胺合成的广泛适用性，而所述手性胺之前其仅可通过拆分（resolution)获得。
[0006] 尽管使用转氨酶产生手性胺的进展已经被高度关注，但对于酶促方法仍存在某些 缺点。目前，酶促方法仅能在含水溶剂体系中进行，这是由于转氨酶在100%的有机溶剂中 不稳定。此外，在产品胺分离的过程中，转氨酶催化剂失活并被丢弃，导致无法再次使用该 催化剂。
[0007] 因此，尽管已经进行了尝试以将转氨酶固定化，但从未成功地克服它们缺乏稳定 性的缺点，更具体地，它们在有机溶剂中缺乏稳定性的缺点。
[0008] 发明概述 本文描述了固定化转氨酶，其包含与树脂物理连接的重组转氨酶。本文描述的固 定化转氨酶包括重组转氨酶，其能够在氨基供体存在的情况下，将4-氧代_4-[3-(三 氟甲基）-5,6_二氢[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8功-基]-1-(2,4,5-三氟苯基） 丁-2-酮转化成（2功-4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5,6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7(8功-基]_1_(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺至通过分析技术可测定的水平。在某些实 施方案中，使用本文描述的固定化转氨酶以生产（2功-4-氧代-4- [3-(三氟甲基）-5, 6-二 氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8功-基]_1_(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺。
[0009] 在某些实施方案中，本文描述了固定化转氨酶，其包含能够在氨基供体存 在的情况下，将4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮转化成（2功-4-氧代-4- [3-(三氟甲 基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8功-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺 至通过分析技术可测定的水平的重组转氨酶；和树脂，其中所述重组转氨酶通过物理作用 与树脂连接，并且其中固定化转氨酶在包含至少90%的有机溶剂的溶剂体系中是稳定的。
[0010] 例如，在一个实施方案中，所述重组转氨酶通过亲水作用与树脂连接。
[0011] 本文描述的固定化转氨酶在有机溶剂体系中是稳定的。如本文所用，稳定的固定 化转氨酶表示所述固定化转氨酶在有机溶剂体系中保持它的结构构象或它的活性。在本文 描述的一个实施方案中，所述固定化转氨酶在包含至少95%的有机溶剂的溶剂体系中是稳 定的。
[0012] 在本文描述的某些实施方案中，所述重组转氨酶是能够在氨基供体存在 的情况下，将4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮转化成（2功-4-氧代-4- [3-(三氟甲 基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8功-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺 至通过HPLC-UV吸光度可测定的水平的转氨酶。
[0013] 在仍另一个实施方案中，所述重组转氨酶选自：SEQ IDN0: 1。
[0014] 在本文描述的固定化转氨酶的某些实施方案中，所述树脂包含甲基丙烯酸酯。例 如，在一种实施方案中，所述树脂从甲基丙烯酸酯合成，其中单体和交联剂为甲基丙烯酸 酯。在某些实施方案中，所述树脂不含任何芳族化合物。在其他实施方案中，所述树脂为 DIAI0NHP2MG (Mistubishi)。DIAI0NHP2MG为仅从甲基丙烯酸酯合成的高度多孔的甲基 丙烯酸酯基吸附树脂(单体和交联剂为甲基丙烯酸酯)。DIAION HP2MG (Mistubishi)不含 任何芳族化合物，并被认为是中度极性吸附树脂。DIAION HP2MG (Mistubishi)适合通过使 用聚合物基质的更亲水特性进行的具有相对高极性的有机化合物的脱盐和吸附。
[0015] 在一种实施方案中，在固定化转氨酶中，转氨酶SEQ ID NO: 1与树脂DIAION HP2MG(Mitsubishi)连接。在另一种实施方案中，转氨酶SEQ ID NO: 1通过亲水作用与树 脂 DIAION HP2MG(Mitsubishi)连接。
[0016] 本文还描述了生产和使用固定化转氨酶的方法。本文描述的固定化转氨酶可以用 于分批反应中，其中固定化转氨酶可以在反应完成后滤出并在其他反应中再次使用。或者， 本文描述的固定化转氨酶可以用于连续反应系统中，其中起始物质连续经过所述固定化转 氨酶并收集产物。
[0017] 在一个实施方案中，本文描述的方法是生产（2功-4-氧代_4-[3-(三氟甲 基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡嗪-7 (8功-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺 的方法，其包括以下步骤： 1) 将4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮溶于有机溶剂中； 2) 将4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮与固定化转氨酶接触，所述固定化转氨酶能 够在氨基存在的情况下，将4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a] 吡嗪-7(8功-基]-1-(2,4,5-三氟苯基）丁-2-酮转化成（2功-4-氧代-4-[3-(三氟甲 基）_5,6_二氢[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)_基]-1-(2,4,5-三氟苯基）丁-2-胺。
[0018] 优选地，在此类方法中，所述固定化转氨酶是与树脂DIAION(Mitsubishi)物理连 接的转氨酶SEQ IDN0: 1。
[0019] 本文还描述了生产固定化转氨酶的方法，其包括： 1) 将转氨酶溶液与树脂和酶溶液孵育以形成固定化转氨酶； 2) 过滤并冲洗所述固定化转氨酶； 3) 干燥所述固定化转氨酶。
[0020] 发明详述 "转氨酶（Transaminase) "，也称为"氨基转移酶（aminotransferase) "，在本文中用于 指具有从伯胺（3)向受体羰基化合物（2)转移氨基（NH2)和氢原子、将胺供体转化为它对 应的羰基化合物（4)并将受体转化为它对应的伯胺（1)的酶促能力的多肽：
[0021] 关于本文描述的固定化转氨酶，该转氨酶多肽能够在式（3)的氨基供体存在 的情况下，将式（2a)的底物4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5,6_二氢[1，2,4]三唑并 [4,3-<3]吡嗪-7(8功-基]-1-(2,4,5-三氟苯基）丁-2-酮（"酮酰胺底物"）转化成 式（la)的产物（2功-4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5,6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]_1_(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺（"产物"），如下：
其中当独立地获得时，R1、R2、R3和R 4的每一个是未取代的或取代有一个或多个对酶无 抑制性的基团的烷基、烷基芳基或芳基。R1和R3在结构或手性上可以分别与R2和R 4相同 或不同。基团R1和R2或R3和R 4-同可以形成未取代的、取代的或与其他环稠合的环。
[0022] "蛋白"、"多肽"和"肽"在本文中可以互换使用来表示通过酰胺键共价连接的至少 两个氨基酸的聚合物，而与长度或翻译后修饰（例如糖基化、磷酸化、脂化、十四烷基化、泛 素化等）无关。包括在该定义内的有D-和L-氨基酸、和D-和L-氨基酸的混合物。
[0023] 如本文所用"底物"指在由转氨酶介导的反应中从氨基供体接受氨基的氨基受 体，诸如酮。如本文进一步描述，底物可以包括式（II)的化合物、式（2)的化合物和式 (2a)的化合物。在本文描述的某些方法中，"酮酰胺底物"具体指式（2a)的化合物4-氧 代 _4-[3-(三氟甲基）-5,6_二氢[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)_基]-1-(2,4,5-三 氟苯基）丁 -2-酮。
[0024] "氨基供体"指能够向受体羰基化合物（即氨基受体）供应氨基，由此形成羰基副 产物的氨基化合物。氨基供体为通式（3)的分子，
其中当独立地获得时，R\R2的每一个是未取代的或取代有一个或多个对酶无抑制性的 基团的烷基、烷基芳基或芳基。R1在结构或手性上可以与R2相同或不同。基团R1和R 2- 同可以形成未取代的、取代的或与其他环稠合的环。可以用于本发明的典型氨基供体包括 手性的和非手性的氨基酸、和手性的和非手性的胺。
[0025] "手性胺"指其中札和R2是不相同的通式R「01(順2) -R2的胺，并且在本文中以其 最广泛含义使用，包括很多种不同的，和混合的功能类型的脂肪族和脂环族化合物，其特征 在于存在与仲碳原子结合的伯氨基，其除了氢原子之外还携带（i)形成手性环结构的二价 基团，或（ii)两个在结构或手性上彼此不同的取代基（不是氢）。形成手性环结构的二价 基团包括例如2_甲基丁烧-1，4_二基、戊烧-1，4_二基、己烧-1，4_二基、己烧-1，5_二 基、2-甲基戊烷-1，5-二基。仲碳原子上的两个不同取代基（上文的&和1? 2)也可以在很 大程度上变化，并且包括烷基、芳烷基、芳基、卤素、羟基、低级烷基、低级烷氧基、低级烷基 硫基、环烷基、羧基、烷氧羰基、氨基甲酰基、单-和双-(低级烷基）取代的氨基甲酰基、三 氟甲基、苯基、硝基、氨基、单-和双-(低级烷基）取代的氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷 基酰胺基、芳基酰胺基等，以及由上述基团取代的烷基、芳烷基或芳基。
[0026] "羰基副产物"指当在氨基交换反应中氨基供体上的氨基转移至氨基受体时从氨 基供体形成的羰基化合物。羰基副产物具有式（4)的通常结构：
其中&和R2的定义在对氨基供体的上文中。
[0027] "磷酸吡哆醛"、"PLP"、"5' -磷酸吡哆醛"、"PYP"和"P5P"在本文中可互换使用来 指在转氨酶反应中充当辅酶的化合物。在某些实施方案中，通过结构1_(4' -甲酰基-3' -羟 基-2' -甲基-5' -吡啶基）甲氧基磷酸，CAS号[54-47-7]，来定义磷酸吡哆醛。5' -磷酸 吡哆醛在体内通过吡哆醇（也被称为吡哆素或维生素B6)的磷酸化和氧化来产生。在使用 转氨酶酶类的氨基交换反应中，氨基供体的氨基转移至辅酶以产生酮副产物，同时5'-磷 酸吡哆醛转化为磷酸吡哆胺。通过与不同的酮化合物（氨基受体）反应再生5'-磷酸吡哆 醛。氨基从磷酸吡哆胺向氨基受体的转移产生手性胺并且再生辅酶。本发明的5'-磷酸吡 哆醛可以由维生素B6家族的其他成员替代，其中，包括吡哆醛（PL)、吡哆胺（PM)、及它们磷 酸化的对应物；磷酸吡哆素（PNP)和磷酸吡哆胺（PMP)。
[0028] "天然存在的"或"野生型"指自然界中发现的形式。例如，天然存在的或野生型多 肽或多核苷酸序列是存在于可以从自然界中的来源分离的生物体内的序