ience 7:cl_12, 2002.)。不透明的硝酸纤维素已经广泛 用来固定用于生物分子分析的蛋白和核酸。硝酸纤维素以近乎定量的方式固定目标分子， 并允许短期或长期保存。硝酸纤维素还允许溶液相目标种类有效地结合到固定化实体上。
[0072] 固体支持物可以是连接分子可对其适用的任何合适的组合物。在应用连接/分子 肽之前，可以将它预处理或官能化以利于连接分子的结合或者用于任何其他期望的目标， 诸如促进有助于实体的活性或任何其他所需特性的条件，或者避免与其他实体不期望的相 互作用。许多这样的表面处理和/或官能化是本领域已知的，并且合适的处理和/或官能化 的选择将依赖于连接分子/肽和实体的本性和特征以及依赖于伴随的条件和期望的活性。
[0073] 关于本文描述的固定化转氨酶，所述固体支持物是树脂。树脂可以由任何合适的 组合物制成，包括但不限于聚甲基丙烯酸酯和苯乙烯/DVB共聚物。此类树脂可以包括官能 团并且利于重组转氨酶与树脂的共价结合（convalent bonding)。合适的官能团包括但不 限于环氧官能团和氨基环氧官能团。此外，其他的官能团诸如十八烷基和包括多孔结构的 树脂利于产生与重组转氨酶的疏水作用。
[0074]在本文中所述的固定化转氨酶的某些实施方案中，所述树脂包含甲基丙烯酸酯。 合适的树脂的实例包括但不限于DIAI0N HP2MG (Mitsubishi)。
[0075] 下表示出可以与本文中所述的固定化转氨酶关联使用的优选树脂： 表1
[0076]在本文中所述的固定化转氨酶的某些实施方案中，所述固定化转氨酶包括与转氨 酶物理连接的树脂。合适的树脂包括没有芳族化合物或其他官能团的甲基丙烯酸酯。实例 包括但不限于 DIAI0N HP2MG (Mitsubishi)。
[0077]在本文中所述的固定化转氨酶的又其他实施方案中，所述固定化转氨酶由与树脂 DIAION HP2MG (Mitsubishi)物理连接的转氨酶SEQ ID NO: 1构成。在本文所述的固定 化转氨酶的又其他实施方案中，所述固定化转氨酶由通过亲水作用与树脂DIAION HP2MG (Mitsubishi)物理连接的转氨酶SEQ ID NO: 1构成。
[0078] 固宙化转氨酶的制备方法 本文还描述了固定化转氨酶的制备方法。在本文描述的固定化转氨酶的制备方法的某 些实施方案中，该方法开始于通过溶解酶于水或缓冲溶液中制备酶溶液。转氨酶多肽可以 使用磷酸吡哆醛（PLP)作为辅酶，当制备时，其可以与例如由其中表达多肽的宿主细胞提 供的酶结合。在某些实施方案中，可以在转氨酶多肽表达过程中将PLP、PLP类似物或PLP 前体加入到宿主细胞的培养基中。在所述方法的某些实施方案中，PLP或PLP类似物可以 加入到反应中以提供酶活性所需的辅酶。可以由本领域技术人员测定对酶活性足够的PLP 量。
[0079] 在固定化转氨酶的制备方法的某些实施方案中，所述转氨酶溶液可以包含约 5. 0-约9. 0的pH。在某些实施方案中，所述方法的反应条件为约7. 5至约8. 5的pH。在其 他实施方案中，所述方法的反应条件为约7的pH。
[0080] 另外，溶剂可以添加至酶溶液中。可以用于本文所述方法中的合适的有机溶剂包 括在本领域中熟知的任何有机溶剂，例如甲醇、乙醇、THF、DMS0、甲苯、乙酸异丙酯、己烧、异 丙醇、丙醇、苯、丙酮、二甲苯、甲乙酮、乙醚和乙酸乙酯和其混合物。在本文中所述的方法的 某些实例中，有机溶剂为异丙醇。
[0081] 所述方法还包括使转氨酶与树脂接触或孵育。这可以通过将树脂加入到溶液中实 现。随后将溶液摇动一定长度的时间，诸如过夜。或者，所述酶溶液可以间歇式或连续式模 式与树脂接触。例如，树脂可以装进柱中，然后酶溶液可以通过该柱。
[0082] 在某些实施方案中，用于进行所述方法的反应条件可以包括约5°C -约70°C的温 度。在某些实施方案中，所述反应条件为约25°C的温度（室温）。
[0083] 如果该方法在溶液中完成，则一旦反应如果完成，将固定化转氨酶过滤并冲洗。在 本文描述的方法的某些实施方案中，用水或其他溶剂冲洗固定化转氨酶后，在它用于100% 有机溶剂体系中之前将制剂干燥。固定化酶可以在真空下干燥，并用氮气吹扫以将水从固 定化酶树脂的外表面去除。干燥的同时可以搅拌固定化制剂以允许在固定化酶床各处均匀 的水分含量，从而避免该固定化酶制剂的任何部分干燥过度或干燥不充分。还可以通过用 有机溶剂洗涤来干燥固定化制剂。干燥过度可以导致活性丧失，这是由于水被从与树脂连 接的酶分子上除去。干燥不充分可以导致有机溶剂体系中不充分的质量传递，从而影响期 望底物的氨基交换。
[0084] 如果以间歇式或连续式模式完成所述方法，则洗涤与在柱中装填树脂连续完成。 使用装填的柱反应器开始其他反应。
[0085] 固宙化转氨酶的伸用方法 本文描述的固定化转氨酶可以用于从伯胺向受体羰基化合物转移氨基（nh2)和氢原 子，将胺供体转化为它对应的羰基化合物并将受体转化为它对应的伯胺。这样的方法包括 在氨基供体存在的情况下，在合适的有机溶剂中，在其中受体羰基化合物转化为它对应的 伯胺的合适的反应条件下，将受体羰基化合物与本文描述的固定化转氨酶接触。
[0086] 在某些实施方案中，所述固定化转氨酶可以用于以超过相对的对映体的至少70% 的对映体过量制备结构式（I)的化合物的方法中：
所述化合物在用*标记的立体异构中心（stereogenic center)处具有指明的立体化学构型；其中 Z 为 OR2 或 NR 2R3; R1为C i s烷基、芳基、杂芳基、芳基-C i 2烷基或杂芳基-C i 2烷基； R2和R3各自独立地为氢、C i s烷基、芳基或芳基2烷基；或 R2和R 3共同与和它们连接的氮原子形成4-7元杂环系统，其任选包含选自0、S、NH和 NCQ4烷基的额外杂原子，该杂环为未取代的或取代有一个至三个独立选自氧代、羟基、卤 素、Q 4烷氧基和C i 4烷基的取代基，其中，所述烷基和烷氧基为非取代的或取代有一个至 五个氟；并且杂环系统任选稠合于5-6元饱和的或芳香族碳环系统或含有一个至两个选自 0、S和NC。 4烷基的杂原子的5-6元饱和的或芳香族杂环系统，所述稠合环系统为未取代的 或取代有一个至两个选自羟基、氨基、氟、Q 4烷基、Ci4烷氧基和三氟甲基的取代基。在这 些实施方案中，该方法包括在氨基供体存在的情况下，在合适的有机溶剂中，在对于式（II) 的化合物至式（I)的化合物的转化合适的反应条件下，将结构式（II)的前手性酮：
与固定化转氨酶多肽接触的步骤。
[0087] 在所述方法的某些实施方案中，式（II)的R1为苯甲基，其中苯甲基的苯基是未取 代的或取代有一个至三个选自氟、三氟甲基和三氟甲氧基的取代基。
[0088] 在所述方法的某些实施方案中，式（II)的Z是NR2R3。
[0089] 在所述方法的某些实施方案中，式（II)的NR2R3是结构式（III)的杂环：
其中R4为氢或C i 4烷基，其是未取代的或取代有一个至五个氟。
[0090] 在某些实施方案中，所述固定化转氨酶可以用于以超过具有相对的（5)_构型的 对映体的至少70%的对映体过量制备结构式（1)的化合物的方法中：
所述化合物在用***标记的立体异构中心处具有（功-构型，其中Ar是苯基，其是未取 代的或取代有一个至五个独立地选自氟、三氟甲基和三氟甲氧基的取代基；并且R4是氢或 未取代的或取代有一个至五个氟的Q 4烷基。在这些实施方案中，该方法包括在氨基供体 存在的情况下，在合适的有机溶剂中，在对于式（2)的化合物至式（1)的化合物的转化合适 的反应条件下，将结构式（2)的前手性酮：
与本文公开的固定化转氨酶多肽接触的步骤。
[0091] 在所述方法的某些实施方案中，式（2)的Ar是2, 5-二氟苯基或2, 4, 5-三氟苯基， 并且R4是三氟甲基。
[0092] 在所述方法的某些实施方案中，式（2)的Ar是2, 4, 5-三氟苯基。
[0093] 在某些实施方案中，所述转氨酶可以用于以对映体过量制备式（la)的 化合物，（2功-4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]-1-(2, 4, 5-三氟苯基）丁-2-胺的方法中：
[0094] 在这些实施方案中，所述方法包括在氨基供体存在的情况下，在合适的有机溶 剂中，在对于式（2a)的化合物至式（la)的化合物的转化合适的反应条件下，将结构式 (2a)的前手性酮，4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]-1- (2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮：
与本文描述的固定化转氨酶接触的步骤。
[0095] 在上述方法的某些实施方案中，式（I)的化合物、式（1)的化合物或式（la)的化 合物以至少 70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的对映体过量 产生。
[0096] 在所述方法的某些实施方案中，式（I)的化合物、式（1)的化合物或式（la)的化 合物以至少99%的对映体过量产生。
[0097] 其中，式（II)的化合物、式⑵的化合物和式（2a)的化合物以及它们的合成描述 于美国专利号7, 326, 708和7, 468, 459中，其公开内容以其整体通过引用并入本文。
[0098] 在某些实施方案中，本文描述的固定化转氨酶的使用方法包括以下步 骤：1)将4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5,6_二氢[1，2,4]三唑并[4,3-a]吡 嗪-7 (8功-基]_1_(2,4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮溶解在有机溶剂中；2)在氨基存 在的情况下使4-氧代-4-[3-(三氟甲基）-5, 6-二氢[1，2, 4]三唑并[4, 3-a]吡 嗪-7 (8功-基]_1_(2, 4, 5-三氟苯基）丁 -2-酮与本文描述的固定化转氨酶接触。
[0099] 本文描述了包含与树脂物理连接的重组转氨酶的固定化转氨酶，其中所述转氨酶 在有机溶剂中是稳定的。可以用于本文描述的方法中的合适的有机溶剂包括本领域普遍知 晓的任何有机溶剂，诸如甲醇、乙醇、THF、DMS0、甲苯、乙酸异丙酯、己烷、丙醇、苯（bezene)、 丙酮、二甲苯、甲基乙基酮、乙醚和乙酸乙酯和其混合物。在本文描述的方法的某些实例中， 所述有机溶剂是乙酸异丙酯。
[0100] 在某些实施方案中，所述有机溶剂是非水饱和的溶剂。在其他实施方案中，所述有 机溶剂是水饱和的溶剂。水饱和可以使固定化酶保持恒定的水浓度并且防止固定化酶在反 应过程中进一步干燥。当该固定化酶在反应结束时分离并再次用于多个批次时，这能够允 许更高的操作稳定性。在本文描述的方法的某些实例中，所述有机溶剂是水饱和的乙酸异 丙酯。
[0101] 在某些实施方案中，所述转氨酶在其中稳定的溶剂是溶剂体系的组分。在本文描 述的固定化转氨酶的使用方法的某些实施方案中，溶剂体系是100%有机溶剂体系。在其 他实施方案中，溶剂体系包含50-60%的有机溶剂。优选地，溶剂体系包含60-70%的有机溶 剂。更优选地，溶剂体系包含70-80%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含80-90%的有机 溶剂。更优选地，溶剂体系包含90-100%的有机溶剂。在其他实施方案中，溶剂体系包含至 少50%的有机溶剂。在其他实施方案中，溶剂体系包含至少55%的有机溶剂。优选地，溶剂 体系包含至少60%的有机溶剂。优选地，溶剂体系包含至少65%的有机溶剂。更优选地，溶 剂体系包含至少70%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含至少75%的有机溶剂。更优选 地，溶剂体系包含至少80%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含至少85%的有机溶剂。更 优选地，溶剂体系包含至少90%的有机溶剂。更优选地，溶剂体系包含至少95%的有机溶剂。 更优选地，溶剂体系包含至少100%的有机溶剂。溶剂体系可以包含超过一种的有机溶剂， 其中，所述固定化转氨酶在溶剂体系中存在的一种或所有有机溶剂中是稳定的。
[0102] 如上所述，用于所述方法中的氨基供体可以是手性胺或非手性胺。非手性氨基供 体具有在它的反应中不限制于具体的立体异构体，因此需要更少的氨基供体的优点。可以 使用多种合适的氨基供体，作为举例并且无限制地，包括，异丙胺（也称为2-氨基丙烷）、L、 D或DL丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸（或任何其他合适的a氨基酸）、3_氨 基丁酸（或任何其他合适的0氨基酸）