、和大豆；蛋 (全蛋，蛋黄或蛋白）；氧化剂例如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二酰胺（ADA)或过硫酸 铵；氨基酸例如L-半胱氨酸；糖；盐例如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。
[0187] 该面团可以包括脂肪（甘油三酸酯）例如成粒的脂肪或起酥油，但是本发明特别 适用于一种面团，其中添加按重量计少于1 %的脂肪，并且特别适用于一种没有添加脂肪所 制作的面团中。
[0188] 该面团可以进一步包括一种乳化剂例如单-或二甘油酯、单-或二甘油酯的二乙 酰酒石酸酯、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的聚甘油酯、单甘油酯的乳酸酯、单甘油酯的乙酸酯、聚 氧乙烯硬脂酸酯、或溶血卵磷脂。
[0189] 该面团可以用于由面团制备的任何种类的烘焙产品，软的或脆的特性的，白色的、 浅色的或深色的类型。实例是面包（特别是白色的，全麦面粉的或黑麦面包），典型地以面 包条或卷的形式，法国长棍类型的面包，皮塔饼、玉米饼、饼、薄煎饼、饼干、薄饼、曲奇饼、派 皮、薄脆饼干、馒头、披萨以及类似物。
[0190] 通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
[0191]材料与方法
[0192] 解脂活性（LU)
[0193] 脂解活性（脂肪酶活性）可用三丁精作为底物进行测定。该方法是基于酶对三丁 精的水解作用，并以在水解期间保持pH恒定的碱消耗量作为时间的函数。
[0194] -个脂肪酶单位（LU)定义为标准条件下（即，在30°C;pH 7. 0 ;以0. 1% w/v阿拉 伯胶（Gum Arabic)为乳化剂及0. 16M三丁酸甘油酯作为底物），每分钟释放1微摩尔可滴 定的丁酸的酶量。一个KLU是1000LU。
[0195] 磷脂酶A活性（LEU)
[0196]在LEU测定中，磷脂酶A活性是从在pH 8. 0,40°C下水解卵磷脂的能力中所确定 的。水解反应可以继之以用NaOH滴定持续2分钟的反应时间。在W0 1998/26057中所披 露的来自尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum)(LIPOPAN F)的磷脂酶具有1540LEU/mg酶蛋 白的活性并且可以被用作标准。
[0197]平板测定
[0198] A)缓冲液是100mM HEPES和100mM柠檬酸盐的混合物，具有从pH 3. 0至pH 7. 0 所调节的pH。
[0199] B)2%琼脂糖（Litex HSA1000)是通过以下制备：在缓冲液（A)中混合并且蒸煮5 分钟，随后冷却至大约60 °C。
[0200] C)底物是L_ a磷脂酰胆碱，95 %来自在60 °C下用Ultra Turrax分散于水 (MilliQ)中持续1分钟的大豆（Avanti441601)。
[0201]D)将LECITASEULTRA的经过纯化的酶溶液和SEQIDN0:2的成熟磷脂酶稀释至 0? 4mg/ml〇
[0202] 通过将5ml底物（C)和5ml琼脂糖（B)的混合物轻轻地混入具有7cm直径的培 养皿中进行铸制板，并且在由真空穿孔具有大约3_直径的孔洞之前将其冷却至室温。在 板由封口膜密封之前将十个微升稀释的酶（D)添加至每个孔中，并且置于培养箱中在55°C 下，持续48小时。将板定期取出摄影。
[0203] N-末端测序程序
[0204] 使用应用生物系统公司（Applied Biosystems) Procise?蛋白质序列测定系统进 行N-末端测序分析。将样品在Novex?预浇铸4% -20% SDS聚丙烯酰胺凝胶（生命科 技公司（Life Technologies))上进行纯化。根据制造商的说明，运行该凝胶，并且印记至 ProBlott.? PVDF膜上（应用生物系统公司（Applied Biosystems))。针对N-末端氨基酸 测序，将主蛋白带切出并且置于Procise_?蛋白质序列测定系统的印迹盒中。根据制造商的 说明，针对PVDF膜样品（脉冲液体PVDF)使用方法运行文件进行N-末端测序。可以通过 将色谱图中的峰的保留时间与标准色谱图中的PTH氨基酸的保留时间进行比较，从对应于 氨基酸残基1至7的7张色谱图中推断N-末端氨基酸序列。
[0205]酶
[0206] 酶制剂包括本发明的磷脂酶的经过纯化的酶蛋白（TL PLA)，该酶蛋白是SEQ ID NO:2的成熟多肽，例如SEQ ID NO:2的氨基酸20至296或28至296。
[0207] 一种可从诺维信公司（Novozymes)获得的商业制剂LECITASE ULTRA。LECITASE ULTRA包括一种蛋白质工程化的微生物多肽，该多肽具有甘油三酯脂肪酶和磷脂酶A二者 活性。该多肽具有SEQ ID N0:5中所示的氨基酸序列。
[0208] 实例1酶的表征
[0209]使用一台VP-毛细管差示扫描量热仪（微量热公司（MicroCal Inc.)，皮斯卡塔 韦，新泽西州，美国）通过差示扫描热量测定（DSC)测定本发明的磷脂酶的热稳定性。在 200K/hr的恒定的程序化加热速率下，加热在缓冲液（50mM乙酸钠在pH 4. 0或pH 5. 0下） 中的酶溶液（大约〇. 5mg/ml)后获得的热分析图（Cp对T)中，将热变性温度Td(°C )获取 为变性峰（主要的吸热峰）的顶端。
[0210] 将样品溶液和参考溶液（大约〇? 2ml)从10°C下的储存条件装载到量热仪中（参 考：不具有酶的缓冲液），并且在20°C下热预平衡20分钟，随后从20°C至100°C进行DSC扫 描。按照82°C在pH 4.0下和按照81°C在pH 5.0下，以大约+/-1°C的精确度测定变性温 度。
[0211] 当在米曲霉（Aspergillus oryzae)中表达时，使用以上所描述的程序，SEQ ID NO: 2的多肽被识别为具有如下N-末端序列：
[0212] 35kDa带，具有对应于SEQ ID N0:2的残基28-34的N-末端DVSSSVL
[0213] 25kDa带，具有对应于 SEQIDN0:2的残基117-123的N-末端 EADLDFP
[0214] 25kDa 带，具有对应于 SEQID N0:2 的残基 120-126 的 N-末端 LDFPLTD
[0215] 基于以上所描述的平板鉴定，本发明的磷脂酶在3和5之间的如下pH范围内显示 出了活性。针对于比较，LecitaseUltra在pH3和4下显示出了较弱的活性（参见图3)。
[0216] 实例2:脱胶
[0217] 由于应用于商业酶法脱胶中的磷脂酶的热稳定性，该过程通常在不超过55°C的温 度下进行。然而，本发明的磷脂酶是非常热稳定的，这允许脱胶过程在较高温度下进行。在 本实例中，使用本发明的磷脂酶或现有技术磷脂酶LECITASEULTRA，在70°C的温度下，将大 豆油进行脱胶。
[0218] 将该油起初用正磷酸（85%溶液）进行处理，以将不溶性盐转化为更能水合的形 式并且获得了适用于酶的pH。将该酸以基于油量的0.05% (100%纯正磷酸）的相等的量 来使用。
[0219]
[0220] $通过从该油中萃取水溶酸，随后进行水相的pH的测量来测定油中的pH。为了改 善pH测量的稳定性，通过添加1%w/wKC1来增加水相的离子强度。
[0221] 将LECITASEULTRA以业内建议的量30mg配制的酶产品/kg油=30ppm进行给 予，并且本发明的磷脂酶以等于34mg酶产品/kg油=34ppm，67mg酶产品/kg油=67ppm， 224mg酶产品/kg油=224ppm和537mg酶产品/kg油=537ppm的量进行给予。
[0222] 将在500ml蓝色盖子摇瓶中的250g粗大豆油的等分试样在具有以200rpm的磁 力搅拌的水浴中加热至70°C。向每个摇瓶中施用87微升的85%的磷酸溶液，并且通过 Ultra-Turrax将该混合物在12.OOOrpm下高剪切混合lOsec。此后将该混合物在70°C下并 且在200rpm下孵育15min。将酶溶液和MilliQ-水施加至7. 5ml的总加水量（3%的油）。 通过Ultra-Turrax将该混合物在12.OOOrpm下高剪切混合lOsec，并且在200rpm下，伴随 着搅拌在70°C下孵育2小时。在酶反应后，通过微波将产物混合物加热至100°C以上以使 酶失活并且促进胶分离。通过以2000g离心5min实现油和湿胶的分离。
[0223] 在已脱胶油中的游离脂肪酸（FFA)的产率通过滴定来量化。通过ICP-0ES测定已 脱胶油中的磷的含量。结果示于下表中。
[0224]
[0225] 当相比于Lecitase Ultra时，在pH~4下，在70°C下，用本发明的磷脂酶获得了 最大FFA产率增加和最大磷含量降低。
[0226] 实例3通过磷脂降低所测量的磷脂酶水解
[0227] 在低水环境中，在50°C和在70°C下，并且在pH4.0和5. 5下，针对于水解磷脂磷 脂酸（PA)、磷脂酰乙醇胺（PE)、磷脂酰肌醇（PI)、和磷脂酰胆碱（PC)的能力，测定本发明的 磷脂酶和LECITASE ULTRA的磷脂酶。测试底物从大豆油中生产，该大豆油被掺入磷脂PA、 PE、PI和PC。底物包括50mg磷脂/lmL油。在热摇床中，在所希望的温度（50°C和70°C ) 下，将250微升的样品用本发明的磷脂酶进行孵育2h。将磷脂酶作为10微升的水溶液进行 施用，该水溶液包括与l〇〇mg/kg油相等的量的经过纯化的酶蛋白。除了酶反应，空白反应 也进行孵育，其中，该酶溶液用水的添加来代替。
[0228] 通过31P NMR分析样品。基于NMR分析的原理为在将磷脂转化为溶血磷脂之后磷 脂的31P化学移位发生了改变。然后通过整合将未转化的磷脂进行量化。数据以残余磷脂 相对于空白反应的％呈现。 「0??91
[0230] 两种酶对磷脂PA、PE、PI和PC都具有良好的活性。用本发明的磷脂酶实现最大磷 含量降低，该磷脂酶在50°C并且在pH 5.5下，将磷含量降低至检出限以下。在70°C和pH 4. 0下，本发明的磷脂酶相对于LECITASE ULTRA显示出了令人惊讶的高活性。
【主权项】
1. 一种具有磷脂酶A活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组 成： (a) -种多肽，该多肽与SEQ ID N0:2的成熟多肽或SEQ ID N0:3的多肽具有至少80% 的序列一致性； (b) -种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下与（i) SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列、或（ii) (i)的全长互补体杂交； (c) 一种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO: 1的成熟多肽编 码序列或与其cDNA序列具有至少65 %序列一致性； (d) SEQ ID NO: 2的成熟多肽的或SEQ ID NO: 3的多肽的一种变体，该变体在在一个或 多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；和 (e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的一个片段，该片段具有磷脂酶A活性。2. 如权利要求1所述的多肽，其中该成熟多肽对应于SEQ ID NO:2的氨基酸28至296 或氨基酸117至296。3. 如权利要求1或2所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽或SEQ ID NO:3 的多肽具有至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至 少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一致性。4. 如权利要求1至3中任一项所述的多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与 SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列或与其cDNA序列具有至少85%、至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或 100 %序列一致性。5. 如权利要求1-4中任一项所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的 成熟多肽、或SEQ ID NO:2的氨基酸28至296、或SEQ ID NO:2的氨基酸117至296或SEQ ID N0:3的多肽，或者由其组成。6. -种分离的多核苷酸，包括： (a) -种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中所述多肽 包括SEQ ID NO: 2的成熟多肽或SEQ ID NO: 2的氨基酸28至296,或SEQ ID NO: 2的氨基 酸117至296或SEQ ID NO:3的多肽； (b) -种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中所述多肽 包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID N0:2的成熟多肽或与SEQ ID N0:3的多肽 具有至少80 %的一致性； (c) 一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中该核苷酸 序列包括SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列； (d) -种核苷酸序列，该核苷酸序列与根据（a)、（b)、或（c)的核苷酸序列具有至少 80 %的序列一致性； (e) -种核苷酸序列，该核苷酸序列在高严格条件下与根据（a)、（b)、（c)、或（d)的核 苷酸序列的互补链杂交； (f) 根据（a)、（b)、（c)、（d)、或（e)的核苷酸序列的子序列，具有至少100个核苷酸； (g) -种序列，该序列由于遗传密码简并性而简并为一种根据在（a)、（b)、（c)、（d)、 (e)、或（f)中任一项所定义的序列；或 (h)根据（a)、（b)、（c)、（d)、（e)、（f)或（g)的核苷酸序列的互补链。7. -种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求6所述的多 核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控 制序列。8. -种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求6所述的多核苷酸，该多核苷 酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。9. 一种产生如权利要求1-5中任一项所述的多肽的方法，该方法包括： (a) 在有益于产生该多肽的条件下，培养一种细胞，该细胞在处于其野生型形式下产生 该多肽；并且 (b) 回收该多肽。10. -种产生具有磷脂酶A活性的多肽的方法，该方法包括： (a) 在有益于产生该多肽的条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞；并且 (b) 回收该多肽。11. 一种组合物，包括， a) 如权利要求1-5中任一项所述的多肽或通过如权利要求9或10中任一项所述的方 法可获得的一种多肽；和， b) 可任选地一种另外的酶。12. 如权利要求11所述的组合物，其中该另外的酶是一种选自下组的酶，该组由以下 各项组成：磷脂酶AU磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、和磷脂酶C。13. 如权利要求1-5中任一项所述的多肽或如权利要求11或12中任一项所述的组合 物在水解磷脂过程中的用途。14. 如权利要求1-5中任一项所述的多肽或如权利要求11或12中任一项所述的组合 物在生产烘焙组合物或烘焙添加剂中或在生产面团或来自面团的烘焙产品中的用途。15. 如权利要求1-5中任一项所述的多肽或如权利要求11或12中任一项所述的组合 物在降低食用油磷脂含量过程中的用途。16. -种方法，该方法使用磷脂酶处理来降低食用油中的含磷组分的含量，该方法包括 将所述油与如权利要求1-5中任一项所述的多肽的水溶液接触，直至该油的磷含量降低， 并且然后将水相与该处理过的油分开。17. 根据权利要求16所述的方法，其中该油选自粗油、经过水脱胶的油和经过酸脱胶 的油。18. 根据权利要求16或17所述的方法，其中该油的温度在60°C和75°C之间。19. 根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中该磷脂酶处理是在3. 0至5. 5之 间的PH下进行的。
【专利摘要】本发明涉及具有磷脂酶A活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。
【IPC分类】A21D8/04, C12N9/18, C12P7/64
【公开号】CN105073985
【申请号】CN201480017114
【发明人】K·博克, S·兰德维克, M·L·达姆斯特里普, J·布拉斯克
【申请人】诺维信公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年3月21日
【公告号】WO2014147219A1