，弃去含药培养液，每孔加入200 μ L的10%的三氯乙酸，静置5min，移入4°C冰箱静置I小时以上，取出用去离子水洗5遍，空气中干燥过夜或30 0C烘箱中干燥5小时，待完全干燥后，每孔加入I %醋酸配制的0.4% SRB 100 4 1^，室温染色301^11，倒掉染色液，用I %乙酸洗去未结合的染料，空气中干燥，用ρΗΙΟ.5的1mM的Tris碱液200 μ L溶解，振荡30min，在酶标仪上测定在540nm处的吸光度值。
[0118]结果如图14所示，细胞毒性强弱为游离DOX > DOX脂质体> DOX-SS-DOX纳米粒。这与摄取结果相反，可能是由于二硫键的断裂较慢引起的。DOX-SS-DOX纳米粒需要在还原环境下断开二硫键释放出游离阿霉素才能发挥作用，而二硫键的断裂是还原依赖性过程的也是时间依赖性过程，即还原度增加断裂程度越大，细胞毒性越明显，时间越长，断裂程度越大，细胞毒性越明显。在孵育时间内，二硫键的断裂并不完全，因此其细胞毒性作用没有预期的那么明显。
[0119]实施例6、还原响应型纳米粒的体外细胞毒性的还原响应性
[0120]采用SRB (磺基罗丹明B)法考察纳米粒的细胞毒活性。将对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔约5000个细胞，设6个复孔，置于二氧化碳培养箱中，在37°C、5% CO2的条件下孵育24h，待细胞贴壁生长。吸弃原培养液，加入1mM GSH-OEt孵育2h。吸去GSH-OEt，PBS洗。用含血清的培养液稀释配制系列浓度的DOX、DOX脂质体和DOX-SS-DOX纳米粒溶液(0.25,1,2.5、5 μ g/mL,给药浓度以DOX计)。将稀释好的药物溶液分别加入到上述细胞培养孔中，另设六个空白参比孔作为对照。将细胞培养板置于37°C的二氧化碳培养箱孵育48h。孵育结束后，弃去含药培养液，每孔加入200 yL的10%的三氯乙酸，静置5min，移入4°C冰箱静置I小时以上，取出用去离子水洗5遍，空气中干燥过夜或30°C烘箱中干燥5小时，待完全干燥后，每孔加入I %醋酸配制的0.4% SRB 100 μ L，室温染色30min，倒掉染色液，用I %乙酸洗去未结合的染料，空气中干燥，用ρΗΙΟ.5的1mM的Tris碱液200 μ L溶解，振荡30min，在酶标仪上测定在540nm处的吸光度值。
[0121]结果见图15，提前孵育GSH-OEt增加细胞内的还原度后，DOX-SS-DOX纳米粒的细胞毒性显著增加，而对DOX脂质体的细胞毒性没有显著作用。这个结果说明，DOX-SS-DOX纳米粒的毒性比DOX脂质体的毒性小，确实是由于二硫键断裂不完全引起的，增加还原度加快二硫键的断裂，会增加纳米粒的细胞毒性。
[0122]实施例7、抗肿瘤活性实验
[0123]选用MCF-7细胞，在雌性nu/nu裸鼠的右侧腋下进行接种，每只鼠接种16个细胞，接种7天后给药。给药组为4组:PBS，DOX, DOX脂质体，DOX-SS-DOX纳米粒或PFV-SS-DOX纳米粒，每组5只。药物溶液中DOX含量均为0.2mg/mL，共给药4次，每次200 μ L，给药间隔时间为I天，每隔一天测裸鼠体重和瘤体积。于给药后第12天处死，取瘤组织，称重，拍照。
[0124]如图16所示，DOX-SS-DOX纳米粒产生的抗肿瘤效果远远高于同剂量下的游离DOX和DOX脂质体，并且其毒性与游离DOX和DOX脂质体相比也较低。体内药效结果与体外细胞毒结果相反，这可能是由于体内的细胞内还原程度较高，能够快速将摄取到细胞内部的纳米粒中的二硫键断开，释放出药物，发挥药效。
[0125]另外，本发明还将DOX-SS-DOX纳米粒和PFV-SS-DOX纳米粒，与PEG-SS-DOX纳米粒进行抗肿瘤活性的比较，结果显示，本发明的药物在抗肿瘤活性方面效果更好。
[0126]实施例8、冻干剂的制备(以DOX-SS-DOX纳米粒为例)
[0127]将药物偶联物溶解于DMSO中，配成一定浓度的有机相溶液，取适量分散于水相溶液中，探头超声得到粒径均一的纳米粒溶液。向纳米粒溶液中加入10 %海藻糖，冷冻干燥的冻干剂。冻干剂用蒸馏水复溶，并用动态光散射测定其粒度及分布。结果如图17。
【主权项】
1.一种药物偶联物，其特征在于，由药物与药物或药物与多肽之间通过含有二硫键的连接键偶联得到，该药物偶联物的通式如下: 药物-连接键-药物或多肽。
2.如权利要求1所述的药物偶联物，其特征在于，所述药物为含羟基或氨基结构基团的抗肿瘤药物； 所述连接键为含二硫键的小分子连接臂， 所述多肽为细胞穿膜肽，且序列中含半胱氨酸，平均分子量为800?5000道尔顿。
3.如权利要求1所述的药物偶联物，其特征在于，所述药物选自:紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素。
4.如权利要求1所述的药物偶联物，其特征在于，所述多肽为细胞穿膜肽，且序列中含有游尚疏基。
5.如权利要求1所述的药物偶联物，其特征在于，所述药物偶联物选自:阿霉素-连接键-阿霉素、或多肽-连接键-阿霉素。
6.如权利要求1所述的药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述药物-药物偶联物的制备，包括以下步骤: 在有机胺催化剂的存在下，在二甲基甲酰胺中，氮气保护下，将药物与含二硫键的交联剂3，3’ - 二硫代二丙酸-二(N-羟基丁二酰亚胺酯)进行酯化或酰化反应，经乙醚沉淀处理后得到药物-药物偶联物。
7.如权利要求1所述的药物偶联物的制备方法，其特征在于，所述药物-多肽偶联物的制备，包括以下步骤: (1)按1:1.5?1:3的摩尔比例，剧烈搅拌下将硫醇酸逐滴加入二硫二吡啶的乙醇/醋酸溶液中，反应2?3h，经中性三氧化二铝柱分离处理后得到含二硫键的吡啶酸； (2)HBTU活化含二硫键的吡啶酸中的羧基后，按1:1?1: 1.2的摩尔比例，氮气保护下将含氨基的抗肿瘤药物阿霉素逐滴加入上述反应溶液中，反应5?7h，经硅胶柱分离得到含有二硫键的药物衍生物； (3)在氮气保护下，将药物衍生物与含巯基的多肽按2:1的摩尔比进行二硫键交换反应，经透析，冻干处理后得到药物-多肽偶联物。
8.一种药物偶联物形成的纳米粒，其特征在于，以权利要求1所述的药物偶联物作为载体制成纳米粒。
9.如权利要求8所述的纳米粒，其特征在于，纳米粒的制备方法如下: 将药物偶联物溶解于DMSO中，配成有机相溶液，取适量分散于水相溶液中，探头超声得到粒径均一的纳米粒溶液，其粒径在80?200nm。
10.以权利要求1所述药物偶联物或者权利要求8所述的纳米粒作为药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种还原响应型药物偶联物纳米粒的制备及其应用，该药物偶联物包括药物-药物偶联物和药物-多肽偶联物，采用还原响应型二硫键将抗肿瘤药物与药物分子或多肽进行偶联并作为载体材料制成纳米粒，本发明制备的纳米粒粒径在100nm左右。本发明的目的在于将原本没有部位选择性的小分子游离药物作为载体或载体的一部分制备成具有一定粒径的纳米粒。该纳米粒载药量高，并利用被动靶向的原理使药物蓄积在肿瘤部位、利用还原敏感的二硫键在细胞内特异性降解的特点，保证药物完全释放，发挥药效。
【IPC分类】A61K31-337, A61K31-704, A61P35-00, A61K47-48, A61K9-14
【公开号】CN104667292
【申请号】CN201510053565
【发明人】王学清, 宋钦, 张强, 张华 , 代文兵
【申请人】北京大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月2日